CN116445499B - 一种DsABCG6基因及其编码的蛋白质、重组表达载体、方法和应用 - Google Patents

一种DsABCG6基因及其编码的蛋白质、重组表达载体、方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种DsABCG6基因及其编码的蛋白质、重组表达载体、方法和应用，属于基因工程技术领域。所述DsABCG6基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。本发明通过超量表达DsABCG6基因提高植物抗盐和耐旱性，可以更好地将该基因应用于作物的抗盐和耐旱遗传改良中。

Description

一种DsABCG6基因及其编码的蛋白质、重组表达载体、方法和 应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种DsABCG6基因及其编码的蛋白质、重组表达载体、方法和应用。
背景技术
盐胁迫和干旱胁迫作为两个相互独立又相互关联的非生物胁迫，严重影响着植物生长发育和农作物产量，是限制农业发展的主要环境因子。因此，克隆抗盐和耐旱关键调控基因，开展植物抗盐和耐旱胁迫的分子机制研究，培育抗盐和耐旱作物具有重要的现实和战略意义。植物为适应环境胁迫，进化出多种策略来整合外源胁迫信号和内源发育信号，从而优化生长和胁迫反应之间的平衡。植物激素除了在正常条件下控制植物的生长发育外，还介导包括盐、干旱胁迫在内的各种环境胁迫反应，是调节植物生长发育和胁迫响应的关键内源因子。脱落酸(Abscisic acid，ABA)作为典型的“逆境激素”，是调节植物生长发育和适应环境胁迫的重要中枢因子，在正常环境中，以ABAH质子化形式存在，可以自由扩散进入细胞。当植物受到环境胁迫后，质外体环境发生碱化，ABAH解离成ABA-离子化形式，而ABA-由于较低的膜渗透性，不能自由进出细胞，这种离子陷阱机制将ABA限制在细胞内，阻碍了ABA在质外体与细胞间的运输，因此ABA在植物体内的精准分布需要特异性转运蛋白的参与。
近年来，大多数植物激素都被鉴定为多种转运体。目前发现ABA的主动转运依赖于ATP结合盒转运体(ABCG)、NRT1/PTR转运体(NPF)、MATE/DTX转运体(DTX50)和AWPM-19转运体四类转运体，其中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette，ABC)是目前发现的生物体内最古老、数量最多、分布最广的超蛋白家族之一，ABCG亚家族作为8个亚家族中的最大分支，不仅转运底物多样，而且几乎参与了植物生长发育各阶段的物质运输。目前ABCG转运蛋白的多个家族成员，如：ABCG17、ABCG18、ABCG20、ABCG25、ABCG31、ABCG40已被报道参与ABA在细胞中的转运。但针对家族成员ABCG6介导ABA转运并参与调控植物抗盐和耐旱应答的分子机制尚不清楚。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种DsABCG6基因及其编码的蛋白质、重组表达载体、方法和应用，本发明通过超量表达DsABCG6基因提高植物抗盐和耐旱性，可以更好地将该基因应用于作物的抗盐和耐旱遗传改良中。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种DsABCG6基因，所述DsABCG6基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了过表达上述技术方案所述的DsABCG6基因在提高植物抗盐中的应用。
本发明还提供了过表达上述技术方案所述的DsABCG6基因在提高植物耐旱性中的应用。
本发明提供了一种上述技术方案所述的DsABCG6基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种重组表达载体，将上述技术方案所述的DsABCG6基因插入到pCAMBIA1300基础载体中得到。
优选的，所述DsABCG6基因的编码序列位于基础载体的SacI和BamHI酶切位点之间。
本发明提供了一种抗盐和/或耐旱性植物的获取方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述的重组表达载体转化到农杆菌中，得到转化农杆菌；
2)将所述步骤1)得到的转化农杆菌采用花序浸蘸法浸染植物，得到抗盐和/或耐旱性植物。
优选的，所述步骤1)农杆菌包括农杆菌LBA4404。
优选的，所述步骤2)植物包括拟南芥。
