CN1296383C

CN1296383C - 一种植物dreb转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1296383C
Application number: CN 200510082838
Authority: CN
Inventors: 沈世华; 孙静文; 刘杰; 曹川�
Original assignee: BEIJING WANFUCHUN FOREST RESOURCE DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: BEIJING WANFUCHUN FOREST RESOURCE DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2005-07-11
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2025-07-11
Also published as: CN1733802A

Abstract

本发明公开了一种植物DREB转录因子及其编码基因与应用。该植物DREB转录因子是序列表中的SEQ ID №：1。本发明的植物DREB转录因子及其编码基因可用于调控植物抗逆性，特别是增强植物抗逆性，尤其是增强构树的抗逆性，为培育速生、丰产、高抗逆性品种提供了有效的途径。

Description

一种植物DREB转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物中一种与胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用，特别涉及一种植物DREB转录因子及其编码基因与其在培育抗逆性增强的植物中的应用。

背景技术

自然界的植物经常会遭受干旱、盐碱和低温等恶劣环境的胁迫危害，使其生长发育受到抑制，甚至导致植株死亡。土壤盐渍化是影响植物生长量的一个主要的环境胁迫因子。据统计，盐碱地占地球陆地面积的7.5％，目前世界上大约有三分之一的可灌溉土壤由于含盐量较高而不再适合作物生长。我国约有15亿多亩盐渍化土地，主要分布在山东、河北、东北、新疆、甘肃等沿海及干旱和半干旱地区。随着我国人口的剧增及工业的高速发展，可耕地急剧下降，而不合理灌溉、耕作等又造成了大量良田的次生盐渍化。从而导致我国耕地逐年急剧下降，严重威胁着我国的粮食和林木生产。因此，如何利用和开发我国上亿亩盐渍化土壤，培育能够在盐渍化土壤上生长良好的耐盐新品种，尽量避免或减轻不良环境因素的危害，是当前生物和现代农业技术领域的研究热点，也是当今我国以及世界农业急需解决的重大课题。

植物对胁迫的抵抗或忍耐能力称为抗逆性，是植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应性。多年来，人们从各个角度对植物与高盐胁迫之间的关系进行了研究。从最初的生理现象的研究到生态、遗传的研究，再到生理生化、代谢的研究，已积累了丰富的资料。特别是随着分子生物学的发展，使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对胁迫的耐性机理，并且为利用基因工程手段改良植物抗盐胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着分子生物学的发展，通过基因过程手段改良植物的抗逆性开辟了植物抗逆育种的新途径，但高效抗逆基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因子。过去，克隆和应用的主要是单一的功能基因，如甜菜碱合成酶基因和脯氨酸合成酶基因等，虽然取得了一定的效果，但植物的抗逆性没有得到全面的提高。

植物抗逆性受多基因控制，要使众多对植物抗逆性状产生影响的功能基因充分表达和发挥作用，才能有效地改良植物抗逆性。随着生物技术的不断发展，研究重点已从一般的功能基因转向各种专一性或高效性的调控因子(如启动子和转录因子)。由于一个脱水应答元件结合蛋白(DREB，dehydration-responsiveelement binding protein)转录因子可以调控多个与植物胁迫耐性有关的基因表达，增强一个DREB转录因子的作用，就可使植株抗逆性状获得综合改良。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物DREB转录因子及其编码基因。

本发明所提供的植物DREB转录因子，名称为BpDREB2，来源于构树(Broussonetia papyrifera)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物抗逆性功能的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中的序列1由330个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第6位-12位氨基酸残基可能为核定位序列，自氨基端第134位-197位氨基酸残基序列为保守的AP2/EREBP结构域，自氨基端第198位至第330位氨基酸残基为一个典型的酸性活化区域AAR。

上述植物DREB转录因子编码基因(BpDREB2)，也属于本发明的保护范围。它的cDNA和基因组基因可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：2由1384个核苷酸组成，其编码序列为自5’端第41到第1033位核苷酸，编码序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列。

含有本发明基因的表达载体(如p3301-BI121-BpDREB2)、细胞系(如导入p3301-BI121-BpDREB2的愈伤组织)及宿主菌(如导入p3301-BI121-BpDREB2的根癌农杆菌)均属于本发明的保护范围。

