CN1824779A - 一种大豆热激转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆热激转录因子及其编码基因与应用。该大豆热激转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过1至10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调节耐热相关基因功能的蛋白质。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将该大豆热激转录因子编码基因转入植物中，植物的耐热能力增强。本发明的大豆热激转录因子及其编码基因将在培育耐热性增强的植物(如大豆)中起到重要作用。

Description

一种大豆热激转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种大豆热激转录因子及其编码基因与应用，特别涉及该热激转录因子及其编码基因，与它们在培育耐热性增强大豆等植物中的应用。

背景技术

自从Wu等1987年首先克隆了果蝇(Drosophila melanogaster)热激转录因子(heat shock transcriptional factor，HSF)以来，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、鸡、番茄、人、水稻、大豆、小鼠、黑猩猩(Pantroglodytes)、海藻(Guillardia theta)、非洲爪蟾(Xenopus Laevis)等的HSF被相继克隆。尽管热胁迫元件(heat shock elements，HSEs)在所有的生物体中表现出极强的保守性，但它的反式作用因子HSF却有很大差别。不同种属生物体中HSF的相对分子质量有较大的区别，各HSF之间也没有明显的抗体交叉反应。同时发现在许多高等真核生物中存在两种以上的HSFs。由低等生物中一种HSF所担负的多种生理功能在高等真核生物中被共同存在的多种HSFs分担，几种不同的HSFs可以分别参与持续或短暂激活热激或热休克蛋白(heat shock protein，HSP)基因的表达，表现出组成性或诱导性转录调节活性。

HSFs在传递环境胁迫的相关信息方面起非常重要的作用，HSFs结合到热胁迫元件上激活热胁迫反应的基因，从而诱导热激反应。不同组织的HSFs包含以下几个重要的结构域：DNA结合域(DNA binding domain，DBD)、寡聚域(oligmerization domain，OD)、核定位信号(nuclear localization signal，NLS)及激活域(C-terminalactivation domain，CTAD)。其中DBD是高度保守的结构域。植物HSFs的DBD之间的保守性高于动物和酵母或其他高等真核生物。植物HSFs的DBD与酵母、哺乳动物以及果蝇DBD的主要区别是67到68之间缺少了11到12个氨基酸。OD由2个疏水七肽重复区域A和B(HR-A/B)组成。区域A包含5-6组疏水的七肽重复序列，而区域B是由2个互相交叠的七肽重复序列组成。目前认为，OD是3股α-螺旋通过卷曲螺旋型α-螺旋(α-helical coiled-coil)结构形成一种HSF的同源三聚体构型。在高等真核生物中，HSF三聚体的形成需要热激诱导。在非热激条件下，HSF三聚化被抑制。研究表明，在HSF的C端存在另一个疏水7肽重复序列(HR-C)。该区域与动物HSF三聚化的调节有关。HR-C突变可导致一种组成型的HSF三聚化和DNA结合活性。在正常生长条件下，HR-A/B和C之间通过分子内的卷曲螺旋型α-螺旋相互作用，来抑制HSF三聚体的形成。由于在植物HSF的HR-C中含有较多的脯氨酸和甘氨酸，形成α螺旋的潜能很低，因此植物HSF的HR-C的功能目前还不清楚。

已报道拟南芥中有21个HSFs，番茄中已发现16种以上的HSFs，大豆中也发现了15种以上的HSFs。大豆中已经克隆3个全长的cDNA：GmHSF5、GmHSF21、GmHSF34。在动、植物中发现大量的HSFs表明HSF基因可能特异性对不同的胁迫起作用，或是在发育中起不同的作用。大部分的HSF基因是受热诱导的，一些基因的表达因氯化钙胁迫而增强。大豆HSF基因即有组成型表达的，也有诱导表达的。大豆HSF基因组成型的表达量低于热诱导型的，番茄LpHSF8(即LpHSF A1)是组成型表达的，其表达量也低于它的两个热诱导型的HSFs。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆热激转录因子及其编码基因。