优选的，所述步骤1)转化的方法包括：冰上静置5min，放入液氮5min，42℃金属浴5min，冰上静置5min。
本发明的有益效果为：
本发明选用尖叶石竹为实验材料，采用转录组高通量测序的方法，获得尖叶石竹抗性相关基因DsABCG6的核苷酸序列，利用分子克隆技术获得基因，通过构建DsABCG6基因与pCAMBIA1300基础载体的重组载体，利用农杆菌花序浸蘸法浸染拟南芥，使该基因导入拟南芥模式植物中并在模式植物中过表达，再通过对转基因植株进行表型分析，了解DsABCG6基因功能，结果表明DsABCG6可以用于植物耐盐耐旱性状的改良。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为正常条件下野生型拟南芥和转基因植株表型图；
图2为盐胁迫下野生型拟南芥和转基因植株表型图；
图3为干旱胁迫下野生型拟南芥和转基因植株表型图。
具体实施方式
本发明提供了一种DsABCG6基因，所述DsABCG6基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：
ATGTCGTCCCGTGTGATTGATGATAGTTCTAATTCATCGTCACCCAATTTATTACCTTACTTTGGGTCCAATTATCACACCTTAGATATTGAATCGACTAATATTCGCGGTAGTGCGTCGTTCTCACCCACTCTTGGCGAAATGCTGAAGCGGGTGGGGGATGTCGGGAGGGACGACACGCACCACACTGTTGAAATGAGGCCTGAGCCACGCGCGCTGCCTTTTGTCCTACGGTTTTCGAACCTTACCTACAATGTGAAAATGCCTAGGAAGTGTACTTTTTCGGGGATGTTTTCTCGACGACCAACTGATGAGGAACAATTTTCTGGTAGAAGGGGTGTGTTCTCGAGGACGAAGACGCTCCTTAATGACATCTCTGGGGAGGCCCGTGATGGGGAGATTATGGCGGTTCTCGGAGCTAGTGGGTCCGGGAAATCAACCTTGATTGATGCCCTTGCGAATAGAATTGCGAAGGGAAGTTTGAAGGGTCGAGTGACATTGAATGGCGAACCACTCGAGTCGAGGCTACTCAAAGTCATCTCGGCGTATGTCATGCAAGATGACTTGTTGTTTCCGATGTTAACAGTCGAGGAGACGCTTATGTTTGCTGCGGAATTTCGGTTGCCTCGTACGCTTTCCAAGTCTAAGAAAGCGGCACGAGTACAGCAGCTGATTGAGATGTTGGGTCTTCGCAATGCTGCGAAGACCATCATTGGTGACGAGGGTCACCGGGGTGTTTCGGGTGGGGAACGTCGACGAGTGTCAATTGGGATCGACATTGTCCACGATCCCATTATTTTGTTCCTCGACGAGCCGACTTCAGGGTTGGACTCCACTAGTGCTTTTATGGTTGTGAAGGTGTTGCAAAGGATTGCACAAAGTGGGAGCAATGTTGTTGTGTCTATACACCAACCTAGCTACCGAATTATGGGATTATTGGACCGACTTATATTTTTGTCCAGAGGGCAAACCGTGTTTAGTGGTTCGCCCTCGGACTTGCCGAGTTATTTTAACGAGTTTGGAACCCCAATGCCTGAAAATGAGAACAAGACGGAGTTCGCCCTGGACCTCATCAGGGAACTTGAGAGTTCCCCGGGTGGGACCAGGGCGTTAGTCGAGTTTCACAAAGGGTGGCAAGTGAAGAAGAAAAGTGCACAACCTTCAATTGAAGGTGCGCCCCTAGATAGTAGGGGTGGACTTTCACTAAAGGAGGCGATTAGCGCTAGTATCTCTAGAGGCAAATTAGTCTCTGGAGCAACTAACGCTGATGCCTCCCCTGCTTCTATGGTCCCCACCTTTGCCAACCCTATTTGGACTGAAATTTCGACCTTGTCAAAGAGGTCCTTCATGAACGCACGTCGGGTGCCAGAGCAATTTGGCATCCGAATGGGCGCAGTCCTCGTGACGGGATTCATCCTTGCCACCATGTATTGGCAACTCGACAATTCCCCTAAGGGGGTCCAAGAGCGTCTAGGCTTCTTCGCCTTTGCCATGTCCACAACCTTCTACACATGCGCAGACGCCCTCCCCGTCTTTCTCCAAGAACGATACATCTTCATGCGAGAGACAGCCTACAACGCATACCGCCGGTCTTCCTACGTCCTTTCCCACGTCCTCACCGGCCTTCCCGCCCTGATCCTCCTCTCCTTCGCCTTTGCGGCCACCACTTTCTTTGCAGTCGGCCTAGACGGGGGCGCACAAGGCTTCTTCTTCTACTTCGCCATGATCTTCGCCTCCTTTTGGGCCGGAAACTCCTTCGTCTCCTTCCTGTCCGGTGTCGTCCCCCACGTCATGCTGGGGTACGTAATTGTCGTAGCAATCCTTGCCTACTTTTTACTATTCTCCGGATTCTTCATAAGCCGTGATCGAATCCCCAACTATTGGATCTGGTTTCACTACATTTCGCTCGTAAAGTACCCTTACGAAGGCGTCCTACAAAACGAATTCAGCAACCCCACCAAGTGCTTTGTTCGCGGTGTACAAATCTTCGACAACACCCCACTTGGCGCGGTCTCAAACTCGTTGAAAGTGAACCTCTTGAACACAATAAGCGGGTCACTAGGGATGACGATTACACCCTCAACATGCGTGACCACCGGGGCCGACATACTTCAACAACAAGGCATCACTGACATGAGCAAGTGGGGTTGCTTGTGGGTCACGGTTGCTTGGGGTTTCTTCTTTAGGACACTCTTTTACTTCTCCTTGTTACTTGGTAGTAAAAACAAGAGGAGGTAA。
本发明还提供了过表达上述技术方案所述的DsABCG6基因在提高植物抗盐中的应用。
本发明还提供了过表达上述技术方案所述的DsABCG6基因在提高植物耐旱性中的应用。
在本发明中，所述植物优选包括拟南芥。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的DsABCG6基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
MSSRVIDDSSNSSSPNLLPYFGSNYHTLDIESTNIRGSASFSPTLGEMLKRVGDVGRDDTHHTVEMRPEPRALPFVLRFSNLTYNVKMPRKCTFSGMFSRRPTDEEQFSGRRGVFSRTKTLLNDISGEARDGEIMAVLGASGSGKSTLIDALANRIAKGSLKGRVTLNGEPLESRLLKVISAYVMQDDLLFPMLTVEETLMFAAEFRLPRTLSKSKKAARVQQLIEMLGLRNAAKTIIGDEGHRGVSGGERRRVSIGIDIVHDPIILFLDEPTSGLDSTSAFMVVKVLQRIAQSGSNVVVSIHQPSYRIMGLLDRLIFLSRGQTVFSGSPSDLPSYFNEFGTPMPENENKTEFALDLIRELESSPGGTRALVEFHKGWQVKKKSAQPSIEGAPLDSRGGLSLKEAISASISRGKLVSGATNADASPASMVPTFANPIWTEISTLSKRSFMNARRVPEQFGIRMGAVLVTGFILATMYWQLDNSPKGVQERLGFFAFAMSTTFYTCADALPVFLQERYIFMRETAYNAYRRSSYVLSHVLTGLPALILLSFAFAATTFFAVGLDGGAQGFFFYFAMIFASFWAGNSFVSFLSGVVPHVMLGYVIVVAILAYFLLFSGFFISRDRIPNYWIWFHYISLVKYPYEGVLQNEFSNPTKCFVRGVQIFDNTPLGAVSNSLKVNLLNTISGSLGMTITPSTCVTTGADILQQQGITDMSKWGCLWVTVAWGFFFRTLFYFSLLLGSKNKRR。
本发明还提供了一种重组表达载体，将上述技术方案所述的DsABCG6基因插入到pCAMBIA1300基础载体中得到。本发明对所述的pCAMBIA1300基础载体的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。在本发明中，所述DsABCG6基因的编码序列优选位于基础载体的SacI和BamHI酶切位点之间。本发明对所述双酶切和T4连接酶使用的体系和方法没有特殊限定，本领域技术人员依据常规即可。
