CN110903364A

CN110903364A - CsHSFA1d蛋白及其编码基因在调控植物耐冷性中的应用

Info

Publication number: CN110903364A
Application number: CN201911102357.XA
Authority: CN
Inventors: 张娜; 齐传东; 李亚飞; 郭仰东; 董丹慧; 郭禄芹; 李兴盛
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110903364B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及CsHSFA1d蛋白及其编码基因在调控植物耐冷性中的应用。本发明发现CsHSFA1d蛋白具有调控植物耐冷性的功能，提高植物中CsHSFA1d蛋白的表达量，植物的耐冷性显著提高，在低温条件下的生长性能明显提高，且细胞膜损伤和膜脂过氧化显著降低；而降低植物中CsHSFA1d蛋白的表达量，植物的耐冷性则显著下降。本发明发现的CsHSFA1d的新功能具有较好的应用潜力，为培育耐冷植物提供了基因资源和新思路。

Description

CsHSFA1d蛋白及其编码基因在调控植物耐冷性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及CsHSFA1d蛋白及其编码基因在调控植物耐冷性中的应用。

背景技术

低温胁迫是决定作物产量和品质的重要因素，在很多地区冷害是限制农业生产的主要因素之一。黄瓜是重要的设施蔬菜之一,也是典型的喜温、冷敏感植物。在早春和秋冬季节，低温是产量和质量的重要限制因素。因此，黄瓜耐冷性的提高成为周年供应的一个关键环节。通过育种和栽培的综合手段克服黄瓜生产中的低温障碍是解决这个问题的主要手段，也是设施黄瓜的研究热点。

低温限制着植物的正常生长，它会造成植物细胞成分和组织结构的变化，也会影响到植株的新陈代谢，严重时会使植物萎蔫或死亡。植物可以通过改变生理生化和分子水平等不同的机制来调节植株的耐低温能力，包括维持细胞膜稳定性、捕获活性氧、合成抗氧化剂、合成可溶性蛋白、合成脯氨酸、诱导应激反应的激酶以及增强分子伴侣的转录和信号转移等。解析植物的耐冷机制、发现新的耐冷性相关基因对于耐冷育种和栽培具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供CsHSFA1d蛋白及其编码基因在调控植物耐冷性中的应用。

本发明通过对低温处理后黄瓜转录组学进行分析，发现黄瓜CsHSFA1d蛋白(序列如SEQ ID NO.1所示)与植物的耐冷性相关，通过提高植物中CsHSFA1d蛋白的表达量，植物的耐冷性显著提高，而降低植物中CsHSFA1d蛋白的表达量，其耐冷性则显著下降。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在调控植物耐冷性中的应用。

第二方面，本发明提供CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在调控植物在低温条件下的生长或产量中的应用。

第三方面，本发明提供CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在调控植物在低温条件下的细胞膜损伤或膜脂过氧化中的应用。

所述细胞膜损伤具体可体现在相对电导率的变化。所述膜脂过氧化具体可体现在丙二醛的含量变化。

第四方面，本发明提供CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在调控植物在低温条件下的脯氨酸含量中的应用。

第五方面，本发明提供CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在植物耐冷性遗传育种中的应用。

所述植物耐冷性遗传育种可为利用基因工程技术手段将所述CsHSFA1d蛋白的编码基因或含有所述CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料导入所述植物中，构建转基因植物；或者为利用上述基因工程技术手段构建的转基因植物与其它植物进行杂交育种。

具体地，上述应用中，通过提高所述植物中CsHSFA1d蛋白的表达量，提高植物的耐冷性、在低温条件下的产量或脯氨酸含量，或者降低细胞膜损伤或膜脂过氧化。

本发明中，所述CsHSFA1d蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)在CsHSFA1d蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

(4)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

上述如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为黄瓜CsHSFA1d蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据黄瓜CsHSFA1d蛋白的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与黄瓜CsHSFA1d蛋白具有相同功能的CsHSFA1d蛋白的突变体。

上述在N端和/或C端连接标签中，所述标签包括但不限于Flag标签、HA标签、His标签、Myc标签等。其中，CsHSFA1d蛋白与flag标签连接得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

本发明中，所述CsHSFA1d蛋白的编码基因的CDS序列具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸或其互补序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

上述如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为黄瓜中CsHSFA1d蛋白的CDS序列。考虑到密码子的简并性，所有编码所述CsHSFA1d蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