本发明所提供的大豆热激转录因子，名称为GmHSF8，来源于大豆属大豆(Glycinemax L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过1至10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调节耐热相关基因功能的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由510个氨基酸残基组成，自序列2的氨基端第28位-122位氨基酸残基为GmHSF8的DBD；GmHSF8的OD由HR-A(自序列2的氨基端第142位-172位氨基酸残基)和HR-B(自序列2的氨基端第200位-208位氨基酸残基)组成；自序列2的氨基端第225位-239位氨基酸残基为GmHSF8的NLS；GmHSF8的CTAD由AHA1(IDFDSISPE，自序列2的氨基端第434位-442位氨基酸残基)和AHA2(NPHFWDDILRT，自序列2的氨基端第451位-461位氨基酸残基)组成。

上述大豆热激转录因子的编码基因(GmHSF8)，也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1781个碱基组成，该cDNA包括1533bp的开放读码框(自序列1的5′端第142位-1674位碱基)。

含有本发明基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增GmHSF8中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

GmHSF8基因在正常条件下的不同植物组织中都有表达，多种逆境如热、盐等胁迫均可使其表达量增加，促进相关耐逆基因的表达，提高植物对环境的耐逆性。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的GmHSF8基因转入植物(特别是大豆)中，植物的耐热能力增强。

本发明的GmHSF8基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：大豆、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。携带有本发明的GmHSF8基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培养成植株。

本发明的大豆热激转录因子及其编码基因将在培育耐热性增强的植物(如大豆)中起到重要作用。

附图说明

图1为RACE法克隆得到的GmHSF8基因PCR产物电泳图谱

图2为GmHSF8分子结构示意图

图3为GmHSF8 5’非翻译区热激元件

图4为150mM NaCl和42℃热激处理对大豆的叶、根和下胚轴中GmHSF8基因表达的影响

图5为pCAMBIA2300-GmHSF8的物理图谱

图6为转化植株的PCR检测

图7A为常温条件下转GmHSF8基因植株和非转基因植株的GmHSF8基因表达情况

图7B为常温条件下转GmHSF8基因植株和非转基因植株的HSP70基因表达情况

图7C为热激条件下转GmHSF8基因植株和非转基因植株的HSP70基因表达情况

图8为转GmHSF8基因植株和非转基因植株对热胁迫的反应

具体实施方式

实施例1、GmHSF8及其编码基因的获得：

大豆(Glycine max L.Merr.)播种在蛭石中，在温室中培养，以生长2-3周的幼苗作实验材料。用Trizol试剂盒(GIBCO-BRL)从大豆幼苗中提取总RNA。用逆转录试剂盒(Promega)合成第一链cDNA。为了分离全长基因，根据大豆EST数据库中不连续的HSF8 cDNA片段的EST序列设计上游和下游引物，分离基因的3′末端、5′末端。GSPs(基因特异引物)和NGSPs(嵌套基因特异引物)序列如下：5’RACE：GSP1，5’-TGAACAGCCTTTGCAAGGAATGACATC-3’；NGSP1，5’-CTCTGCAGCTGGTTATCAGTAGCCTG-3’；3’RACE：GSP2，5’-GCGCCTTCAAGGAATGGAGCAACGACAGC-3’；NGSP2，5’-GATGTCATTCCTTGCAAAGGCTGTTCA-3’。结果如图1所示，用cDNA末端快速扩增法(GIBCO-BRL)得到含热激转录因子8(HSF8)的cDNA3′末端序列(1041bp)和5′末端序列(695bp)。图1，泳道M为DNA marker，DL2000；1，2为3’RACE产物；3，4为5’RACE产物)。

按照常规方法对该3’RACE产物和5’RACE产物进行测序，利用DNAMAN软件将中间片段(两次扩增产物重叠序列)与两次RACE获得的末端序列进行拼接，得到一个全长1781bp大豆热激转录因子8的cDNA(序列1)。该cDNA包括1533bp的开放读码框(自序列1的5′端第142位-1674位碱基)、141个碱基的5′非翻译区(自序列1的5′端第1位-141位碱基)、107个碱基的3′非翻译区(自序列1的5′端第1675位-1781位碱基)。在5′非翻译区+102位置(自序列1的5′端第37位-39位碱基，图3中