本发明还提供了一种抗盐和/或耐旱性植物的获取方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述的重组表达载体转化到农杆菌中，得到转化农杆菌；
2)将所述步骤1)得到的转化农杆菌采用花序浸蘸法浸染植物，得到抗盐和/或耐旱性植物。
本发明将上述技术方案所述的重组载体转化到农杆菌中，得到转化农杆菌。在本发明中，所述农杆菌优选包括农杆菌LBA4404。在本发明中，所述转化的方法优选包括：冰上静置5min，放入液氮5min，42℃金属浴5min，冰上静置5min。本发明对所述重组载体转化到农杆菌的其它条件没有特殊限定，本领域技术人员依据常规即可。
本发明将得到的转化农杆菌采用花序浸蘸法浸染植物，得到抗盐和/或耐旱性植物。在本发明中，所述植物优选包括拟南芥。本发明对所述花序浸蘸法没有特殊限定，本领域技术人员按照常规操作即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
尖叶石竹DsABCG6转运蛋白编码基因的获得与表达载体的构建
1.1尖叶石竹幼苗总RNA的提取
采用Trizol法提取RNA
(1)将收取的尖叶石竹幼苗转移至液氮预冷的研钵(高温高压灭菌)中，加入少量液氮后迅速研磨多次，直至研磨充分后转移至去RNase的2ml离心管中，随后加入1mlTrizol，震荡混匀；
(2)为使上述混合物充分裂解，将其在室温中静置5min；
(3)向上述混合物中加入200μl氯仿溶液，轻微震荡混匀15s后室温静置3min；
(4)低温离心(4℃，12000rpm，15min)后，混合物分相，小心吸取无色上清溶液至新的去RNase离心管中；
(5)加入与吸取的上清液等体积的异丙醇溶液，充分混匀混合物，冰上静置10min；
(6)低温离心(4℃，12000rpm，10min)后，管底或管壁出现白色沉淀，弃上清，加入1ml DEPC水配置的75％乙醇，将沉淀弹起洗涤沉淀，低温离心(4℃，12000rpm，5min)；
(7)重复步骤6，彻底洗涤沉淀；
(8)弃上清，冰上静置至沉淀充分干燥；
(9)用50-100μl DEPC水溶解沉淀，检测其浓度和纯度后-80℃保存RNA样品。
1.2cDNA第一条链的合成(Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMixfor qPCR)
(1)去除残留基因组DNA(冰上配置)：
表1反应体系
RNase free ddH2O To 15μL
5×gDNA digester Mix 3μl
模板RNA Total RNA:10pg-5μg
在RNase free离心管中配制上述混合液，用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。
(2)逆转录反应体系配制(20μl体系，冰上配置)：
在第(1)步的反应管中直接加入4×ⅢSuperMixplus，使用移液器轻轻混匀。
表2 反应体系
(3)缓慢混匀，25℃水浴5min；
(4)55℃水浴15min；
(5)85℃水浴5min，冰上放置后-20℃，或分装后，于-80℃长期保存。
1.3克隆引物设计
利用primer premier 5.0设计基因克隆所需引物，由擎科生物公司合成，详见表3。
表3 基因克隆引物
引物名称 序列(5’-3’)
DsABCG6-F(SEQ ID No.3) ATGTCGTCCCGTGTGATTGATG
DsABCG6-R(SEQ ID No.4) CCTCCTCTTGTTTTTACTACCAAGT
1.4目的基因扩增
以尖叶石竹cDNA为模板，用基因的特异性引物(见表3)对cDNA进行PCR反应。扩增程序为：94℃预变性2min，一个循环；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸2min 15s，30个循环；72℃延伸10min，一个循环。基因扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察目的基因条的带大小是否正确。
表4 PCR反应体系
反应液 体积(μl)
10×ExTaq buffer 5
DsABCG6-F(10M) 1
DsABCG6-R(10M) 1
dNTP 3
ExTaq 0.25
ddH2O 38.75
模板cDNA 1
Total 50
1.5胶回收
采用康为世纪生物科技有限公司普通琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒回收目的条带，具体实验方法参考说明书。
1.6PCR产物与T载体的连接和转化大肠杆菌
(1)PCR产物与T载体连接