组织特异性表达模式分析表明BpDREB2在茎和叶中高水平表达，而在根中表达较弱。在逆境条件下的表达模式分析表明，BpDREB2在转录水平的表达受高盐和干旱强烈诱导，而与低温和ABA诱导没有关系。转BpDREB2水稻的抗逆性实验表明，BpDREB2的过表达可明显提高水稻对盐碱和干旱等的抗逆性。

本发明的植物DREB转录因子编码基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，携带有本发明BpDREB2基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的植物DREB转录因子及其编码基因可用于调控植物抗逆性，特别是增强植物抗逆性，尤其是增强构树、水稻的抗逆性，为培育速生、丰产、高抗逆性(高耐盐品种)提供了有效的途径。

附图说明

图1为经250mM的NaCl处理的构树幼苗的总RNA电泳图谱

图2为BpDREB2的cDNA基因的3’RACE结果

图3为BpDREB2的cDNA基因的5’RACE结果

图4为BpDREB2的全长cDNA基因的PCR扩增结果

图5为BpDREB2与几种植物DREB2类蛋白编码氨基酸的多序列比较

图6为BpDREB2与几种植物DREB2类蛋白编码氨基酸的系统进化树分析

图7A为BpDREB2的蛋白质功能预测

图7B为BpDREB2的蛋白质结构预测

图8为分别以构树基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增的结果

图9为BpDREB2的组织特异性表达分析

图10为盐胁迫条件下BpDREB2在转录水平的表达模式分析

图11为干旱胁迫条件下BpDREB2在转录水平的表达模式分析

图12为低温胁迫条件下BpDREB2在转录水平的表达模式分析

图13为ABA胁迫条件下BpDREB2在转录水平的表达模式分析

图14为Southern杂交分析构树基因组中BpDREB2的同源基因

图15为重组质粒p3301-BI121-BpDREB2的构建过程示意图

图16为pGEX-KG的构建过程示意图

图17为p3301-BI121的构建过程示意图

图18为p3301-BI121-BpDREB2表达载体的PCR鉴定

图19为p3301-BI121-BpDREB2表达载体的酶切鉴定

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、BpDREB2及其cDNA基因的获得

1、BpDREB2全长cDNA的克隆

(1)总RNA的提取

将生长3个月的构树幼苗的根系置于250mM的NaCl溶液处理12小时后提取叶片的总RNA，进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，所提取的总RNA有2条特别明显的电泳带，从上到下分别为28S和18S。

(2)BpDREB2的cDNA基因3’端序列的克隆

以Adaptor-dT(5’-GATTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，简并引物DREB2-3-1[AA(A\G)TGGGT(A\T\G)(G\T)(G\C)(A\C\T)GA(A\G)(A\G)T(G\C\T)(A\C)G(A\T\G\C)GA]、DREB2-3-2：[GC(A\T\G)GC(A\T\G)(C\T)(A\T\G\C)(G\C\T)GCT(C\T)A(C\T)GA(C\T)G(A\T)(A\G\C)GC]分别与dT-Adaptor引物配对进行套式PCR扩增(扩增条件为：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环)。最后扩增出一段900bp左右的特异片段(图2；M为Marker III，1为PCR产物)，回收该特异片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，PCR和酶切鉴定后由上海生工测序。将测序结果进行BLAST分析，结果该片段与植物中已知的DREB2类基因的3′端序列有较高的同源性，表明该片段可能为构树DREB类DNA结合蛋白基因的3′端序列，长度为914bp。

(3)BpDREB2的cDNA基因5’端序列的克隆

根据3′端cDNA序列设计3个巢式引物：DREB2-5-gsp1(AAGACGACACCTCCAATC)、DREB2-5-gsp2(GCTCGATGACTGGCTTCACCT)和DREB2-5-gsp3(CTCGATGACTGGCTTCACCTC)，参照Invitrogen公司的5’RACE试剂盒的说明书进行反转录和PCR扩增，在600bp左右处出现特异条带(图3；M为Marker III，1为PCR扩增产物)。同样，回收该条带、与pMD18-T载体连接、鉴定后测序，测序结果表明该片段与3’RACE结果有324bp的重叠区，且BLAST分析表明该片段与植物中已知的DREB2类基因的5′端序列同源性较高，表明该片段确为构树DREB类DNA结合蛋白基因的5′端序列，长度为624bp。