本发明中，所述生物材料包括表达盒、载体、宿主细胞、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官、转基因植株、所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物或所述组织培养物产生的原生质体。

第六方面，本发明提供一种调控植物耐冷性的方法，包括：调控所述植物中CsHSFA1d蛋白的表达量；所述CsHSFA1d蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(3)在CsHSFA1d蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

优选地，所述调控植物耐冷性的方法中，通过在所述植物中过表达所述CsHSFA1d蛋白的编码基因，提高所述植物的耐冷性。

上述过表达CsHSFA1d蛋白的编码基因可通过本领域常规技术手段实现，例如：在所述植物中导入携带CsHSFA1d蛋白的编码基因的表达载体。

所述携带CsHSFA1d蛋白的编码基因的表达载体可为携带CsHSFA1d蛋白的编码基因的pCAMBIA1305载体。

第七方面，本发明还提供用于抑制植物中CsHSFA1d蛋白表达的干扰RNA；所述干扰RNA的正义片段序列如SEQ ID NO.4所示，反义片段序列如SEQ ID NO.5所示。

将上述干扰RNA构建至表达载体后导入植物中，可高效抑制CsHSFA1d蛋白的表达，进而降低植物的耐冷性。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物包括但不限于黄瓜、拟南芥，水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、花生等。

本发明的有益效果在于：

本发明发现CsHSFA1d蛋白具有调控植物耐冷性的功能，提高植物中CsHSFA1d蛋白的表达量，植物的耐冷性显著提高，而降低植物中CsHSFA1d蛋白的表达量，植物的耐冷性则显著下降。本发明通过实验证明，在黄瓜中过表达CsHSFA1d构建的转基因植株在低温条件下的生长表型明显优于野生型黄瓜植株；且转CsHSFA1d植株的相对电导率、丙二醛含量显著下降(即细胞膜损伤和膜脂过氧化明显降低)，脯氨酸含量显著提高。本发明发现的CsHSFA1d的新功能具有较高的应用价值，为培育耐冷植物提供了基因资源和新思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中CsHSFA1d基因全长克隆电泳检测图；其中，M为DL2000 DNAMarker；1和2为基因CsHSFA1d。

图2为本发明实施例1中CsHSFA1d基因RNAi片段克隆电泳检测图；其中，M为DL2000DNA Marker；1和2为分别为RNAi载体的正义片段和反义片段。

图3为本发明实施例2中CsHSFA1d过表达植株转基因株系PCR验证电泳图；其中，OE1-17为不同的CsHSFA1d过表达转基因株系，WT为野生型，+为阳性对照，M为DL2000 DNAMarker。

图4为本发明实施例2中CsHSFA1d过表达株系qRT-PCR验证表达量；其中，WT为野生型，OE-3、OE-5、OE-9、OE-12、OE-13为不同的过表达株系。

图5为本发明实施例2中CsHSFA1d基因的RNAi干扰转基因株系PCR验证电泳图；其中，R1-12为CsHSFA1d的RNAi干扰株系，WT为野生型，+为阳性对照，M为DL2000 DNA Marker。

图6为本发明实施例2中CsHSFA1d的RNAi干扰株系qRT-PCR验证表达量；其中，WT为野生型，RNAi-2、RNAi-6、RNAi-7、RNAi-12为不同的RNAi干扰株系。

图7为本发明实施例2中野生型黄瓜及CsHSFA1d过表达植株和RNAi干扰植株的耐冷表型分析；其中，CK为正常生长条件下生长的黄瓜幼苗；4℃12h为4℃低温处理12小时后的黄瓜幼苗；WT为野生型，OE-5、OE-9为不同的过表达株系，RNAi-2、RNAi-12为不同的RNAi干扰株系。

图8为本发明实施例2中野生型黄瓜及CsHSFA1d过表达植株和RNAi植株低温胁迫前后相关生理指标测定；其中，A为相对电导率；B为丙二醛含量；C为脯氨酸含量；CK为正常生长条件下生长的黄瓜幼苗；4℃12h为4℃低温处理12小时后的黄瓜幼苗；WT为野生型，OE-5、OE-9为不同的过表达株系，RNAi-2、RNAi-12为不同的RNAi干扰株系。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 CsHSFA1d基因的克隆

