CN1772764A - 一个水稻dreb类转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个水稻DREB类转录因子及其编码基因与应用。其目的是提供一个来源于水稻EREBP/AP2家族的DREB类转录因子及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。该转录因子是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。通过转基因技术，将本发明的基因导入植物宿主，可得到抗干旱、高盐等逆境胁迫能力增强的转基因植物(作物)，并可培育出抗霉雨诱导的在穗发芽的新品种；另一方面，由于ABA是诱导果实脱落的主要激素，因而该基因也可用于防止果实脱落等分子育种中。本发明在农业领域具有重要的应用前景。

Description

一个水稻DREB类转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物中一种与胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及及一个来源于水稻EREBP/AP2家族的DREB类转录因子及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。

背景技术

干旱、盐碱和寒冷等环境胁迫严重影响植物的生长与发育，常使农作物大面积减产。植物激素脱落酸(Abscisic Acid，ABA)是诱导果实脱落的主要激素，也是一类重要的信号因子，在提高植物对环境胁迫的耐受性方面起到重要作用。ABA含量增加，可诱导植物产生适应于胁迫的生理和分子方面的变化，例如关闭气孔以阻止水分进一步地散失，加强根部吸收水分的能力，细胞膜功能的变化，以及通过激活转录因子或转录调节因子而诱导功能基因的表达等，从而使植物的耐胁迫性提高(Moons等，planta，1997，202：443-454)。最新的分子生物学研究表明，大多数与胁迫相关基因的表达受外源ABA的诱导，证明胁迫基因和脱落酸信号途径存在明显的交叉。尽管目前人们对于胁迫信号传导途径的了解还不完全，但可以肯定ABA是一个主要的生理信号或″胁迫激素″，在相关基因对胁迫的响应中发挥着重要作用。

近几年，国际上已克隆了一些参与胁迫信号传导的转录因子基因，如MYB，MYC，bZIP和DREB/CBF等，其中干旱应答元件结合蛋白DREB/CBF(dehydration-responsiveelement binding proteins/c-repeat binding factors)是植物特异的转录因子乙烯应答元件结合蛋白EREBP/AP2(ethylene responsive element bindingprotein/APETALA2)家族的亚家族，其显著特征是含有高度保守、由大约60个氨基酸残基组成的DNA结合域，即所谓的AP2结构域(AP2 domain)，而该结构域以外的其它序列缺少明显的相似性。AP2结构域包含两个特别保守的元件，分别被命名为YRG元件和RAYD元件(Weigel等，Plant Cell，1995，7(4)：388-389；OKAMURO等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：7076-7081)。EREBP/AP2家族在拟南芥中有144个成员，估计在水稻中的数目也大致相同。近年来，已从拟南芥等模式植物中克隆了一些DREB亚家族转录因子的基因，它们在抗逆中的重要性正逐渐被认识。例如，利用酵母单杂交技术，从拟南芥中分离出两个DREB类基因，DREB1A(CBF3)和DREB2A(Liu等，PlantCell，1998，10：1391-1406)。DREB1A受低温胁迫诱导表达，而DREB2A受干旱胁迫诱导表达。这两个基因编码的蛋白均能与抗旱相关基因rd29A启动子区的DRE元件结合并激活rd29A的表达。在转基因拟南芥中，DREB1A超表达可显著提高转基因植株抗干旱和寒冷的能力。这类DREB蛋白是不依赖于ABA的胁迫信号传导链的重要组成部分。

此外，近期在对拟南芥EREBP/AP2类转录因子的研究中，克隆到了几个受ABA诱导表达的DREB基因，如拟南芥的DREB1A，DREB1B，DREB1C和DREB1D(Knight等，PlantPhysiology，2004，135：1710-1717)。DREB1D在转基因拟南芥中超表达，可激活含有DRE/CRT元件的、与抗寒冷和干旱相关基因的表达(Haake等，Plant physiology，2002，130：639-648)。ABI4是一个受ABA诱导表达的、编码DREB转录因子的基因(Ruth R.Finkelstein等，Plant Cell，1998，10：1043-1054；Soderman等，Plant Physiology，2000，124：1752-1765)。abi4的缺失突变体对脱落酸抑制萌发的作用不敏感，而ABI4的异位表达，则导致根部的生长对脱落酸抑制作用更加敏感。在独立筛选的拟南芥抗盐突变体中，发现了ABI4位点的突变体(Quesada等，Genetics，2000，154：421-436)，表明上述基因在植物的抗逆反应中起到重要作用。

进一步的转基因实验证明DREB类转录因子基因在植物的抗逆分子育种中具有较大的实际意义和广阔的应用前景。如由烟草花叶病毒CaMV 35S启动子驱动拟南芥DREB1B在转基因烟草中表达，提高了转基因烟草抗冷冻胁迫的能力(Jaglo-Ottosen等，Science，1998 Apr 3，280(5360)：104-6)。超表达DREB1A的转基因拟南芥与野生型植株相比，具有更强的耐干旱、盐和冷冻胁迫的能力(Liu等，Plant Cell，1998，10，1391-1406)。超表达DREB1D显著提高转基因拟南芥的的干旱耐性(Haake等，Plant Physiology，2002，130：639-648)。

Dubouzet等(Plant Journal，2003，33：751-763)从水稻中分离了5个DREB类基因(OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，OsDREB1D和OsDREB2A)。其中OsDREB1A和OsDREB1B的表达受寒冷诱导，而OsDREB2A的表达受干旱和高盐诱导。OsDREB1A的超表达导致转基因植物与野生型植株相比，对干旱、高盐和冷冻胁迫具有更高的耐受性，表明EREBP/AP2转录因子中的DREB亚家族成员在水稻的抗逆反应中同样发挥着重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一个可受脱落酸诱导表达的水稻EREBP/AP2家族的DREB类转录因子及其编码基因。