部分)有一个终止密码子(TAG)，且与编码区的读码框一致，说明不存在其它更靠前的起始密码子，表明所克隆片段是全长cDNA，将其命名为GmHSFS。此cDNA编码一段510个氨基酸的蛋白质(序列2)，名称为GmHSF8，推测分子量为56.2KD。

利用BLAST进行序列比对，用DNAMAN软件进行氨基酸序列同源性分析，结果表明GmHSF8与番茄热激转录因子(LpHSFA1)的氨基酸序列同源性较高(52.46％)，说明它们属于同一类热激转录因子。GmHSF8的DBD与LpHSFA1的DBD同源性高达90.43％。GmHSF8疏水七肽重复区域A(HR-A)的N末端前有19个氨基酸(自序列2的氨基端第123位-141位氨基酸残基，而LpHSFA1和拟南芥热激转录因子(AtHSFA1)分别有30和19个氨基酸。HR-A/B功能域(自序列2的氨基端第142-208位氨基酸残基)在GmHSF8和LpHSFA1之间完全保守，只是在氨基酸组成上有4处不同(自序列2的氨基端157位Arg→Ile、178位Ser→Ala、185位Gly→Ser、195位Leu→Gln)；GmHSF8的NLS是双元结构SRR-5aa-KKRRLKQ(自序列2的氨基端第225位-239位氨基酸残基)；GmHSF8的CTAD由AHA1(IDFDSISPE)和AHA2(NPHFWDDILRT)组成，该结构域保守性最差(图2)。这说明GmHSF8是一个新的热激转录因子。图2中，insert-HR-A与HR-B之间的插入序列，H2-螺旋结构2，H3-螺旋结构3，T-转角结构。

如图3所示，在GmHSF8基因5’端非翻译区(141bp)可以找到6个HSE响应元件[A(G，T，C)GAAn或A(G，T，C)GnAn或A(G，T，C)GAnn](用下划线

表示)和13个(注：图3中最前面的“ 6个碱基”是2个HSE响应尾部元件)HSE响应尾部元件[nTTCt(A，G，C)或nTnCT(A，G，C)或nnTCT(A，G，C)](用下划线“_”表示)。尽管该5’端非翻译区较短，但有19个热激响应元件，说明热激转录因子GmHSF8与其编码基因之间存在着复杂的互作调节关系。在该基因的5’端非翻译区没有发现TAAT盒，说明这些热激响应元件位于TAAT盒的下游。

实施例2、高温和高盐胁迫对GmHSF8基因表达的影响

大豆(Glycine max L.Merr.)播种在蛭石中，在温室中培养，以生长2-3周的幼苗作实验材料。

将幼苗放在42℃下分别培养3，6，9和18小时，对照组在24℃下培养。将幼苗根系置于150mM NaCl溶液中处理3，6，9和18小时。

分别从不同处理的幼苗的叶片、根和下胚轴提取总RNA。用定量RT-PCR方法分析GmHSF8基因在大豆不同组织的表达。以OligodT₁₅为引物逆转录合成cDNA，进行PCR扩增，用定量RT-PCR方法分析GmHSF8基因在大豆不同组织的表达。PCR用的特异引物为正向引物P1：5’-CTTCTCCAGCTTCGTTCGCC’-3’；反向引物P2：5’-TACCCTCCTGCTTAAGCCGG-3’。

用GmACTIN(Accession No.V00450)定量模板cDNA的浓度，所用引物为：正向引物：5’-GGTGATGGTGTGAGTCACACTGTACC-3’；反向引物：5’-GTGGACAATGGATGGGCCAGACTC-3’。