1、实验材料的获得

实验材料黄瓜津研4号，购买于北京市农林科学院蔬菜中心，苗期种植于中国农业大学园艺学院光照培养箱。光照培养箱培养条件为26℃/16℃，12h/12h，光照密度为10000LUX。黄瓜幼苗生长到第3片叶展开，取成熟叶片，迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。

2、RNA的提取

采用华越洋公司试剂盒(货号：0416-50)提取黄瓜叶片总RNA。

3、cDNA的获得

以提取的总RNA为模板，利用Takara公司的反转录试剂盒(货号：RR047A)将其反转录成cDNA。反应程序为37℃30min，65℃5s。将反转录产物cDNA溶液稀释到100ng/μl作为反应模板。

4、目的基因的扩增

以步骤3获得的cDNA为模板，采用引物1305-CsHSFA1d-S和1305-CsHSFA1d-A进行PCR，得到PCR产物为CsHSFA1d基因的全长。引物序列如下：

1305-CsHSFA1d-S:gagctcggtacccggggatccATGGACGGGACTGCTAATGG；

1305-CsHSFA1d-A:caggtcgactctagaggatccAACCCTTTTAATTTCTGAAG。

以步骤3获得的cDNA为模板，采用引物CsHSFA1d-RNAi-1 S、CsHSFA1d-RNAi-1 A进行PCR扩增，得到PCR产物为RNAi载体的正义片段。采用引物CsHSFA1d-RNAi-2 S、CsHSFA1d-RNAi-2 A进行PCR扩增，得到PCR产物为RNAi载体的反义片段。引物序列如下：

CsHSFA1d-RNAi-1 S:cgcgcccaatcgatgatttaaatATGGTACAGCGTCTACAGGG

CsHSFA1d-RNAi-1 A:catgttcatctggggatttaaatGAAGAGTCACGCCTGATACA

CsHSFA1d-RNAi-2 S:tcctcagcttaattaactagtGAAGAGTCACGCCTGATACA

CsHSFA1d-RNAi-2 A:agcaggactctagggactagtATGGTACAGCGTCTACAGGG

PCR反应体系如表1所示。

表1 目的基因CsHSFA1d开放阅读框全长序列扩增体系

PCR反应程序如表2所示。

表2 PCR反应程序

Step1	预变性	95℃,5min
			Step2	变性	95℃,30s
Step3	退火	58℃,30s
			Step4	延伸	72℃,90s
Step5	延伸	72℃,10min

注：从Step 2到Step 4进行35次循环扩增

5、PCR产物的检测

反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果，CsHSFA1d基因的扩增产物的电泳检测结果如图1所示，RNAi的正义和反义片段的扩增产物的电泳检测结果如图2所示。对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收，并将胶回收产物进行测序。

实施例2 CsHSFA1d基因在调控黄瓜耐冷性中的应用

1、CsHSFA1d过表达载体和RNAi干扰载体的构建

为了鉴定CsHSFA1d基因在抗冷胁迫中的功能，将实施例1获得的CsHSFA1d基因开放阅读框序列克隆入过表达载体pCAMBIA1305中，构建CsHSFA1d基因的过表达载体。将实施例1获得的CsHSFA1d基因的RNAi正义片段及反义片段克隆入RNAi干扰载体PFGC1008中。将构建好的CsHSFA1d基因过表达载体及RNAi干扰载体分别转化感受态农杆菌GV3101(购自上海唯地生物公司，货号：AC1001)，并转化黄瓜品种津研4号，具体步骤如下：

(1)载体酶切：用限制性内切酶BamH I对pCAMBIA1305载体进行酶切；用限制性内切酶Spe I和Swa I对PFGC1008载体进行酶切。酶切体系如表3所示，酶切反应条件为37℃，酶切12h，酶切完成后80℃失活20min。

表3 酶切体系

组分	体积
		载体	1μg
酶	1μl
		缓冲液Buffer	2μl
ddH<sub>2</sub>O	至20μl
		Total	20μl

(2)载体连接及转化大肠杆菌：将酶切后的载体和分别与实施例1获得的CsHSFA1d基因片段和RNAi片段用重组酶ExnaseⅡ(购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号C112-01)融合构建过表达载体并转化大肠杆菌感受态DH5α。连接体系如表4所示。