本发明所提供的DREB类转录因子，名称为ARAG1，来源于稻属水稻(Oryza sativaL.ssp.japonica)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由225个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第47位-第113位氨基酸残基为保守的AP2结构域，自氨基端第50位-第52位氨基酸残基为AP2结构域中保守的YRG元件，自氨基端第87位-第90位氨基酸残基为AP2结构域中保守的RAYD元件，自氨基端第62位为DBEB类转录因子特别保守的缬氨酸(V14)，自氨基端第67位为DBEB类转录因子特别保守的谷氨酸(E19)，自N端第37位-第43位氨基酸残基为核定位序列，自N端第11位-第31位氨基酸残基为富含丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的转录激活域。

编码水稻DREB类转录因子ARAG1的基因(ARAG1)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液中，65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由678个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-678位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第139到第339位碱基为AP2保守结构域的编码序列，自5’端第148到156第位碱基编码AP2结构域中保守的YRG元件，自5’端第259到第270位碱基编码AP2结构域中保守的RAYD元件，自5’端第184到第186位碱基编码DBEB类转录因子特别保守的缬氨酸(V14)，自5’端第199到第201位碱基编码DBEB类转录因子特别保守的谷氨酸(E19)，自5’端第109到第129位碱基编码核定位序列，自5’端第31到第93位碱基为编码富含丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的转录激活域。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增ARAG1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。

本发明所提供的提高植物耐旱性的方法，是将所述水稻DREB类转录因子ARAG1基因导入植物组织或细胞，得到耐逆性提高的植物。

所述水稻DREB类转录因子ARAG1基因可通过含有所述水稻DREB类转录因子ARAG1基因的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)。

使用ARAG1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

以pCAMBIA 1302为出发载体，构建的含有所述水稻DREB类转录因子ARAG1基因的植物表达载体为p1302-35s-ARAG1-GFP。

携带有本发明ARAG1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、拟南芥、玉米或棉花等。

本发明提供了一个来源于水稻EREBP/AP2家族的DREB类转录因子。实验证明，其编码基因ARAG1可受脱落酸诱导表达，经低浓度的ABA处理30分钟，可将该基因的表达量(以转录本判断)提高3倍以上。此外，干旱、高盐等逆境胁迫也能诱导该基因表达。利用ARAG1的反义基因载体敲除(抑制)内源ARAG1的表达，显著增加了转基因植株对ABA的敏感性。利用基因超表达载体增加该基因在体内的表达量，可显著提高转基因植株对干旱、高盐等逆境胁迫的耐性。因此，通过转基因技术，将本发明的基因导入植物宿主，可得到抗干旱、高盐等逆境胁迫能力增强的转基因植物(作物)，并培育出抗霉雨诱导的在穗发芽的新品种，如对在水饱和介质中生长至3叶期的野生型对照与ARAG1超表达的转基因植株，进行干旱处理(缺水)9天，对照幼苗完全死亡，而超表达ARAG1的转基因植株的幼苗约有50％仍能存活；另一方面，由于ABA是诱导果实脱落的主要激素，因而该基因也可用于防止果实脱落等分子育种中。本发明在农业领域具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为RT-PCR半定量法分析ARAG1在水稻不同器官中表达特性的结果

图2为RT-PCR半定量法分析受低温、ABA和干旱短时间胁迫诱导后ARAG1表达特性的结果

图3A为RT-PCR半定量法分析受不同浓度ABA(2、10、50和100μM)处理0.5h后ARAG1表达特性的结果

图3B为RT-PCR半定量法分析受不同浓度ABA(2、10、50和100μM)处理1h后ARAG1表达特性的结果

图3C为RT-PCR半定量法分析受不同浓度ABA(2、10、50和100μM)处理2h后ARAG1表达特性的结果

图3D为RT-PCR半定量法分析受不同浓度ABA(2、10、50和100μM)处理4h后ARAG1表达特性的结果

图4为RT-PCR半定量法分析受不同时间干旱(0.5、1、2和3h)处理后ARAG1表达特性的结果

图5为半定量RT-PCR法检测ARAG1反义转基因植株中内源ARAGl表达水平的结果

图6为Western blot检测ARAG1反义转基因植株中内源ARAG1蛋白表达水平的结果

图7为半定量RT-PCR法检测ARAG1超表达转基因植株中内源ARAG1表达水平的结果

图8为Western blot检测ARAG1超表达转基因植株中内源ARAG1蛋白表达水平的结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生工合成。

实施例1、编码水稻DREB类转录因子ARAG1的基因(ARAG1)的cDNA全长序列的获得、ARAG1的分子结构分析及该基因在水稻基因组中的拷贝数分析

一、编码水稻DREB类转录因子ARAG1的基因(ARAG1)的cDNA全长序列的获得

1、RNA的提取及第一链cDNA的合成

用Trizol试剂盒(GIBICO-BR公司)分别从水稻颖花中提取总RNA，随后用无RNase的DNase(TaRaKa公司)除去RNA中残留的DNA，得到无DNA污染的RNA。参照Ding等的方法(Ding等，Sexual Plant Reproduction，2002，15：205-212)合成第一链cDNA。反应体系及反应条件为：将5μg RNA和0.5μg oligo-dT₁₅引物混合，加无菌水使混合物体积达12μl，70℃保温10分钟，转至冰浴中，加入4μl5X第一链缓冲液，1μl10mM dNTPs，2ul 0.1mM DTT，42℃预热2分钟后，加入1μl SuperScript II RNA水解酶H^-逆转录酶(200U/μl，GIBCO-BRL公司)，42℃反应50分钟，合成第一链cDNA，最后70℃加热15分钟，使逆转录酶失活。