(4)BpDREB2的cDNA基因的电子合并及全长cDNA的克隆

利用DNAMAM软件将克隆到的3’端序列和5’端序列进行拼接，将这两个片段拼接后获得cDNA的全长序列，在该序列读码框(open reading frame，ORF)的两端设计全长引物DREB2W-1(AGAAGAGCTCATGAAAGCACTTG)和DREB2W-2(CTACCAGCTGACCAACATAGGAG)，以步骤(2)反转录合成的第一链cDNA为模板，扩增出一个1300bp左右的特异片段(图4；M为Marker III，1为PCR扩增产物)。回收该特异片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，PCR和酶切鉴定后由上海生工测序。测序结果和拼接结果在扩增部分完全相同，其全长为1384bp，这说明克隆的3′RACE和5′RACE结果属于同一基因，并将其命名为BpDREB2。将含有该1384bp的BpDREB2的pMD18-T命名为pMD18-BpDREB2。

2、BpDREB2的cDNA基因的生物信息学分析

(1)BpDREB2的cDNA基因的序列分析及析编码蛋白的结构功能预测

利用DNAMAN软件对BpDREB2的全长cDNA序列进行分析，该序列全长1384bp(序列2)，包括一个完整的ORF(自5’端第41到第1033位核苷酸)，编码330个氨基酸残基(序列1)，推测其分子量为36.201kDa，等电点pI值5.86。利用SMART工具对推断的氨基酸序列进行功能预测，发现该蛋白含有一个典型的EREBP/AP2结构域(自氨基端第134位至第197位氨基酸残基)，该结构域由64个氨基酸组成。另外，该蛋白的N-端(自氨基端第6位至第12位氨基酸残基)含有一个“PFMKSAH”基序，可能作为核定位信号(nuclear localization signal；NLS)引导该蛋白定位于细胞核上。C-端存在一个典型的酸性活化区域(acidicactivation region；AAR)(自氨基端第198位至第330位氨基酸残基)，该区域可能有利于启动下游抗性基因转录。这些结果表明BpDREB2是一种典型的转录因子，属于EREBP/AP2蛋白家族的一员。

(2)BpDREB2与植物中其它已克隆的DREB2类蛋白编码氨基酸序列同源性分析

利用DNAMAN软件对BpDREB2与植物中其它已克隆的DREB2类蛋白编码氨基酸序列进行同源性分析(图5)和系统进化树分析(图6)，结果表明BpDREB2与双子叶植物DREB类蛋白AtDREB2、S1DREB2、GhDREB1、GmDREB2、和AhDREB2的同源性比较高，为55-70％。由图5可见，在植物DREB2类转录因子中，存在高度保守EREBP/AP2结构域。系统进化分析表明从双子叶植物中分离的DREB2类蛋白与从单子叶植物中的分离的该类蛋白的同源性较低，大约为40-50％，说明DREB2类蛋白在进化过程中出现了较大的差异，但在每一类植物中该蛋白相对比较保守。图中，BpDREB，构树DRREB2；AtDREB2，拟南芥DREB2；GhDREB2，棉花DREB2；GmDREB2，大豆DREB2；OsDREB2，水稻DREB2；ZmDREB2，玉米DREB2；S1DREB2，番茄DREB2；AhDREB2，Atriplex hortensis DREB2.