表4 载体连接体系

组分	体积
		切好的载体	4μl
凝胶回收片段	(0.04×基因碱基数)/回收浓度μl
		5×CEII Buffer	4μl
ExnaseⅡ	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	至20μl
Total	20μl

(3)菌液PCR鉴定：待长出菌斑后挑取单克隆至含有卡那霉素和(或)利福平抗生素的LB液体培养基中，培养6-8小时(180-200rpm)后进行PCR验证。

2、重组载体转化农杆菌GV3101

(1)质粒提取：将上述1中PCR验证后确认有目的条带的菌液进行测序，与载体引物设计序列比对确认无误后进行质粒提取，得到含有CsHSFA1d基因的pCAMBIA1305过表达载体和含有CsHSFA1d基因的RANi干扰片段的RNAi干扰载体PFGC1008。具体步骤按照天根生物技术(北京)有限公司质粒微型试剂盒(货号DP106)说明进行。

(2)农杆菌感受态转化：冰上融化-80℃冰箱保存的农杆菌感受态GV3101，将上述步骤(1)中提取的重组过表达载体和RNAi干扰载体分别转化至农杆菌感受态GV3101，具体步骤按照华越洋农杆菌感受态转化说明书进行。待培养基上长出菌斑后，挑取单克隆于700μl至YEB抗性培养基中，在28℃振荡培养6-8h(180-200rpm)，并进行菌液PCR验证，将阳性菌液用60％甘油保存备用。

3、农杆菌侵染黄瓜获得转基因植株

将生长2-3天的黄瓜种子，切去生长点和下胚轴，留取子叶下半部分用事先准备好的重组农杆菌菌液侵染黄瓜子叶。侵染结束后，将子叶接种于分化培养基上并暗处培养2天。随后，将其转入抗性分化培养基上进行培养。待再生黄瓜根系发育好后，及时将再生黄瓜苗移入营养土。

4、转基因植株的PCR鉴定

(1)转基因植株DNA的提取：DNA提取详细步骤参考艾德莱DNA提取试剂盒(货号：DN38)说明书。

(2)鉴定转基因植株引物设计：根据载体片段序列及目的基因片段设计鉴定引物。鉴定引物如下：

CsHSFA1d-OE S:TGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTC

CsHSFA1d-OE A:AACCCTTTTAATTTCTGAAG

CsHSFA1d-RNAi S:GCACAATCCCACTATCCTTCG

CsHSFA1d-RNAi A:TCACGCGCTATCAGCTCTTTA

(3)PCR验证：方法参考实施例2步骤1中的PCR验证，CsHSFA1d基因过表达转基因植株的验证结果如图3所示，CsHSFA1d基因的RNAi转基因植株的验证结果如图5所示。

5、转基因株系中CsHSFA1d表达水平的qRT-PCR鉴定

(1)转基因植株RNA的提取和反转录合成cDNA：RNA提取的具体步骤按照华越洋提取试剂盒中的说明进行。根据Takara反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。

(2)qRT-PCR：反应体系如表5所示，反应程序如表6所示。

qRT-PCR引物如下：

CsHSFA1d-QPCR S:TCAACACTTATGGATTCAGG；

CsHSFA1d-QPCR A:AAACTTACCAACTTCCACAC。

表5 qRT-PCR反应体系

组分	体积
		SYBR Premix Ex Taq	5μL
正向引物	0.5μL
		反向引物	0.5μL
cDNA模板(稀释10倍)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	3μL
Totaal	10μL

表6 qRT-PCR反应程序

Step1	预变性	95℃,5min
			Step2	变性	95℃,10s
Step3	退火	60℃,20s
			Step4	延伸	72℃,20s

注：从Step2到Step4进行40次循环扩增

CsHSFA1d基因过表达转基因植株的qRT-PCR鉴定结果如图4所示，过表达转基因株系OE-5和OE-9中CsHSFA1d基因相对表达量与野生型相比上升2.72倍和2.92倍；CsHSFA1d基因的RNAi转基因植株的qRT-PCR鉴定结果如图6所示，RNAi干扰株系RNAi-2和RNAi-12中CsHSFA1d基因相对表达量为野生型的0.52倍和0.49倍。