PCR反应在eppendorf型扩增仪上进行，反应总体积为25ul，含有cDNA 200ng，正向引物10pM，反向引物10pM，1U Taq DNA聚合酶(TaKara公司)，2.5μl 10×缓冲液(200mM Tris-HCl，pH8.8，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgSO₄，1％Triton X-100，1mg ml^-1 nuclease-free BSA和0.2mM dNTPs)。扩增程序为94℃预变性3min，然后进入循环：94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸90s，共30个循环，最后再72℃延伸10min。结果表明，高温和高盐胁迫对大豆不同组织中GmHSF8基因表达有不同的影响。叶片中GmHSF8基因的表达受高温的影响不明显，但受高盐胁迫的抑制(而150mM NaCl处理9h例外)；高温对下胚轴中GmHSF8基因表达有轻微的抑制作用，而高盐对下胚轴中该基因的表达则有轻微的诱导作用；根中GmHSF8基因的表达受高温和盐的明显诱导作用，该基因的表达量均随两种胁迫因子的持续处理时间延长而增加(但150mM NaCl处理3h例外)，高温处理的这种变化趋势更明显(图4)。总之，大豆叶、下胚轴和根中的GmHSF8基因在正常条件(42℃0h即24℃培养)下都有表达(为组成性表达类型)，而高温或高盐胁迫能使其表达量增加，在根系中尤其如此。图4中，LH表示叶片中GmHSF8基因的表达，LA表示叶片中肌动蛋白基因的表达；HH表示下胚轴中GmHSF8基因的表达，HA表示下胚轴中肌动蛋白基因的表达；RH表示根中GmHSF8基因的表达，RA表示根中肌动蛋白基因的表达。泳道1，2，3，4和5分别表示处理0，3，6，9和18小时。

实施例3、培育耐热能力增强的转基因大豆

pCAMBIA2300载体购自CABIA中心。Taq DNA Polymerase，SmaI和ScaI购自Takara公司。6-BA、IBA、头孢霉素Cef、卡那霉素Kanamycin(Kan)和乙酰丁香酮(AS)等购自北京鼎国生物技术公司。

1、植物表达载体的构建

用限制性内切酶SmaI和SacI酶切载体pCAMBIA2300，以引物P1：CCCGGGATGGACGGAAGAGC和P2：TTAAGAAAACCGTAGTCT(含有SmaI识别位点CCCGGG和SacI识别位点GAGCTC)进行PCR扩增得到的GmHSF8基因，用T₄DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，在X-gal平板上筛选具有卡那霉素抗性的菌落，进行PCR鉴定，得到含有植物表达载体pCAMBIA2300-GmHSF8的阳性菌落。提取阳性菌落中的质粒，得到植物表达载体pCAMBIA2300-GmHSF8(图5)。

2、大豆遗传转化

大豆转化受体品种为科新3号。

用植物表达载体pCAMBIA2300-HSF8转化农杆菌LBA4404，在含有链霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆，4℃保存。从4℃保存的平板上挑取含有表达载体的农杆菌单菌落接入含有50mg/L Kan、25mg/L利福平、25mg/L链霉素的YEB培养基，28℃、200r/min振荡培养12-14h左右至对数期，在4℃、8000rpm离心10min，去上清液，用同体积的液体分化培养基(MS+1.6mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+500mg/L Cef，pH5.4)，添加100μmol/L AS重悬后备用。

挑选籽粒饱满的大豆种子按Zhang等(1999，Plant Cell，Tissue，and OrganCulture，56：37-46)的方法进行消毒。将饱满的干种子单层平铺于培养皿中，培养皿敞开将其放置于干燥器中，将100ml的烧杯放置于干燥器内，加入50ml的饱和次氯酸钠，再加入2ml浓盐酸，立即盖上干燥器盖子，放置通风厨内过夜(14-16h)。消毒后的种子接种于萌发培养基MSO(pH5.8)上，25℃的温室中进行培养，光16h/暗8h，5-6d后获得无菌苗。

取无菌苗的子叶节为外植体，用解剖刀在子叶节部位划网状裂纹，将其浸没在农杆菌重悬液中侵染30min后，置于暗处共培养3d后，转入诱导丛生芽培养基MS+1.6mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+500mg/L Cef；待长出丛生芽后，将其接种于筛选培养基MS+1.6mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+50mg/L kan+500mg/L Cef，每2周继代1次，获得了一批抗卡那霉素(Kan)的转化苗，筛选的不定芽长至0.5-1cm时接于伸长培养基MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+50mg/L kan+500mg/L Cef；约2周后一些丛生芽抽出主茎并长成3-4cm的小苗，将其移入生根培养基MS+1.5mg/L IBA，待长出健壮的根系后移栽到花盆中。最后得到13株转化植株。