使用TaKaRa的pMD19-T vector Cloning Kit，将回收的PCR产物与PMD19-T载体进行连接，反应体系如下：
表5 DsABCG6基因与pMD19-T载体连接反应体系
反应液 体积(μl)
回收的PCR产物 4
pMD19-T vector 1
solution I 5
Total 10
16℃恒温水浴锅中过夜连接(12-16h)
(2)转化大肠杆菌
1)将制备好的100μl的大肠杆菌(DH5α)感受态细胞在冰上融化；
2)向融化的感受态细胞中加入10μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30min；
3)42℃恒温水浴锅中热激1min，迅速冰浴2min，以使细胞冷却，此间动作轻柔，不要晃动，避免感受态细胞破裂；
4)向离心管中加入400μl的LB液体培养基(37℃预热2min)，随后在37℃，200rpm的恒温摇床中振荡培养1h；
5)转化后的大肠杆菌菌液均匀涂布在LB筛选固体培养基(50mg/ml Amp)上；
6)菌液在LB筛选固体培养基上完全被吸收后，于37℃恒温培养箱中倒置过夜培养(12-16h)。
(3)摇菌，菌液鉴定
挑取大小适中的单菌株于5ml LB液体培养基(50mg/ml Amp)中，37℃，200rpm恒温摇床中振荡培养12h。取1μl的菌液样品进行菌液PCR鉴定，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测获得的目的基因条带是否正确。
表6 菌液鉴定PCR反应体系
(4)菌种保存及序列测定
200μl菌液与200μl 50％甘油(高压高温灭菌)混合后于-80℃长期保存。将已鉴定正确的含有DsABCG6基因的大肠杆菌菌液送至哈尔滨擎科生物公司测定其序列，拼接测序结果，分析得到DsABCG6基因(SEQ ID No.1)的正确序列。
1.7试剂盒法质粒提取
使用TIANGEN质粒提取试剂盒提取培养好的菌液质粒，实验方法参考说明书。
1.8添加酶切位点引物设计
利用引物设计软件primerpremier 5.0设计带有酶切位点的基因引物，由北京擎科生物公司合成，引物详见表7。
表7 添加酶切位点引物
引物名称 序列(5’-3’)
DsABCG6(S)-F(SEQ ID No.5) GAGCTCATGTCGTCCCGTGTGATTG
DsABCG6(B)-R(SEQ ID No.6) CGGATCCCCTCCTCTTGTTTTTACTACC
利用加入酶切位点的引物对目的基因进行PCR添加酶切位点。PCR反应体系、反应参数设置同1.4。将条带大小正确的片段进行胶回收方法同1.5，将胶回收产物与pMD19-T载体相连，并转化大肠杆菌感受态，培养方法和菌液鉴定同1.6，同时，将大肠杆菌pCAMBIA1300表达载体接种到培养基中培养，培养方法同1.6，然后分别提取质粒，质粒提取方法同1.7。
1.9双酶切产物及胶回收
将DsABCG6的PCR产物和提取的pCAMBIA1300载体质粒分别进行双酶切，酶切体系如表8所示，配制重组质粒的双酶切反应体系后，在37℃恒温水浴锅中孵育1h，使用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对双酶切产物进行检测，反应体系如下(双酶切鉴定体系采用20μl体系，回收带有酶切位点粘性末端的DsABCG6双酶切体系采用50μl体系)，胶回收参照1.5。
表8 SacI、BamHI的双酶切反应体系
1.10重组质粒的连接
配制连接反应体系后，16℃恒温水浴锅中过夜连接(12-16h)，转化大肠杆菌感受态，选取阳性菌株鉴定同1.6。
表9 连接反应体系
反应液 体积(μl)
Buffet T4 1
T4连接酶 1
线性化的pCAMBIA1300载体片段 5
线性化的DsABCG6基因片段 3
Total 10
1.11重组子的序列测定和分析
-80℃保存鉴定后的阳性克隆菌株，并将已鉴定正确的含有DsABCG6基因的大肠杆菌菌液送至哈尔滨擎科生物公司测定其序列，拼接测序结果，分析得到DsABCG6基因的正确序列，并利用相关生物学软件和网站(Bioedit、MEGA、NCBI网站和跨膜结构域预测网站等)DsABCG6基因的氨基酸序列信息进行解析。质粒提取同1.7。
实施例2
尖叶石竹DsABCG6转运蛋白功能分析
2.1转化农杆菌感受态细胞
(1)-80℃保存的农杆菌LBA4404感受态细胞于冰上融化；
(2)每100μl农杆菌LBA4404感受态细胞中分别加入10μl的DsABCG6与pCAMBIA1300的重组表达质粒；