6、转基因株系黄瓜幼苗在低温胁迫下的生长情况观察与耐冷性评价

对野生型黄瓜幼苗以及CsHSFA1d基因过表达转基因株系黄瓜幼苗和RNAi转基因株系黄瓜幼苗在4℃进行12h的低温处理，观察处理前后不同株系黄瓜幼苗表型，进而分析不同株系黄瓜幼苗对于低温胁迫的耐受性是否存在差异。结果如图7所示，CsHSFA1d基因过表达转基因株系与野生型相比在低温处理后萎蔫程度较轻，表明对于低温胁迫的耐受性增强；RNAi干扰株系在低温处理后萎蔫更加严重，表现为对于低温胁迫更加敏感。

7、转基因株系低温胁迫后相关生理指标的测定

(1)相对电导率：

鲜样先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗2次，将叶片剪碎取0.5g，装入小药瓶中，加入4ml蒸馏水，抽气3次，每次20min，第一次抽气后取出摇动，室温保持3～4h，多次摇动，测电导率S₁，封口沸水浴10min，冷却，平衡10min后测电导率S₂，同时测定蒸馏水S₀。

计算公式：相对电导率(％)＝100*(S₁－S₀)/(S₂－S₀)

(2)丙二醛(MDA)含量：

于10ml管中取2ml植物样品提取液(参比对照用缓冲液代替)，加入2ml 0.5％的硫代巴比妥酸(TBA),混合均匀后沸水浴10min左右(时间不宜过长，充分显色即可)。冰上冷却，10000r离心10min，取上清于450、532、600nm波长处比色(多波长测试)。

计算公式：MDA含量(μmol/L)＝6.45(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56A₄₅₀；

MDA含量(μmol/g)＝(μmol/L)*V*S/Vs)/W；

式中，V为反应体系总体积；Vs为测定时提取液量；S为提取液总量；W为材料质量。

(3)脯氨酸含量：

标准曲线的绘制：(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，定容，得浓度为100μg·ml^-1的脯氨酸标准液。(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2,3,4,5及6μg·ml^-1。(3)取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液(将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L磷酸中，搅拌加热(70℃)溶解，贮于冰箱中)，每管在沸水浴中加热30min。(4)冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(y)依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg·2ml^-1)。

样品的测定：(1)脯氨酸的提取：称取各处理的待测黄瓜叶片各0.5g，分别置试管中，然后向各管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液；(2)吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色；(3)冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min；(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，记录A₅₂₀，根据回归方程计算出2ml样品液中脯氨酸的含量，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。

计算公式：脯氨酸含量(μg/g)＝(X×V/A)/(W×10⁶)

式中X：标准方程求得脯氨酸含量(μg)；A：吸取样品液体积(ml)；V：提取液量(ml)；W：样品质量(g)。

相对电导率、丙二醛(MDA)含量和脯氨酸含量的检测结果如图8所示。相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量等生理检测结果表明，黄瓜CsHSFA1d基因过表达株系表现出对于低温胁迫具有更强的耐受性，RNA干扰株系表现出对于低温胁迫更加敏感，耐冷性减弱。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> CsHSFA1d蛋白及其编码基因在调控植物耐冷性中的应用

<130> KHP191115759.9

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Gly Thr Ala Asn Gly Cys Asp Ser Gly Leu Ala Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Asn Ser His Pro Thr Val Pro Ala Pro Ile Thr Asn Ser Ser Ala

20 25 30

Pro Pro Pro Phe Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Met Val Asp Asp Pro Ala

35 40 45

Thr Asp Ala Val Val Ser Trp Ser Pro Thr Asn Asn Ser Phe Val Val

50 55 60

Trp Asn Pro Pro Glu Phe Ala Arg Asp Leu Leu Pro Lys Tyr Phe Lys

65 70 75 80

His Asn Asn Phe Ser Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Thr Tyr Gly Phe

85 90 95

Arg Lys Val Asp Pro Asp Arg Trp Glu Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu

100 105 110

Arg Gly Gln Lys His Leu Leu Lys Ser Ile Thr Arg Arg Lys Pro Val

115 120 125

His Gly Gln Ser Gln Gln Gln Pro Gln Gln Ser His Gly Gln Ser Ser

130 135 140

Ser Val Gly Ala Cys Val Glu Val Gly Lys Phe Gly Leu Glu Glu Glu

145 150 155 160

Val Glu Arg Leu Lys Arg Asp Lys Asn Val Leu Met Gln Glu Leu Val

165 170 175

Arg Leu Arg Gln Gln Gln Gln Thr Thr Asp Asn Gln Leu Gln Thr Met

180 185 190

Val Gln Arg Leu Gln Gly Met Glu Gln Arg Gln Gln Gln Met Met Ser

195 200 205

Phe Leu Ala Lys Ala Val Gln Ser Pro Gly Phe Leu Ala Gln Phe Val

210 215 220

Gln Gln Gln Asn Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ser Glu Ala Asn Lys Lys