(3)BpDREB2的蛋白质结构预测

用SMART服务器(http://coot.embl-heidelberg.de/SMART/)分析结构域，结果如图7A。表明在330个氨基酸的蛋白质序列中，在134～197位之间含有一个典型的EREBP/AP2结构域，从而说明它是DREB基因家族中的一个新成员。用CPHmodels-2.0 Server服务器( http://genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-20 Server-3D.htm)分析预测BpDREB2的蛋白质结构。结果如图7B，BpDREB2含有一个典型的α螺旋和三个β折叠片结构。

3、PpDREB2基因在基因组DNA的结构分析

为了分析BpDREB2基因的结构，以构树的基因组DNA为模板，以DREB2W-1和DREB2W-2为引物进行PCR扩增(扩增条件为：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环)。结果发现在1300bp处有一条特异条带，其大小和以cDNA为模板，以同样引物PCR扩增的结果相一致(图8；1为以基因组DNA为模板；2为以cDNA为模板；M为M marker III)。进一步对该特异片段进行克隆和测序，测序结果和对应的cDNA序列完全相同。这说明在该基因内部没有内含子。

实施例2、BpDREB2的表达分析

1、BpDREB2的组织特异性表达分析

为了分析BpDREB2的组织特异性表达模式，分别提取构树根、茎、叶三种组织的总RNA，利用全长引物DREB2W-1和DREB2W-2进行RT-PCR分析。以Actin基因作为内标，对所有cDNA模板进行半定量。分析结果表明：BpDREB2基因在三种组织中的表达存在差异(图9；R为根，S为茎，L为叶，M为M marker III)，以根中的表达量为最低，在茎和叶中的表达较强。

2、BpDREB2在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析

为了分析BpDREB2基因在转录水平与一些不同非生物胁迫因子的关系，通过低温(将生长3个月的构树幼苗置于4℃培养)、高盐(将生长3个月的构树幼苗的根系置于250mM的NaCl溶液培养)、干旱(将生长3个月的构树幼苗的根系置于质量百分浓度为20％的PEG6000溶液培养)及脱落酸ABA(将生长3个月的构树幼苗的根系置于100μmol/L ABA溶液培养)对构树幼苗分别进行不同时间处理(0；0.5；3.0；6.0；12.0；24h)。分批取材后，提取总RNA，首先利用Nortern Blot方法分析了BpDREB2基因在各种处理条件下的表达模式。但是，该基因的表达丰度较低，Northern Blot杂交结果无信号或信号很弱。为此，利用RT-PCR方法分析了4种处理条件下BpDREB2基因的表达模式，以Actin基因作为内标，对所有cDNA模板进行半定量。结果如图10，图11，图12和图13所示，图10表明BpDREB2基因在转录水平明显受盐诱导，盐处理0.5h后表达量就迅速提高，随着处理时间的加长，表达量迅速增加，到6h达到最大值，之后表达水平逐渐降低，到24h又基本恢复到原来的表达水平。图11表明在PEG的诱导下，该基因一开始变化比较微弱，然后表达量迅速上升，3至6h达到最高峰，然后又迅速下降。图12和图13表明，在ABA和低温处理下，BpDREB2基因的转录表达基本上没有变化。这表明BpDREB2的转录表达受干旱和盐诱导，而低温和ABA对其不起作用。说明BpDREB2可能通过与ABA信号传导无关途径来提高植物对干旱、盐碱和低温胁迫的耐性。图10，图11，图12和图13中，0、0.5、3.0、6.0、12.0、24分别表示处理0、0.5、3.0、6.0、12.0、24h。

3、BpDREB2同源基因分析

从构树中提取基因组DNA，分别用XbaI、KpnI和SphI三种内切酶酶解，以Digoxigenin标记的BpDREB2cDNA(序列2)为探针进行Southern杂交，结果如图14所示，表明BpDREB2是一个三拷贝基因，即在构树基因组中，还有两个与其同源的基因。

实施例3、利用BpDREB2基因培育抗逆性增强的水稻

1、BpDREB2基因植物表达载体p3301-BI121-PpDREB2的构建

BpDREB2基因植物表达载体p3301-BI121-PpDREB2的构建过程如图15所示，具体过程如下：

用XbaI内切酶将带有BpDREB2基因的pMD18-BpDREB2(实施例1步骤1中构建)载体单酶切，补平，然后自连，从而去掉了pMD18-BpDREB2上的XbaI酶切位点，用SalI和SacI双酶切该质粒，切下来一条1300bp的含有BpDREB2的小片断，相同的酶切质粒pGEX-KG(其构建过程如图16所示)，由于在pGEX-KG上SalI和SacI两个酶切位点相距只有6bp，切下的小片断在琼脂糖凝胶电泳中显现不出来，所以只有一条和原来大小几乎相等的条带，将其与pMD18-BpDREB2切下的小片断相连，获得重组质粒pGEX-KG-BpDREB2。