3、转化植株PCR检测

选取经Kan筛选的抗性移栽成活植株，每株剪取1-2片叶，按照Edwards等(1991，Nucleic Acids Res.，19：1349)描述的方法提取基因组DNA，以其为模板，采用植物体内无同源序列的35s启动子引物进行PCR扩增。PCR引物由上海生工合成。引物序列分别为：F：5-GGGTCTTGCGAAGGATAG-3，R：5-GCTTACGCAGCAGGTCTC-3。PCR反应在PTC-100型PCR仪上进行，94℃预变性5min后按下列条件进行扩增循环：94℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min，后续30个同样的循环。反应结束后72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。以pCAMBIA2300质粒为阳性对照，科新3号的非转基因再生苗为阴性对照。PCR检测结果如图6所示，表明13株转化植株中有9株扩增出830bp的DNA条带，而阴性对照未扩增出相应的片段(图6)。证明GmHSF8基因已整合入这9株的基因组中，实际转化率为2.39％。图6中，1：非转基因亲本植株(阴性对照)；2：pCAMBIA2300-GmHSF8(阳性对照)；3-15：转化植株；M：DNA marker(DL2000)。

4、转基因植株Northern检测

分别提取常温(24℃)下培养的转GmHSF8基因大豆植株与非转基因大豆植株的叶片总RNA，以GmHSF8 cDNA的一段保守序列(以质粒pCAMBIA2300-GmHSF8 DNA为模板，在引物F：5-GGGTCTTGCGAAGGATAG-3和R：5-GCTTACGCAGCAGGTCTC-3的引导下PCR得到的DNA片段)为探针，通过Northern方法检测GmHSF8基因的表达。结果如图7A所示，表明在常温下转GmHSF8基因植株的GmHSF8基因表达量显著高于非转基因植株(少量表达)。图7A中，1为非转基因植株，2为转GmHSF8基因植株。

将转GmHSF8基因大豆植株与非转基因大豆植株的3周龄的幼苗分别在常温(24℃)下培养和42℃热激3小时/天(连续处理3天)，分别提取转GmHSF8基因大豆植株与非转基因大豆植株的叶片总RNA，以HSP70 cDNA的一段保守序列(以科新3号大豆植株基因组DNA为模板，在引物P1：CATAGGCATCGATCTCGGCAC和P2：GAAGACGGTGTTCTGCGGG的引导下PCR得到的DNA片段)为探针，通过Northern方法检测HSP70基因的表达。结果表明，在常温(24℃)条件下转GmHSF8基因植株的HSP70基因表达量明显高于几乎不表达的非转基因植株(如图7B所示)；在热激(42℃)条件下转GmHSF8基因植株的HSP70基因超表达，其表达量显著高于非转基因植株(有一定量表达)(如图7C所示)。图7B和图7C中，1为非转基因植株，2为转GmHSF8基因植株。

5、转基因植株热胁迫实验

为了验证过量表达GmHSF8基因的植株是否提高了耐热性，将转基因植株与非转基因植株进行高温(热激)处理实验。结果表明在常温(28-30℃培养6h)下供试植株的所有叶片都是平展的(图8中A，B)；当温度升至38-40℃，培养40min时，非转基因植株的嫩叶片开始向内卷曲(图8中C-左、D-左)，在42-45℃，培养40min时内卷曲表现较为明显(图8中E-左、F-左)，在42-48℃，培养40min时内卷曲程度随温度升高逐渐明显(图8中E-左、F-左、G-左、H-左)，而转基因植株的嫩叶片未出现内卷曲。在52℃培养15分钟后，非转基因植株的顶部叶片开始萎焉(图8中I-左)，而转基因植株的嫩叶片只是略有卷曲(图8中I-右)。说明转GmHSF8基因的大豆植株比非转基因对照植株表现出较强的耐热能力(提高8-10℃)，本发明所提供的GmHSF8基因具有激活耐热相关基因的功能。图8中，A-I中的左侧植株为非转基因植株、右侧植株为转GmHSF8基因植株。

                                序列表

<160>2

<210>1

<211>1781

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max L.)