225 230 235 240

Arg Arg Leu Lys Gln Asp Gly Ile Ala Glu Ser Asp His Ser Pro Val

245 250 255

Pro Asp Gly Gln Ile Val Lys Tyr Gln Pro Leu Met Asn Glu Ala Ala

260 265 270

Lys Thr Met Leu Arg Gln Ile Met Lys Val Asp Thr Ser His Leu Glu

275 280 285

Pro Ser Asn His Asn Thr Asp Asn Phe Leu Ile Arg Asp Gly Leu Gln

290 295 300

Ser Gln Cys Ala Ala Met Asp Asn Gly Asn Ser Ser Ser Ser Val Ser

305 310 315 320

Gly Val Thr Leu Gln Glu Val Pro Pro Thr Ser Ser Phe Asn Ser Val

325 330 335

Ala Ser Gly Val Pro His Gly Pro Ser Thr Thr Lys Ser Glu Ile Gln

340 345 350

Ser Ser Pro Gln Ala Thr Asn Ser Asp Asn Ile Ser Ala Ser Pro Phe

355 360 365

Ala Leu Asn Ala Val Arg Gly Pro Gly Ala Arg Glu Ala Ser Ser Leu

370 375 380

Ser Val Ser Glu Thr Asp Val Ile Met Pro Glu Leu Ser His Leu Ser

385 390 395 400

Glu Met Val Ser Glu Asn Ile Leu Asp Val Pro Glu Val Asp Tyr Arg

405 410 415

Val Pro Glu Ala Gly Asn Gly Ala Phe Ile Ser Pro Asn Phe Leu Asp

420 425 430

Ala Asn Gly Thr Ile Pro Ile Asp Ile Asp Asn Met Ser Pro Asp Ala

435 440 445

Asp Ile Asp Ala Leu Leu Asp Asn Ser Asn Phe Trp Asp Asp Leu Leu

450 455 460

Val Gln Ser Pro Cys Gln Asp Asp Glu Val Asp Phe Leu Val Gly Gly

465 470 475 480

Gly Leu Pro Lys Thr Asn Asp Met Gln Leu Ala Glu Asn Ala Trp Asp

485 490 495

Lys Ser Lys His Val Asp Lys Leu Thr Glu Gln Met Gly Leu Leu Thr

500 505 510

Ser Glu Ile Lys Arg Val

515

<210> 2

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggacggga ctgctaatgg ctgtgattct ggattggctt ccgggagtgg aaactctcat 60