用XbaI和SacI双酶切质粒pGEX-KG-BpDREB2和植物表达载体p3301-BI121(p3301-BI121的构建过程如图17所示，构建方法如下：分别用HindIII和EcoRI酶切pCAMBIA3301(CAMBIA3301公司)和pBI121，将HindIII和EcoRI酶切pCAMBIA3301得到的载体大片段和HindIII和EcoRI酶切pBI121得到的小片段(3Kb)连接，得到载体p3301-BI121)，将质粒pGEX-KG-BpDREB2切下的1300bp的BpDREB2基因片段，与质粒p3301-BI121切下的11.4kb的大片断相连，获得重组质粒p3301-BI121-BpDREB2，构建成含有BpDREB2完整读码框架的高效植物双元表达载体。对构建好的植物表达载体进行鉴定，以质粒p3301-BI121-BpDREB2为模板，利用基因特异性引物DREB2W-1和DREB2W-2进行PCR扩增，扩增出一条稍大于1300bp的条带，说明BpDREB2基因已连接到载体上(图18，M为MarkerIII；1为p3301-BI121-BpDREB2)。用XbaI和SacI双酶切质粒p3301-BI121-BpDREB2，同样切下一条稍大于1300bp的条带，进一步证明植物表达载体构建正确(图19，M为MarkerIII；1为p3301-BI121-BpDREB2)。将构建好的植物表达载体p3301-BI121-BpDREB2通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105中。

2、培育抗逆性增强的水稻

(1)水稻植株再生体系的建立及筛选剂和筛选浓度的确定

消毒后的日本晴水稻种子在N₆D培养基上黑暗培养2天后开始发芽，5天后开始有愈伤组织出现，2周后，将愈伤组织切下，挑选其中白色或淡黄色的致密而没有水化的小块，将其分成直径为3-5mm的小颗粒置于分化培养基上进行分化培养，15天继代一次，30-40天后，个别状态好的愈伤组织块上出现绿色细胞团，并由此发育为完整植株。

水稻愈伤组织抗生素敏感性实验表明，三种筛选剂中，卡那霉素对水稻愈伤组织生长的抑制作用较弱，在卡那霉素浓度为100mg/L的培养基上，没有明显观察到水稻愈伤组织的生长受到抑制，也没有出现褐化现象。然而，水稻愈伤组织对潮霉素比较敏感，在含有潮霉素的培养基上培养，10天后观察，其中的愈伤组织块明显比对照没有加抗生素的要小，而且，在潮霉素浓度为50mg/L的培养基上，一些愈伤组织开始褐化，2周后，在潮霉素浓度为25mg/L的培养基上也出现褐化的愈伤组织，而在潮霉素浓度为50mg/L的培养基上，褐化的愈伤组织达到40％。水稻愈伤组织对ppt也比较敏感，在ppt浓度为10mg/L的培养基上，10天后，愈伤组织开始褐化，20天后，褐化愈伤组织达到50％，在ppt浓度为5mg/L的培养基上，15天后，愈伤组织开始褐化，20天后，褐化愈伤组织达到30％。由此可见，水稻抗性愈伤组织的筛选采用25-50％的潮霉素和5-10％的ppt比较合适。