二、ARAG1 cDNA全长序列的获得

以拟南芥EREBP基因的核苷酸序列为探针，在NCBI水稻数据库中进行TBLAST搜索，发现一段位于水稻第二条染色体上的DNA序列(GenBank号：AJ307662，自5’端第305291位-第305968位碱基)。该序列编码的蛋白含有一个AP2结构域，和拟南芥中控制胁迫诱导转录因子DREB1A的AP2结构域氨基酸残基序列的相似性达73％。将该基因命名为ARAG1。根据该段DNA序列设计引物PCR扩增ARAG1的cDNA序列，引物序列如下：

wp231f(正义引物)：5’-AT CCATGGACGACTCGTCGTTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nco I的识别位点)；

wp231r(反义引物)：5’-CG ACTAGTGTAGTACTCCCACAGAAGTG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Spe I的识别位点)

以步骤一合成的第一链cDNA为模板，在引物wp231f和引物wp231r的引导下，PCR扩增扩增ARAG1的cDNA序列。50μl PCR反应体系为：25μl 2×GC PCR buffer，2μl 10mM dNTPs，2μl 10μM wp231F引物，2μl 10μM wp231R引物，1.5μl第一链cDNA，1μl LA Taq酶(大连Takara生物公司)。PCR反应条件为：先94℃1min；然后94℃30秒，55℃30秒，72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约678bp的目的片段，将其克隆到载体pGEM-T(Promega公司)中，筛选阳性克隆，进行测序，将含有ARAG1cDNA序列的重组质粒载体命名为ARAG1-pGEM-T，测序结果表明ARAG1具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：2由678个碱基组成，碱基“GC”的含量高达73％，其编码序列为自5’端第1-678位碱基，编码具有序列表中SEQ ID№：2的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第139到第339位碱基为AP2保守结构域的编码序列，编码22个氨基酸，自5’端第148到第156位碱基为AP2保守结构域的YRG元件的编码序列，自5’端第259到第270位碱基为AP2保守结构域的RAYD元件的编码序列，自5’端第109到第129位碱基编码核定位序列，自5’端第184到第186位碱基为缬氨酸的编码序列，自5’端第199到第201位碱基为谷氨酸的编码序列，将ARAG1编码的蛋白质命名为ARAG1。

三、ARAG1编码蛋白ARAG1的分子结构分析

经推测ARAG1所编码的蛋白质ARAG1的分子量是23.1kD，等电点(PI)为5.0。通过与国际数据库Genbank/DDBJ/EMLK联网，将ARAG1的氨基酸残基序列与已知的拟南芥的TINY、DREBs/CBFs，水稻的OsDREB1A、OsDREB2A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D以及玉米的DBF2等AP2/EREBP蛋白的氨基酸残基序列用BLAST软件进行同源性分析。结果ARAG1与上述AP2/EREBP蛋白只在AP2结构域具有较高的相似性，其AP2结构域与玉米DBF2和拟南芥TINY、DREB1DAP2结构域的相似性分别达到93％、81％和73％。ARAG1的AP2结构域包含了AP2结构域中特别保守的YRG和RAYD元件，自氨基端(N端)第50位-第52位氨基酸残基为AP2结构域中保守的YRG元件，自氨基端第87位-第90位氨基酸残基为AP2结构域中保守的RAYD元件，以及DBEB类转录因子共有的几个特别保守的氨基酸，如自氨基端第62位缬氨酸(V14)和自氨基端第67位的谷氨酸(E19)，表明ARAG1是DREB亚家族的成员。而ARAG1与上述AP2/EREBP蛋白在其它区域的相似性很低，其全长氨基酸残基序列与玉米DBF2和拟南芥TINY、DREB1D氨基酸残基序列的一致性分别仅为45％，38％和35％，与其它已克隆的DREB蛋白氨基酸残基序列的一致性低于35％，表明ARAG1是一个新的DREB类蛋白。蛋白质的一级结构分析结果表明，紧邻AP2结构域的上游，自N端第37位-第43位氨基酸残基为核定位信号；而在N末端和C末端分别具有富含丝氨酸、苏氨酸和酸性氨基酸残基的区域，可能作为转录激活域起作用，其中，自5’端第37到第93位碱基为富含丝氨酸的编码序列，自5’端第31到第36位碱基为苏氨酸的编码序列。

四、ARAG1在水稻基因组中的拷贝数分析

确定ARAG1在水稻基因组中的拷贝数，具体方法为：提取水稻的基因组DNA，分别用限制性内切酶BamHI、Kpn I、Sac I和Sal I对其进行完全酶切，然后用α-³²P dCTP标记的ARAG1的全长cDNA作探针与上述酶切产物进行Southern blot杂交。已知上述四种限制性内切酶均在探针ARAG1的cDNA上没有切点，结果BamHI、Sac I和Sal I都有三条杂交带，表明ARAG1在水稻基因组中存在三个拷贝。对ARAG1的cDNA序列在NCBI上进行TBLATN分析，结果在基因组数据库中检索到包含有ARAG1的另外两个BAC克隆，分别为位于水稻第二条染色体上OJ1112_F09(GenBank号：AP005289)和位于水稻第四条染色体上的OSJNBb0034G17(GenBank号：AL663000)。对ARAG1 cDNA和上述两个BAC克隆所编码蛋白的氨基酸残基序列进行相似性分析，结果两个BAC克隆的编码蛋白与ARAG1氨基酸残基序列的相似性分别为65％和39％，AP2结合域的相似性分别达到97％和93％，且基因序列中都不含内含子，将上述两个BAC克隆的基因分别命名为ARAG1.1和ARAG1.2。