ccgacggttc cggctcctat tactaattct agcgcgcctc caccgtttct gagtaagaca 120

tatgatatgg tggatgaccc ggctaccgat gcggttgtgt cctggagccc taccaataat 180

agttttgtgg tttggaatcc gcctgagttc gctagggatc ttttgcccaa atacttcaag 240

cataataact tctccagttt cgtcaggcag ctcaacactt atggattcag gaaagttgat 300

ccagaccgtt gggaatttgc taacgaaggc ttcttaagag gtcagaaaca tctgcttaag 360

agtattaccc ggcgaaaacc tgtccatggg caaagtcagc aacaaccaca gcagtctcac 420

ggacaaagtt cctcagttgg agcttgtgtg gaagttggta agtttggttt ggaggaagag 480

gttgagaggc ttaaaagaga caaaaatgta ctcatgcagg aacttgtgag actgaggcag 540

cagcaacaga ctactgacaa ccagctgcaa actatggtac agcgtctaca ggggatggag 600

cagcgacaac agcagatgat gtcattcctt gccaaggctg tgcagagccc tggctttttg 660

gctcagtttg tgcagcagca aaatgaaagt actagacgca taagtgaggc taataaaaag 720

cgaaggctaa agcaggatgg aattgccgag tctgatcatt ctcctgttcc agatgggcaa 780

attgtgaagt atcaacctct catgaatgag gcagcaaaaa caatgctgag gcagataatg 840

aaagtggata cttcacattt ggaaccatcg aaccacaata ccgacaattt tctaattcgt 900

gatggtttgc aatcgcagtg tgcagcaatg gacaatggga actcttccag ttctgtatca 960

ggcgtgactc ttcaagaggt acctccaacc tcatctttta attcagttgc ttctggtgtt 1020

cctcatggcc cctcaacaac caaatcagaa atccaatcgt cacctcaagc tacaaattct 1080

gacaacattt cagcttctcc ctttgctctt aacgccgtgc ggggtccagg ggcacgagaa 1140

gcttcttcct tatcagtttc tgagacagat gtaataatgc ctgagctttc ccatttatct 1200

gaaatggtgt ctgagaacat tcttgatgtt cctgaagtgg attatagggt gcctgaggca 1260

ggaaatggtg catttataag tccgaatttt ttggatgcca acggaactat tcctatagat 1320

attgataaca tgtcccctga tgctgacatc gatgccttgc tagataattc caacttttgg 1380

gatgatttgc ttgtgcaaag tccatgtcag gatgatgagg ttgattttct ggttggagga 1440

gggttaccaa agacaaacga tatgcaactg gcagaaaatg catgggacaa atctaaacat 1500

gtggataaac ttacagaaca gatgggcctt ctcacttcag aaattaaaag ggtttga 1557

<210> 3

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Gly Thr Ala Asn Gly Cys Asp Ser Gly Leu Ala Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Asn Ser His Pro Thr Val Pro Ala Pro Ile Thr Asn Ser Ser Ala

20 25 30

Pro Pro Pro Phe Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Met Val Asp Asp Pro Ala

35 40 45

Thr Asp Ala Val Val Ser Trp Ser Pro Thr Asn Asn Ser Phe Val Val

50 55 60

Trp Asn Pro Pro Glu Phe Ala Arg Asp Leu Leu Pro Lys Tyr Phe Lys

65 70 75 80

His Asn Asn Phe Ser Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Thr Tyr Gly Phe

85 90 95

Arg Lys Val Asp Pro Asp Arg Trp Glu Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu

100 105 110

Arg Gly Gln Lys His Leu Leu Lys Ser Ile Thr Arg Arg Lys Pro Val

115 120 125

His Gly Gln Ser Gln Gln Gln Pro Gln Gln Ser His Gly Gln Ser Ser

130 135 140

Ser Val Gly Ala Cys Val Glu Val Gly Lys Phe Gly Leu Glu Glu Glu

145 150 155 160

Val Glu Arg Leu Lys Arg Asp Lys Asn Val Leu Met Gln Glu Leu Val

165 170 175

Arg Leu Arg Gln Gln Gln Gln Thr Thr Asp Asn Gln Leu Gln Thr Met

180 185 190

Val Gln Arg Leu Gln Gly Met Glu Gln Arg Gln Gln Gln Met Met Ser

195 200 205

Phe Leu Ala Lys Ala Val Gln Ser Pro Gly Phe Leu Ala Gln Phe Val

210 215 220

Gln Gln Gln Asn Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ser Glu Ala Asn Lys Lys