(2)农杆菌介导的p3301-BI121-BpDREB2对水稻的转化

水稻种子在N₆D培养基上黑暗培养2周后，切下愈伤组织，挑选其中白色或淡黄色的致密而没有水化的小块，用导入质粒p3301-BI121-BpDREB2的农杆菌EHA105菌液侵染，侵染后的愈伤组织接种于N₆AS培养基(含有300μmol/L乙酰丁香酮的N₆D培养基)上25-28℃下暗培养，3天后，愈伤组织周围出现菌落，洗净愈伤组织，然后转接到ppt浓度为5mg/L的N₆DS1培养基(含有5mg/L ppt的N₆D培养基)上筛选，15天后，少量愈伤组织开始褐化，然后再将愈伤组织转接到ppt浓度为10mg/L的N₆DS2培养基(含有10mg/L ppt的N₆D培养基)上筛选，直到褐化愈伤组织死亡，取出未褐化的具有抗性的愈伤组织，置于无菌滤纸上，25-28℃干燥培养2天，经干燥后的愈伤组织脱水皱缩，再将其转入分化培养基MSR(含有1.0mg/L6-BA的MS培养基)，2天后，皱缩的愈伤组织恢复，15天后，愈伤组织表面出现绿色芽点，待小芽长至5cm时转入生根培养基MS₀(无生长调节物质的MS培养基)上生根。待幼苗长至8-10cm左右时，其根系已比较发达，打开三角瓶封口膜进行温室移栽前的驯化练苗，3天后，将这些苗移栽到温室，共获得阳性植株15株。

(3)盐胁迫实验

将获得的转p3301-BI121-BpDREB2的阳性植株中9株和野生型日本晴植株90株(对照)均分别置于不同质量百分浓度的NaCl(0.3％、0.5％、0.8％)土壤中，其中，每个浓度处理中转基因植株各3株，野生型日本晴植株各90株。在相同条件下培养，结果表明在含盐量为0.3％土壤中，野生型植株和转基因植株均全部可存活，并能抽穗、结实；在含盐量0.5％土壤中，3株转基因植株全部存活，且均能抽穗、结实，而野生型植株在含盐量0.5％土壤中，只有五分之一的植株(6株)能存活，但不能抽穗、结实；在0.8％土壤中，3株转基因植株全部存活，30株野生型植株均不能存活。

(4)干旱胁迫实验

将获得的转p3301-BI121-BpDREB2的阳性植株中5株和野生型日本晴植株50株(对照)，连续20天不浇水实施干旱胁迫。结果表明，野生型植株出现萎焉，而转基因植株只出现轻微的萎焉现象，表明BpDREB2在水稻中表达，不但可增强其耐盐性，还可增强其耐旱性。在经过干旱胁迫处理20天后，开始灌水进行恢复实验。经过3天的浇水恢复，转p3301-BI121-BpDREB2的阳性植株5株明显回复到正常生长水平，但是野生性植株除有一株回复到基本正常状况外，其余植株(49株)均没有回复正常，干旱致死。

序列表

<160>2

<210>1

<211>330

<212>PRT

<213>构树属构树(Broussonetia papyrifera)

<400>1

Met Lys Ala Leu Glu Pro Phe Met Lys Ser Ala His Asn Asn Ile Asn

1 5 10 15

Asn Asn Ile Ser Pro Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Leu Ser

20 25 30

Ser Glu Pro Asn Phe Tyr Pro Glu Ser Glu Thr Cys Ser Pro Ser Thr

35 40 45

Thr Gln Met Phe Ser Ser Gly Leu Phe Ser Ser Phe Asn His Met Gly

50 55 60

Ser Glu Gln Thr Gly Ser Leu Gly Leu Asn Gln Leu Thr Gln Ser Gln

65 70 75 80

Ile Leu Gln Ile Gln Ala Gln Ile Tyr Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln

85 90 95

Gln Gln Asn Leu Leu Met Thr Thr Ile Thr Pro Pro Gln Asn Ser Leu

100 105 110

Asn Tyr Leu Gly Pro Arg Ala Val Pro Met Lys Asn Val Gly Ala Asn

115 120 125

Ser Lys Pro Asn Lys Leu Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg His Trp Gly

130 135 140

Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Pro Lys Asn Arg Thr Arg Leu Trp

145 150 155 160

Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Ala Tyr Asp Lys

165 170 175

Ala Ala Tyr Lys Leu Arg Gly Asp Phe Ala Arg Leu Asn Phe Pro His

180 185 190

Leu Arg His Glu Gly Ala His Val Ser Gly Glu Phe Gly Glu Tyr Lys

195 200 205

Pro Leu His Ser Ser Asp Asp Ala Lys Leu Gln Ala Ile Cys Gln Ser

210 215 220

Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gln Gly Ser Ala Lys Glu Ala Cys Ser Glu