实施例2、ARAG1的体外表达及其多克隆抗体的制备

一、ARAG1的体外表达

在GenBank中对ARAG1的cDNA序列做BLAST分析，选取特异性最强的片段(自5’端第408位-第680位碱基)用于原核表达载体的构建。具体方法为：首先据此特异性片段设计一对PCR扩增引物，引物序列如下：

wp324F(5’端引物)：5’-ACT GAATTCGGCCTCCTCCGCCAATGC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I的识别位点)；

wp324R(3’端引物)：5’-CGA CTCGAGTTGTAGTACTCCCACAGAAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Xho I的识别位点)

然后，以重组质粒载体ARAG1-pGEM-T为模板，在引物wp324F和引物wp324R的引导下，PCR扩增该片段，并在片段两端分别引入限制性内切酶EcoR I和Xho I的识别位点，50μl PCR反应体系为：25μl 2×GC PCR buffer，2μl 10mM dNTPs，2μl 10μM wp324F引物，2μl 10μM wp324R引物，1μl质粒载体ARAG1-pGEM-T，1μl LA Taq酶(大连Takara生物公司)。PCR反应条件为：先94℃1min；然后94℃30秒，55℃30秒，72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，回收并纯化约273bp的PCR产物，对其用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切产物与经同样酶双酶切的载体pGEX-4T-3(Amersham公司)连接，得到含有ARAG1的重组表达载体，命名为pGEX-ARAG1。用CaCl₂法将融合表达载体pGEX-ARAG1转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将筛选出的阳性克隆送基康公司测序，得到正确转化有pGEX-ARAG1的阳性重组子，用于ARAG1的原核表达。挑取阳性重组子，将其接种于LB液体培养基中，在37℃下振荡培养，再将处于对数期的培养物中加入IPTG至终浓度为1mM，诱导ARAG1的表达，再在相同条件下继续培养4小时。培养结束后，离心收集菌体，通过溶菌酶裂解菌体(具体方法参见文献：Worrall，Methods Mol Biol 1996，59：31-7)，对裂解物进行12％SDS-PAGE检测，结果经IPTG诱导表达了约37KD的蛋白，与预期结果相符，回收目的蛋白并对其进行纯化，得到融合蛋白GST-ARAG1。

二、ARAG1多克隆抗体的制备

将步骤一获得的经纯化的融合蛋白GST-ARAG1与弗氏佐剂混合后，对新西兰大白兔用肌肉注射的方式进行免疫(具体方法参见文献：Hanly等，ILAR J 1995，37：93-118)，经多次加强免疫后，得到ARAG1的多克隆抗血清，经纯化后得到ARAG1的多克隆抗体。

实施例3、ARAG1在水稻不同器官的表达特性分析及其受ABA和干旱胁迫诱导后的表达特性分析

一、ARAG1在水稻不同器官的表达特性分析

通过半定量RT-PCR的方法分析基因ARAG1在水稻不同器官的表达特性。用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取分别来源于水稻颖花、叶、幼芽、初生根、正在发育的种子、成熟的种子和正在萌发的种子的总RNA并合成各自第一链cDNA，反应体系及反应条件为：将5μg RNA和0.5μg oligo-dT15引物混合，加无菌水使混合物体积达12μl，70℃保温10分钟，转至冰浴中，加入4μl 5X第一链缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2ul 0.1mM DTT，42℃预热2分钟后，加入1μl SuperScript II RNA水解酶H-逆转录酶(200U/μl，GIBCO-BRL公司)，42℃反应50分钟，合成第一链cDNA，最后70℃加热15分钟，使逆转录酶失活。然后分别以上述不同器官的第一链cDNA为模板，在ARAG1的特异性引物wp231f和wp231r的引导下，进行PCR扩增，以水稻微管蛋白基因tubulin A(tub.A)作对照(引物序列参见文献：Ding等，Sex Plant Reprod，2001，13：285-288)。50μl PCR反应体系为：1μl第一链cDNA，10pmoles引物wp231f，10pmoles引物wp231r，200μM dNTPs，2X GC PCR缓冲液25μl和2.5U的LA Taq聚合酶(大连Takara公司)。PCR反应条件为：先94℃1分钟；再94℃40秒，55℃30秒，72℃1分钟，共进行30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收678bp的PCR扩增产物。RT-PCR分析结果如图1所示(泳道B、F、L、R、I、D、G分别表示ARAG1在水稻的芽、颖花、叶、根、未成熟种子、干种子和正在萌发的种子不同器官的中的表达情况；tubulin A基因做对照；以不同器官的RNA做量参)，结果ARAG1在水稻的颖花和初生根中优势表达，在叶和幼芽中几乎不表达，做进一步地分析结果，ARAG1在正处于发育阶段的种子的胚中表达，而在成熟的种子中不表达，然而当成熟的种子重新处于萌发阶段的时候，ARAG1重新开始表达。