(3)加入重组质粒的农杆菌感受态细胞轻轻混匀后，在冰上静置5min，放入液氮5min，42℃金属浴5min，放置冰上5min；
(4)向转化后的感受态细胞中加入0.4ml YEP液体培养基，28℃恒温摇床以180rpm转速培养3-4h，随后将其涂于YEP固体培养基(50μg/ml Kana和50μg/ml Rif)上，于28℃培养箱中倒置培养两天，期间观察菌落生长情况直至形成单菌落，进行阳性菌落PCR鉴定，鉴定菌液于5ml YEP液体培养(50μg/ml Kana和50μg/ml Rif)中，28℃恒温培养箱震荡培养一天，取200μl菌液存于200μl甘油中进行保存。
2.2农杆菌花序浸蘸法浸染拟南芥
(1)取上述带有重组载体的农杆菌菌液1ml放在200ml YEP液体培养(50μg/mlKana和50μg/ml Rif)中，恒温摇床震荡培养(28℃，200rpm)，两天培养至OD600为1-2；
(2)农杆菌菌液在5000rpm下离心15min，用提前灭菌的1/2MS重悬菌体，转移至250ml 1/2MS(液)中，调整OD600最终约为0.8；
(3)每250ml的1/2MS(液)加入2.5μl 6-BA(1.0g/l)，0.25μlAs(100mM)，50μlSilwet-77，搅拌混匀；
(4)在浸染的前一天将拟南芥浇足水，只留下未开放的花序，将植株倒置浸泡在菌液中，浸染10-15min后，放置暗培养24h后，转移至12h光照/12h黑暗的光照条件下培养。
2.3转基因拟南芥阳性植株的筛选
待浸染的拟南芥种子(T0)成熟后在无菌操作台中用酒精(75％)消毒30s，NaClO消毒3min，经5次用无菌水清洗后，将种子铺在含抗生素Hyg(40μg/ml)的1/2MS培养基上，待4℃春化处理48h后，将种子放置于恒温培养箱(22℃，12光照/12黑暗)中培养10天左右观察，选取长成4叶色嫩绿，根系较健壮的正常生长植株，移植到蛭石中驯化2-3天后，将拟南芥移到装有草炭土：蛭石＝2：1的种植钵中，于植物培养室(22℃，12h光照/12h黑暗)中继续培养，保证水分充足、光照条件正常，且注意防治病害和虫害。
2.4转基因拟南芥DNA水平检测
用植物直扩试剂盒(2×T5 DirectPCRKit)对在含有Hyg平板上筛选出来的绿色植株进行鉴定，取1-2mm的植物叶片放入离心管并加入30μl裂解液BufferA，95℃加热10min后加入BufferB，瞬时离心后取2μl为模板，进行PCR扩增验证，并检测目的基因条带大小是否正确。
表10PCR反应体系
2.5转基因拟南芥RNA水平检测
选取生长健壮的拟南芥叶片，每处理取三次重复，采样后加入离心管中并加入三粒钢珠，放入液氮速冻，用震荡研磨仪研磨5次，将植物材料磨成吸粉末状。植物总RNA的提取和反转录方法参照1.1和1.2。
2.6转基因植株耐盐性鉴定
挑选转基因种子中表达量较高的三个株系用于后续实验，将野生型拟南芥和收获的T2代转基因拟南芥种子，经消毒后，铺于1/2MS、1/2MS+100mM NaCl、1/2MS+125mM NaCl、1/2MS+150mM NaCl的培养基中，野生型和转基因的三个株系各6粒种子，4℃春化2天后，移至恒温培养箱(22℃，12光照/12黑暗)中正常培养，重复实验三次，观察表型情况，统计植株根长、鲜重生理指标，结果见表11、表12。结合表型观察，发现转基因植株的耐盐性明显强于野生型对照植株，盐胁迫处理后，野生型植株表现为根系变短等症状，而转基因植株生长根系相对健壮(图2)。
表11野生型拟南芥(WT)和三个过表达DsABCG6转基因拟南芥株系(OE-1,OE-2,OE-3)植株盐胁迫处理后的根长情况(Root Length,cm)
WT OE-1 OE-2 OE-3
NaCl 0mM 7.72±0.36 7.62±0.34 7.52±0.22 7.55±0.19
NaCl 100mM 3.53±0.07 4.03±0.21 3.96±0.16 3.94±0.25
NaCl 125mM 2.69±0.25 2.89±0.28 2.97±0.24 2.75±0.36
NaCl 150mM 1.52±0.11 2.38±0.20 1.64±0.09 1.71±0.21
表12野生型拟南芥(WT)和三个过表达DsABCG6转基因拟南芥株系(OE-1,OE-2,OE-3)植株盐胁迫处理后的鲜重情况(Freshweight,g)
WT OE-1 OE-2 OE-3
NaCl 0mM 0.0050±0.0008 0.0060±0.0006 0.0064±0.0009 0.0051±0.0006