225 230 235 240

Pro Glu Val Lys Pro Val Ile Glu Pro Lys Met Ala Ser Asp Asn Ser

245 250 255

Pro Lys Gly Glu Leu Glu Val Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ser

260 265 270

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Ser Leu Ser Ser Pro Leu Ser Asp Glu Ser

275 280 285

Ser Ala Gly Ser Ser Ser Pro Glu Ser Asp Val Thr Leu Leu Asp Phe

290 295 300

Ser Asp Ser His Trp Asp Gly Asn Glu Asn Phe Gly Leu Gly Lys Tyr

305 310 315 320

Pro Ser Val Glu Ile Asp Trp Asp Ala Leu

325 330

<210>2

<211>1384

<212>DNA

<213>构树属构树(Broussonetia papyrifera)

<400>2

caccacacca gttttctctg atccctttag agaagagctc atgaaagcac ttgaaccttt 60

tatgaaaagt gctcataata atatcaacaa caacatttca ccaatctctt cttcttcctc 120

ttcttcttac ctttctagtg agcccaactt ttaccctgaa tctgaaactt gctcaccttc 180

aactacccaa atgttttcca gtgggttgtt ctccagcttt aaccacatgg gttctgagca 240

gactggttct ttaggcttaa accagctcac ccaatcccag attctccaaa ttcaagccca 300

aatctacttc caacaacaac agcaacagca acaaaatcta ctcatgacca ccataactcc 360

gccccaaaac agcctcaact acctcggtcc gagggcggtt ccgatgaaga acgtcggcgc 420

caattcaaag cccaacaaac tctacagagg agtgaggcag aggcattggg gcaaatgggt 480

cgccgagatc agactcccca agaaccggac ccgcctctgg ctgggcacct tcgacaccgc 540

cgaggaagcc gccttggcct acgacaaggc ggcgtacaag ctccgcgggg acttcgcccg 600

cctcaacttc ccccacctcc gccacgaagg cgcccacgtc tctggcgagt tcggcgagta 660

caagcccctc cattcctccg tcgacgccaa gcttcaggcg atttgccaaa gcctggcgaa 720

ttcgcagaag caggggagtg ccaaggaggc ttgttccgag ccggaggtga agccagtcat 780

cgagcccaag atggcgtccg ataattctcc gaaaggcgaa ttggaggtgt cgtcttcgtc 840

gttgtcgtcg tcgtcgtcgt tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtcgccgt tgtcggatga 900

gtcttcggcg gggtcatcct cgccggagtc cgatgtcacg ttgttggact tctcggattc 960

tcattgggat gggaatgaga attttgggct agggaagtac ccttcagtgg agatcgactg 1020

ggatgctctg tgatcgtaat aaatgttggt tatgttgtca ttttctcttt tttatttttc 1080

ctgcgttatt agttgttttt aaggtttttt tttttagttg tacaagcacg gcttctgcga 1140

tggaattttt aacatggcag gggtttagct cagtttttta aatttaggaa gggtcagtaa 1200

gtcagtcagt cagtcagatg tttttatgtt gtaatatttg atgtcgtttg atatctccta 1260

tgttggtcag ctggtagttt ttttccttgc taggcctggc catgggagat ctctctgggt 1320

tgtatttact actttttgaa tgtaattagg caagtctact ttatataaaa aaaaaaaaaa 1380

aaaa 1384

Claims

1、植物DREB转录因子，是序列表中SEQ ID №：1所示的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于：所述序列表中SEQ ID №：1的自氨基端第134-197位氨基酸残基为AP2/EREBP结构域。

3、编码权利要求1所述植物DREB转录因子的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因是序列表中SEQ ID №：2所示的DNA序列。

5、含有权利要求3或4所述植物DREB转录因子基因的植物表达载体。

6、含有权利要求3或4所述植物DREB转录因子基因的细胞系。

7、含有权利要求3或4所述植物DREB转录因子基因的宿主菌。

8、权利要求1或2所述的植物DREB转录因子及其编码基因在调控构树或水稻抗逆性中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述调控构树或水稻抗逆性为增强其抗逆性。