<400>1

tctttcacta ctccccatct gttaaatttc gaacactagg gttcaatttt ctccaacaat      60

gaccctcact ctattcctct gacttcccat agaccacaat acactcaccc caggcaaaaa     120

atttcgtttc aaaattgtga tatggacgga agagcgagca gcagcgtggg cggagaagca     180

tcgccagctc cagcaccggt gccgataacg aatgcgaacg cgccgccgcc tttcttgagc     240

aagacatacg agatggtaga ggacccttcg acggactcga tagtgtcgtg gagtccaacg     300

aacaacagtt tcgtggtttg gaaccctccc gagttcgcca gagatctctt gcccaaacac     360

ttcaagcaca acaacttctc cagcttcgtt cgccaattaa acacctacgg atttaggaag     420

gtagatccag atcgctggga atttgcaaat gagggatttt tgaggggtca aaagcacttg     480

cttaagacta taactcggcg gaaacctgcc catggtcata atcaacaggc acagcaagca     540

catggacaga gttcatctgt tggggcttgt gttgaagttg ggaagtttgg acttgaggaa     600

gaggttgaga ttctcaagag agataagaat gtgctcatgc aagagcttgt gagattgagg     660

cagcagcaac aggctactga taaccagctg cagagtatgg ttcagcgcct tcaaggaatg     720

gagcaacgac agcaacaaat gatgtcattc cttgcaaagg ctgttcagag tcctggtttt     780

ttagctcaat ttgtacaaca gcaaaatgag agtagtagac gcataacgga ggcaaataaa     840

aaacgccggc ttaagcagga gggtattggt gaaatggaac atactgctgc ttctgatggc     900

caaattgtta aatatcaacc tctgataaat gaagcagcaa aagcaatgct gaggcaaatg     960

atgaaattgg atacttctcg actagaatct tttagtaata acgctgataa ttacttgatt    1020

ggtgatcatt catcatcatc cggtgcaacg gacaggggaa actctttgag ccggacttct    1080

ggagtaacac ttcaagtggt ccctctgact acaatccagt cttctcacat tccatctgca    1140

acggggatag gggatgaccc ttcaacagga aaatctgaga ttctatctac tcctcaagtt    1200

gtagcctgtg atgaagttac gaaagctcag tactctaatg taaatgtttc ggttggagaa    1260

tctaatgcac ctgctatccc tgctactcaa acagatgaaa tcatgcggga cctctctaca    1320

ataccagaca tagtggcagg aaatattctt gatattcctc aagaaaatta tatggcacct    1380

gagacaggcg gtgaaggata tatggatcct acttcatttg gagtgaatgt gtcattgccc    1440

attgattttg atagtatttc acctgaagca gacattgatg atttgttgaa caatcctcac    1500

ttttgggatg atattttgcg aactccagtg tcagaggaga ttgatacgaa tgatgctgaa    1560

gtattcaagg agaatgaggt gcagccaatg gaaaatggat tggacgaatc acaaaatatg    1620

gaccaactta ctgagcagat gggcctactt tcttctgatg ccaaaagaat ttgagtgtat    1680

tatgaaagtg tacattatta atatttcata ttgtgcaagg taaccttagc ctagacaatg    1740

ggttatgttg ttttagttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                        1781

<210>2

<211>510

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max L.)

<400>2

Met Asp Gly Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Gly Glu Ala Ser Pro Ala

1               5                   10                  15

Pro Ala Pro Val Pro Ile Thr Asn Ala Asn Ala Pro Pro Pro Phe Leu

            20                  25                  30

Ser Lys Thr Tyr Glu Met Val Glu Asp Pro Ser Thr Asp Ser Ile Val

        35                  40                  45

Ser Trp Ser Pro Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Trp Asn Pro Pro Glu

    50                  55                  60

Phe Ala Arg Asp Leu Leu Pro Lys His Phe Lys His Asn Asn Phe Ser

65                  70                  75                  80

Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Thr Tyr Gly Phe Arg Lys Val Asp Pro

                85                  90                  95

Asp Arg Trp Glu Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Arg Gly Gln Lys His