二、ARAG1受ABA和干旱胁迫诱导后的表达特性分析

1、ARAG1受低温、ABA和干旱短时间胁迫诱导后的表达特性分析

将正常萌发一周的水稻幼苗，分成三个大组，分别用4℃的低温、100μM脱落酸(ABA)和干旱(将水稻幼苗置于滤纸上)短时间处理30min，以野生型水稻为对照(WT，不作任何处理)，处理结束后，剪取幼苗的根各100mg，用Trizol试剂盒提取经不同胁迫处理植株的总RNA，按照与步骤一相同的方法分析ARAG1经短时间低温、ABA和干旱胁迫处理的表达特性，同样用水稻微管蛋白基因tubulin A做对照，每组重复三次，用2DE Image Master 2002.01软件分析各条带，将数据取平均值±SD，电泳及数据分析结果如图2所示(WT、D、A、C分别表示野生型对照、经干旱处理植株、经ABA处理植株和经冷处理植株)，在100μM ABA胁迫下，ARAG1的表达水平在短时间内(30min)成倍地增加，干旱胁迫的诱导作用虽然不如ABA那样显著，但ARAG1的表达量也有较大幅度的增加，然而在4℃低温胁迫下，ARAG1的表达水平在短时间内几乎没有什么变化。用下述实验对ARAG1受ABA和干旱胁迫诱导后表达特性的做进一步分析。

2、ARAG1受ABA和干旱短时间胁迫诱导后表达特性的进一步分析

将正常萌发一周的水稻幼苗，分成二个大组，组一再按ABA处理时间分成4个小组，分别用2、10、50和100μM ABA处理0.5、1、2和4h，以野生型水稻为对照(WT，不作任何处理)；组二按干旱处理时间分成4个小组，每组分别进行干旱处理0.5、1、2和3h，以野生型水稻为对照(WT，不作任何处理)，用与步骤1相同的方法分析经不同浓度和不同时间ABA处理和不同时间干旱胁迫处理后ARAG1的表达特性，以水稻微管蛋白基因tubulin A做对照，每组重复三次，用2DE Image Master 2002.01软件分析各条带，将数据取平均值±SD。经不同浓度和不同时间ABA处理后ARAG1表达特性的电泳及数据分析结果如图3A-图3D所示(图3A为用2、10、50和100mM ABA处理0.5小时的结果，图3B为用2、10、50和100mM ABA处理1小时的结果，图3C为用2、10、50和100mM ABA处理2小时的结果，图3D为用2、10、50和100mM ABA处理4小时的结果，WT表示野生型对照)，当ABA的处理时间为0.5h时，随着的ABA处理浓度从2μM增加到100μM，ARAG1的表达量也随之增加，两者呈现出线性关系；当材料的ABA处理时间延长到60分钟时，在2μM ABA处理的水稻根部，ARAG1的表达量稍有增加，在经10μM ABA处理的水稻根部，ARAG1的表达量持续增加，然而在50和100μM ABA处理的水稻根部，ARAG1的表达量随着时间的延长逐步下降，浓度越高，下降越快；当ABA处理的时间延长到2小时的时候，ARAG1的表达量迅速下降；ABA处理的时间到4小时的时候，ARAG1的表达量基本恢复到与野生型植株一致的水平，证明ARAG1的表达受ABA的反馈抑制。经不同不同时间干旱胁迫处理后ARAG1表达特性的电泳及数据分析结果如图4所示(0.5、1、2、3分别表示经0.5、1、2、3小时干旱处理的结果，WT表示野生型对照)，结果表明ARAG1对干旱胁迫的响应也具有明显的时间特性。随着干旱处理的时间延长，ARAG1的表达量也逐渐增加，在经干旱处理1小时后，ARAG1的表达量达到高峰，以后随着处理时间的延长，ARAG1的表达量逐渐下降，证明ARAG1的表达同样受到于旱胁迫的反馈抑制。

实施例4、转化有ARAG1反义基因的转基因水稻的获得及内源ARAG1表达水平的检测

一、转化有ARAG1反义基因的转基因水稻的获得及分子检测

1、ARAG1反义载体的构建

依据ARAG1的cDNA序列，设计一对引物PCR扩增ARAG1的反义基因，引物序列如下：wp62f(正义引物)：5’- GAGCTCTCTTTCCACGTCGCGAGAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I的识别位点)；

wp62r(反义引物)：5’- TCTAGACGGGTTGTACATGCAGGCT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Xba I的识别位点)

然后，以水稻基因组DNA为模板，在引物wp62f和引物wp62r的引导下，PCR扩增ARAG1的反义基因，并在基因序列两端分别引入限制性内切酶Sac I和Xba I的识别位点，50ul PCR反应体系为：2X PCR缓冲液25μl，1ul水稻基因组DNA(100ng)，10pmoles正义引物wp62f，10pmoles反义引物wp62r，200uM dNTPs，2.5单位LA Taq DNA聚合酶(5U/ul，大连Takara生物公司)。PCR反应条件为：先94℃1分钟；再94℃40秒，55℃30秒，72℃30秒，共进行30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，回收并纯化约974bp的PCR产物，对其用限制性内切酶Xba I和Sac I进行双酶切，将酶切产物与经同样酶双酶切的含有CaMV 35s启动子的载体pBI121(CLONTECH公司)用T4 DNA连接酶连接，得到含有ARAG1反义基因的重组载体，命名为pBI121-ARAG1。最后对pBI121-ARAG1用限制性内切酶EcoR I和HindIII进行双酶切，将酶切产物(含有CaMV 35s启动子和ARAG1反义基因片断)与经同样酶双酶切的植物表达载体pCAMBIA1301(CAMBIA公司)用T4 DNA连接酶连接，得到含有ARAG1反义基因的重组植物表达载体，命名为p1301-35s-ARAG1。