225 230 235 240

Arg Arg Leu Lys Gln Asp Gly Ile Ala Glu Ser Asp His Ser Pro Val

245 250 255

Pro Asp Gly Gln Ile Val Lys Tyr Gln Pro Leu Met Asn Glu Ala Ala

260 265 270

Lys Thr Met Leu Arg Gln Ile Met Lys Val Asp Thr Ser His Leu Glu

275 280 285

Pro Ser Asn His Asn Thr Asp Asn Phe Leu Ile Arg Asp Gly Leu Gln

290 295 300

Ser Gln Cys Ala Ala Met Asp Asn Gly Asn Ser Ser Ser Ser Val Ser

305 310 315 320

Gly Val Thr Leu Gln Glu Val Pro Pro Thr Ser Ser Phe Asn Ser Val

325 330 335

Ala Ser Gly Val Pro His Gly Pro Ser Thr Thr Lys Ser Glu Ile Gln

340 345 350

Ser Ser Pro Gln Ala Thr Asn Ser Asp Asn Ile Ser Ala Ser Pro Phe

355 360 365

Ala Leu Asn Ala Val Arg Gly Pro Gly Ala Arg Glu Ala Ser Ser Leu

370 375 380

Ser Val Ser Glu Thr Asp Val Ile Met Pro Glu Leu Ser His Leu Ser

385 390 395 400

Glu Met Val Ser Glu Asn Ile Leu Asp Val Pro Glu Val Asp Tyr Arg

405 410 415

Val Pro Glu Ala Gly Asn Gly Ala Phe Ile Ser Pro Asn Phe Leu Asp

420 425 430

Ala Asn Gly Thr Ile Pro Ile Asp Ile Asp Asn Met Ser Pro Asp Ala

435 440 445

Asp Ile Asp Ala Leu Leu Asp Asn Ser Asn Phe Trp Asp Asp Leu Leu

450 455 460

Val Gln Ser Pro Cys Gln Asp Asp Glu Val Asp Phe Leu Val Gly Gly

465 470 475 480

Gly Leu Pro Lys Thr Asn Asp Met Gln Leu Ala Glu Asn Ala Trp Asp

485 490 495

Lys Ser Lys His Val Asp Lys Leu Thr Glu Gln Met Gly Leu Leu Thr

500 505 510

Ser Glu Ile Lys Arg Val Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys

515 520 525

Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

530 535 540

<210> 4

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtacagc gtctacaggg gatggagcag cgacaacagc agatgatgtc attccttgcc 60

aaggctgtgc agagccctgg ctttttggct cagtttgtgc agcagcaaaa tgaaagtact 120

agacgcataa gtgaggctaa taaaaagcga aggctaaagc aggatggaat tgccgagtct 180

gatcattctc ctgttccaga tgggcaaatt gtgaagtatc aacctctcat gaatgaggca 240

gcaaaaacaa tgctgaggca gataatgaaa gtggatactt cacatttgga accatcgaac 300

cacaataccg acaattttct aattcgtgat ggtttgcaat cgcagtgtgc agcaatggac 360

aatgggaact cttccagttc tgtatcaggc gtgactctt 399

<210> 5

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagagtcac gcctgataca gaactggaag agttcccatt gtccattgct gcacactgcg 60

attgcaaacc atcacgaatt agaaaattgt cggtattgtg gttcgatggt tccaaatgtg 120

aagtatccac tttcattatc tgcctcagca ttgtttttgc tgcctcattc atgagaggtt 180

gatacttcac aatttgccca tctggaacag gagaatgatc agactcggca attccatcct 240

gctttagcct tcgcttttta ttagcctcac ttatgcgtct agtactttca ttttgctgct 300

gcacaaactg agccaaaaag ccagggctct gcacagcctt ggcaaggaat gacatcatct 360

gctgttgtcg ctgctccatc ccctgtagac gctgtaccat 400

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagctcggta cccggggatc catggacggg actgctaatg g 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggtcgact ctagaggatc caaccctttt aatttctgaa g 41

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcgcccaat cgatgattta aatatggtac agcgtctaca ggg 43

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catgttcatc tggggattta aatgaagagt cacgcctgat aca 43

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctcagctt aattaactag tgaagagtca cgcctgatac a 41

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcaggactc tagggactag tatggtacag cgtctacagg g 41

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggttagaga ggcttacgca gcaggtc 27

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaccctttta atttctgaag 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcacaatccc actatccttc g 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcacgcgcta tcagctcttt a 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcaacactta tggattcagg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaacttacca acttccacac 20

Claims

1.CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在调控植物耐冷性中的应用。

2.CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在调控植物在低温条件下的生长或产量中的应用。

3.CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在调控植物在低温条件下的细胞膜损伤或膜脂过氧化中的应用。

4.CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在调控植物在低温条件下的脯氨酸含量中的应用。

5.CsHSFA1d蛋白或其编码基因或含有CsHSFA1d蛋白的编码基因的生物材料在植物耐冷性遗传育种中的应用。

6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，通过提高所述植物中CsHSFA1d蛋白的表达量，提高植物的耐冷性、在低温条件下的生长、产量或脯氨酸含量，或者降低细胞膜损伤或膜脂过氧化。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述CsHSFA1d蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(3)在CsHSFA1d蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体、宿主细胞、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官、转基因植株、所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物或所述组织培养物产生的原生质体。

9.一种调控植物耐冷性的方法，其特征在于，包括：调控所述植物中CsHSFA1d蛋白的表达量；

所述CsHSFA1d蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(3)在CsHSFA1d蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述植物中过表达所述CsHSFA1d蛋白的编码基因，提高所述植物的耐冷性。