NaCl 100mM 0.0045±0.0003 0.0056±0.0006 0.0044±0.0003 0.0032±0.0002
NaCl 125mM 0.0033±0.0002 0.0036±0.0004 0.0036±0.0005 0.0037±0.0002
NaCl 150mM 0.0005±0.0001 0.0008±0.0003 0.0005±0.0000 0.0007±0.0001
2.7转基因植株耐旱性鉴定
将野生型拟南芥和收获的T2代转基因拟南芥种子，经消毒后，铺于1/2MS、1/2MS+175mM Mannitol、1/2MS+200mM Mannitol、1/2MS+225mM Mannitol的培养基中，野生型和转基因的三个株系各6粒种子，4℃春化2天后，移至恒温培养箱(22℃，12光照/12黑暗)中正常培养，重复实验三次，观察表型情况，统计植株根长、鲜重生理指标，结果见表13、表14。结合表型观察，发现转基因植株的耐旱性明显强于野生型对照植株，干旱胁迫处理后，野生型植株表现为根系变短等症状，而转基因植株生长根系相对健壮(图3)。
表13野生型拟南芥(WT)和三个过表达DsABCG6转基因拟南芥株系(OE-1,OE-2,OE-3)植株干旱胁迫处理后的根长情况(Root Length,cm)
WT OE-1 OE-2 OE-3
Mannitol 0mM 7.72±0.36 7.62±0.34 7.52±0.22 7.55±0.19
Mannitol 175mM 1.84±0.24 2.08±0.13 2.27±0.18 1.82±0.09
Mannitol 200mM 1.60±0.14 2.05±0.19 1.79±0.06 1.68±0.08
Mannitol 225mM 1.44±0.10 1.54±0.27 1.73±0.20 0.99±0.29
表14野生型拟南芥(WT)和三个过表达DsABCG6转基因拟南芥株系(OE-1,OE-2,OE-3)植株干旱胁迫处理后的鲜重情况(Freshweight,g)
WT OE-1 OE-2 OE-3
Mannitol 0mM 0.0050±0.0008 0.0060±0.0006 0.0064±0.0009 0.0051±0.0006
Mannitol 175mM 0.0040±0.0007 0.0037±0.0005 0.0041±0.0004 0.0043±0.0012
Mannitol 200mM 0.0038±0.0003 0.0036±0.0005 0.0030±0.0002 0.0025±0.0002
Mannitol 225mM 0.0020±0.0003 0.0022±0.0006 0.0024±0.0001 0.0020±0.0006
由以上实施例可以得出，耐盐耐旱性试验表明：DsABCG6可以用于植物耐盐耐旱性状的改良。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种DsABCG6基因，其特征在于，所述DsABCG6基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.过表达权利要求1所述的DsABCG6基因在提高拟南芥抗盐中的应用。
3.过表达权利要求1所述的DsABCG6基因在提高拟南芥耐旱性中的应用。
4.一种权利要求1所述的DsABCG6基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DsABCG6基因插入到pCAMBIA1300基础载体中得到。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述DsABCG6基因的编码序列位于基础载体的SacI和BamHI酶切位点之间。
7.一种抗盐和/或耐旱性拟南芥的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将权利要求5或6所述的重组表达载体转化到农杆菌中，得到转化农杆菌；
2)将所述步骤1)得到的转化农杆菌采用花序浸蘸法浸染拟南芥，得到抗盐和/或耐旱性拟南芥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述农杆菌包括农杆菌LBA4404。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转化的方法包括：冰上静置5min，放入液氮5min，42℃金属浴5min，冰上静置5min。
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