2、获得转化有ARAG1反义基因的转基因水稻

将含有ARAG1反义基因的重组植物表达载体p1301-35s-ARAG1通过冻融法转化农杆菌EHA105，长出菌斑后挑取农杆菌转化克隆提质粒，用PCR的方法做鉴定，引物为ARAG1特异引物wp62f和wp62r。然后进一步用ARAG1的5’端引物wp62f和35S启动子特异引物(5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’)进行PCR鉴定。将鉴定出的阳性克隆用农杆菌介导法转化水稻的愈伤组织，经50ug/mL潮霉素抗性筛选，得到转化有p1301-35s-ARAG1的水稻愈伤组织。经培养、再生后获得转化有ARAG1反义基因的转基因水稻幼苗(具体的转化及培养方法可参阅文献：Hiei等，Plant J 1994，6：271-282)。

3、转化有ARAG1反义基因的转基因水稻的检测

对步骤2获得的转基因植株通过微量法提取基因组DNA，并以此为模板，在潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase)基因特异引物WP148F(5’-TGCTGCTCCATACAAGCCAACC-3’)和引物WP148R(5’-AAGACCTGCCTGAAACCGAACT-3’)的引导下，进行PCR检测，可扩增出约470bp片段的为转基因阳性株系，进而利用α-32P-dCTP标记的潮霉素片断为探针对经PCR鉴定为阳性的转基因株系进行Southern杂交确认。对经上述方法鉴定为转化有ARAG1反义基因的株系用GUS染色法进一步确定，得到转化有ARAG1反义基因的转基因水稻。

二、ARAG1反义转基因植株中内源ARAG1表达水平的检测

1、半定量RT-PCR法检测ARAG1反义转基因植株中内源ARAG1的表达水平

选取四株步骤一获得的阳性ARAG1反义转基因株系，分别命名为R1、R3、R9、R10，用半定量RT-PCR的方法对其内源ARAG1的表达水平进行分析。具体方法为：提取阳性ARAG1反义转基因株系的总RNA，经逆转录得到的第一链cDNA，再以此为模板，分别在ARAG1反义片段的内部引物wp231f及wp231r，以及引物wp231f和WP261R(5’-ATTCTTTTGGTCATGCGTGGAA-3’)的引导下，PCR检测转基因植株中整合的ARAG1反义基因片段的转录情况及ARAG1在植株中的整体转录情况，以tubulin A(引物序列为Tub1：5’-TCAGATGCCCAGTGACAGA-3’和Tub2：5’-TTGGTGATCTCGGCAACAGA-3’)和水稻野生型植株为对照，每组重复三次，用2DE Image Master 2002.01软件分析各条带，将数据取平均值±SD。检测结果如图5所示(1为用引物wp231f及wp231r检测反义ARAG1的表达量，2为用引物wp231f和WP261R检测在转基因植株中的ARAG1的总体表达量；R1、R3、R9、R10分别表示步骤一获得的ARAG1反义转基因株系R1、R3、R9、R10，WT为水稻野生型植株)，表明阳性ARAG1反义转基因株系中内源ARAG1的表达水平与对照相比明显降低。

2、Western blot检测ARAG1反义转基因植株中内源ARAG1蛋白的表达水平

用Western blot法检测ARAG1蛋白的表达情况，以tubulin A作为定量对照，具体方法为：按照Salekdeh等(Proteomics 2002，2：1131-1145)的方法提取阳性ARAG1反义转基因株系的总蛋白，用12％的SDS-PAGE电泳对总蛋白进行分离(Laemmli，Nature 1970，227：680-685)，将胶上的蛋白通过半干法以1mA/cm2稳流转移到PVDF膜上(转膜液：10mM CAPS，10％(v/v)甲醇)，转膜时间为2小时。将膜在封闭液(含3％BSA的TBS缓冲液(TBS缓冲液：20mM Tris-Cl pH7.5，150mM NaCl))中封闭2小时，然后将膜在含有ARAG1多克隆抗体(实施例2制备)(1∶10000稀释)的杂交液(成分与封闭液相同)中37℃温育1小时，用TTBS(0.05％Tween-20，20mM Tris-ClpH7.5，150mM NaCl)洗膜3次，每次5分钟。然后将膜转移到含有碱性磷酸酶标记的羊抗兔的二抗(1∶2000稀释，华美公司)杂交液中37℃温育1小时，用TTBS洗膜3次，每次5分钟，然后在TBS(20mM Tris-Cl pH7.5，150mM NaCl)缓冲液中洗两次，每次5分钟。最后用NBT/BCIP显色液(华美公司)显色，检测杂交信号。结果如图6所示(R1、R3、R9、R10分别表示步骤一获得的ARAG1反义转基因株系R1、R3、R9、R10，WT为水稻野生型植株)，表明阳性ARAG1反义转基因株系中ARAG1蛋白的表达水平与对照相比也显著降低。

实施例5、ARAG1超表达转基因水稻的获得及内源ARAG1表达水平的检测

一、ARAG1超表达转基因水稻的获得及分子检测

1、ARAG1超表达载体的构建

以实施例1构建的含有ARAG1 cDNA序列的质粒载体ARAG1-pGEM-T为模板，在引物实施例1中的引物wp231f和引物wp231r的引导下，PCR扩增ARAG1的全长cDNA，并在基因序列两端分别引入限制性内切酶Nco I和Spe I的识别位点，50ul PCR反应体系为：2X PCR缓冲液25μl，1ul ARAG1-pGEM-T质粒(50ng)，10pmoles正义引物wp231f，10pmoles反义引物wp231r，200uM dNTPs，2.5单位LA Taq DNA聚合酶(5U/ul)。PCR反应条件为：先94℃2分钟；再94℃40秒，55℃30秒，72℃1分钟，共进行30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，回收并纯化约678bp的PCR产物，对其用限制性内切酶Nco I和Spe I进行双酶切，将酶切产物与经同样酶双酶切的含绿色荧光蛋白基因GFP的载体pCAMBIA 1302(CAMBIA，Canberra，Australia)用T₄ DNA连接酶连接，得到在植物中超表达ARAG1的重组载体，命名为p1302-35s-ARAG1-GFP，其中ARAG1与GFP构成融合基因。