            100                 105                 110

Leu Leu Lys Thr Ile Thr Arg Arg Lys Pro Ala His Gly His Asn Gln

        115                 120                 125

Gln Ala Gln Gln Ala His Gly Gln Ser Ser Ser Val Gly Ala Cys Val

    130                 135                 140

Glu Val Gly Lys Phe Gly Leu Glu Glu Glu Val Glu Ile Leu Lys Arg

145                 150                 155                 160

Asp Lys Asn Val Leu Met Gln Glu Leu Val Arg Leu Arg Gln Gln Gln

                165                 170                 175

Gln Ala Thr Asp Asn Gln Leu Gln Ser Met Val Gln Arg Leu Gln Gly

            180                 185                 190

Met Glu Gln Arg Gln Gln Gln Met Met Ser Phe Leu Ala Lys Ala Val

        195                 200                 205

Gln Ser Pro Gly Phe Leu Ala Gln Phe Val Gln Gln Gln Asn Glu Ser

    210                 215                 220

Ser Arg Arg Ile Thr Glu Ala Asn Lys Lys Arg Arg Leu Lys Gln Glu

225                 230                 235                 240

Gly Ile Gly Glu Met Glu His Thr Ala Ala Ser Asp Gly Gln Ile Val

                245                 250                 255

Lys Tyr Gln Pro Leu Ile Asn Glu Ala Ala Lys Ala Met Leu Arg Gln

            260                 265                 270

Met Met Lys Leu Asp Thr Ser Arg Leu Glu Ser Phe Ser Asn Asn Ala

        275                 280                 285

Asp Asn Tyr Leu Ile Gly Asp His Ser Ser Ser Ser Gly Ala Thr Asp

    290                 295                 300

Arg Gly Asn Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Val Thr Leu Gln Val Val

305                 310                 315                 320

Pro Leu Thr Thr Ile Gln Ser Ser His Ile Pro Ser Ala Thr Gly Ile

                325                 330                 335

Gly Asp Asp Pro Ser Thr Gly Lys Ser Glu Ile Leu Ser Thr Pro Gln

            340                 345                 350

Val Val Ala Cys Asp Glu Val Thr Lys Ala Gln Tyr Ser Asn Val Asn

        355                 360                 365

Val Ser Val Gly Glu Ser Asn Ala Pro Ala Ile Pro Ala Thr Gln Thr

    370                 375                 380

Asp Glu Ile Met Arg Asp Leu Ser Thr Ile Pro Asp Ile Val Ala Gly

385                 390                 395                 400

Asn Ile Leu Asp Ile Pro Gln Glu Asn Tyr Met Ala Pro Glu Thr Gly

                405                 410                 415

Gly Glu Gly Tyr Met Asp Pro Thr Ser Phe Gly Val Asn Val Ser Leu

            420                 425                 430

Pro Ile Asp Phe Asp Ser Ile Ser Pro Glu Ala Asp Ile Asp Asp Leu

        435                 440                 445

Leu Asn Asn Pro His Phe Trp Asp Asp Ile Leu Arg Thr Pro Val Ser

    450                 455                 460

Glu Glu Ile Asp Thr Asn Asp Ala Glu Val Phe Lys Glu Asn Glu Val

465                 470                 475                 480

Gln Pro Met Glu Asn Gly Leu Asp Glu Ser Gln Asn Met Asp Gln Leu

                485                 490                 495

Thr Glu Gln Met Gly Leu Leu Ser Ser Asp Ala Lys Arg Ile

            500                 505                 510

Claims (9)

1、一种大豆热激转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过1至10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调节耐热相关基因功能的蛋白质。

2、权利要求1所述的大豆热激转录因子的编码基因。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述大豆热激转录因子编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、含有权利要求2或3所述的大豆热激转录因子编码基因的表达载体。

5、含有权利要求2或3所述的大豆热激转录因子编码基因的细胞系。

6、含有权利要求2或3所述的大豆热激转录因子编码基因的宿主菌。

7、扩增权利要求2或3所述的大豆热激转录因子编码基因中任一片段的引物对。

8、权利要求2或3所述的大豆热激转录因子的编码基因在培育耐热性增强植物中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为大豆、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿。

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