2、ARAG1超表达转基因水稻的获得

将ARAG1的植物超表达载体p1302-35s-ARAG1-GFP通过冻融法转化农杆菌EHA105，长出菌斑后挑取农杆菌转化克隆提质粒，用PCR的方法做鉴定，引物为ARAG1特异引物wp231f和wp231r。将鉴定出的阳性克隆用农杆菌介导法转化水稻的愈伤组织，经50ug/mL潮霉素抗性筛选，得到转化有p1302-35s-ARAG1-GFP的水稻愈伤组织。经培养、再生后获得转化有ARAG1超表达载体p1302-35s-ARAG1-GFP的转基因水稻幼苗(具体的转化及培养方法可参阅文献：Hiei等，Plant J 1994，6：271-282)。

3、ARAG1超表达转基因水稻的分子检测

对步骤2获得的转基因植株通过微量法提取基因组DNA，并以此为模板，在潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase)基因特异引物WP148F(5’-TGCTGCTCCATACAAGCCAACC-3’)和引物WP148R(5’-AAGACCTGCCTGAAACCGAACT-3’)的引导下，进行PCR检测，可扩增出约470bp片段的为转基因阳性株系，进而利用α-32P-dCTP标记的潮霉素片断为探针对经PCR鉴定为阳性的转基因株系进行Southern杂交确认，得到ARAG1超表达转基因水稻。

二、ARAG1超表达转基因植株中内源ARAG1表达水平的检测

1、半定量RT-PCR法检测ARAG1超表达转基因植株中内源ARAG1的表达水平

选取三株步骤一获得的阳性超表达ARAG1转基因株系，分别命名为G2、G5、G8，用半定量RT-PCR的方法对其内源ARAG1的表达水平进行分析，具体方法为：提取阳性ARAG1反义转基因株系的总RNA，经逆转录得到的第一链cDNA，再以此为模板，分别在ARAG1引物wp231f和wp231r，以及GFP基因特异引物wp161F(5’-GGTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAG-3’)和Wp161R(5’-ATGAGCTCACTGCAGGTCTGGACA-3’)的引导下，PCR检测转基因植株中ARAG1的整体转录情况及转基因植株中GFP的整体转录情况，以tubulin A(引物序列为Tub1：5’-TCAGATGCCCAGTGACAGA-3’和Tub2：5’-TTGGTGATCTCGGCAACAGA-3’)和水稻野生型植株为对照，每组重复三次，用2DEImage Master 2002.01软件分析各条带，将数据取平均值±SD。检测结果如图7所示(1为用引物wp231f和wp231r检测ARAG1的表达量，2为用引物wp161F和wp161R检测在转基因植株中GFP的总体表达量；G2、G5、G8分别表示步骤一获得的ARAG1超表达转基因株系2、5、8，WT为水稻野生型植株)，表明阳性ARAG1超表达转基因株系的内源ARAG1的表达水平与对照相比明显增加。

2、Western blot检测ARAG1超表达转基因植株中内源ARAG1蛋白的表达水平

用Western blot法检测ARAG1超表达转基因植株中ARAG1蛋白的表达情况，以tubulin A作为定量对照，具体方法与实施例4相同，结果如图8所示(G2、G5、G8分别表示步骤一获得的ARAG1超表达转基因株系G2、G5、G8，WT为水稻野生型植株)，表明转基因株系的ARAG1蛋白表达水平与对照相比也显著增加。

实施例6、ARAG1反义转基因植株和ARAG1超表达转基因植株的表型分析及其种子对ABA抑制种子萌发作用的敏感性检测

一、ARAG1反义转基因植株和ARAG1超表达转基因植株的表型分析

对实施例4鉴定出的四个ARAG1反义转基因株系(ARAG1-ant，R1，R3，R9，R10)和实施例5鉴定出的三个ARAG1超表达转基因株系(ARAG1-ox，G2、G5、G8)作表型分析，以野生型为对照，结果ARAG1-ox株系T1代和T2代的株高稍大于野生型对照，而ARAG1-ant株系的株高与野生型对照无明显差别。ARAG1-ox和ARAG1-ant株系每株的分蘖数、枝梗数、籽粒数与对照相比无明显差异。籽粒的重量有差异，四个ARAG1-ant株系(R1，R3，R9，R10)的种子千粒重(thousand grain weights)均小于野生型对照，而其中两个ARAG1-ox株系(G2，G8)均大于野生型对照(P值＜0.01)。

二、ARAG1反义转基因植株和ARAG1超表达转基因植株的种子对ABA抑制种子萌发作用的敏感性检测

取野生型、ARAG1反义转基因株系R9T2代和ARAG1超表达转基因株系G2 T2代的种子各30粒，去皮后，将种子在暗中25℃用水浸泡24小时，使种子萌动。然后将不同类型的种子各分成5份，分别放置在含有不同ABA浓度(0、2、4、6、8mM ABA)的水溶液的饱和的滤纸上，在25℃黑暗的条件下使其萌发，每隔一定的天数统计种子的萌发率，实验重复三次。以这些种子的初生根或芽的长度超过2mm作为种子已经萌发的标志。结果在正常的萌发条件下(0mM ABA)，野生型的种子在浸种后两天(48小时)萌发率达到了96％，在第三天(72小时)达到了100％。ARAG1-ox的种子(G2T2)具有与野生型种子相似的萌发率，而ARAG1-ant的种子(R9 T2)，尽管在第三天能够100％萌发，但它在第两天(48小时)的萌发率只有75.9％，表明ARAG1-ant的种子与野生型相比萌发能力有所降低。2mM ABA处理组的实验结果显示，野生型与ARAG1-ox种子的萌发率分别在浸种后第4天达到了85％和60％，而ARAG1-ant种子不能够萌发。为做进一步验证，分别在浸种后第4、7、10天统计0、2、4、6、8mM ABA处理组种子的萌发率，统计结果表明随着ABA浓度的增加，种子的萌发率逐渐降低。在第4天时，0、2、4、6和8mMABA处理组种子的萌发率分别为100％、85％、57％、40％和30％。ARAG1-ox株系具有与野生型对照相似的对ABA抑制作用的敏感性，而ARAG1-ant种子在相同的条件下完全不能萌发。当处理时间延长到10天时，野生型和ARAG1-ox株系的种子在低于6mM ABA浓度下，可以全部萌发，大约有95％的种子可以在8mM ABA处理条件下萌发。与此形成对照的是，ARAG1-ant的种子在0、2、4、6和8mM ABA处理条件下，萌发率分别只有83％、49％、29％和13％。上述实验结果表明对ARAG1基因的反义抑制，引起了对ABA抑制萌发的超敏感。

实施例7、检测ARAG1反义转基因植株和ARAG1超表达转基因植株幼苗生长的影响

取野生型、ARAG1反义转基因株系R9 T2代和ARAG1超表达转基因株系G2 T2代的种子各30粒，去皮后，将种子在暗中25℃用水浸泡24小时，使种子萌动。然后将这些种子放置在不含ABA的、无菌水饱和的滤纸上，在25℃黑暗的条件下萌发三天。最后将不同类型的种子各分成5份，分别放置在含有不同ABA浓度(0、2、4、8mM ABA)的水溶液里，继续生长7天。分别在第2、4、6、8、10天统计初生根的长度、株高、不定根和侧根的数目。结果在正常生长条件下(0mM ABA)，第10天时野生型植株的平均株高达到4.5cm，ARAG1-ox(T2G2)植株的平均株高与野生型植株相似，而ARAG1-ant(T2R9)植株的平均株高比野生型植株的短24％，表明对ARAG1基因的反义抑制导致植株生长的缓慢。ARAG1-ant(T2 R9)植株初生根的平均长度比野生型植株的短8％，不定根和侧根的数目比野生型植株的分别减少11％和21％。作为正对照，ARAG1-ox(T2 G2)植株不定根和侧根的数目比野生型植株的分别多11％和21％。2mM ABA处理组的实验结果显示，与正常生长条件下生长的幼苗相比，野生型幼苗的株高被抑制了42％，ARAG1-ox幼苗枝条生长的抑制程度接近(54％)，而ARAG1-ant幼的株高抑制程度仅为75％。为做进一步验证，分别统计2、4、8mM ABA处理组的株高。统计结果表明随着ABA浓度的增加，野生型幼苗的株高逐渐降低。用4mM和8mM ABA处理时，抑制程度分别达到53％和63％。随着ABA处理浓度地增加，ARAG1-ox幼苗具有与野生型植株相似的对ABA的敏感性，抑制程度接近，然而在相同条件下，ARAG1-ant幼苗的生长几乎完全被抑制(抑制程度分别达到92％和96％)。进一步检测初生根的生长对ABA的敏感性，在2mM ABA处理条件下，野生型和ARAG1-ox初生根的长度与正常条件下生长的植株相比分别减少了19％和15％，而ARAG1-ant幼苗的初生根的长度比正常条件下生长的对照植株减少了43％。当ABA的浓度增加到4mM和8mM时，经处理的野生型植株的比正常条件下生长的对照植株初生根的长度分别减少了50％和74％，ARAG1-ox初生根的受抑制程度与野生型的相似，分别达到49％和74％，而ARAG1-ant幼苗初生根的生长几乎被完全抑制，受抑制程度与正常条件下生长的对照植株相比，分别达到88％和98％。上述实验结果表明在营养生长阶段，对ARAG1基因的反义抑制，使转基因植株的幼苗对外源ABA处理高度敏感。

实施例8、检测ARAGl超表达转基因植株对干旱和盐胁迫的耐性

一、检测ARAGl超表达转基因植株对干旱胁迫的耐性

将在土壤中正常生长两周(至3叶期)的野生型和实施例5获得的ARAG1超表达转基因株系G2、G5、G8的幼苗，断水处理9天，然后恢复浇水，在正常条件下培养5天，结果野生型对照植株全部死亡，而ARAG1超表达转基因株系G2和G5的死亡率分别为45％和55％。表明ARAGl超表达转基因植株比野生型对照植株具有更强的耐干旱能力。

二、检测ARAGl超表达转基因植株对盐胁迫的耐性

将实施例4获得的四个ARAG1反义转基因株系R1、R3、R9、R10和实施例5获得的ARAGl超表达转基因株系G2、G5、G8T2代及野生型植株的种子在1/2MS琼脂培养基上萌发10天，然后将幼苗小心从培养基上取出，将幼苗的根部浸在500mM NaCl溶液中6个小时，最后将幼苗转移到土壤中，在正常条件下培养5天。统计存活率，结果45％的ARAG1超表达植株经上述NaCl溶液处理后可以存活，而野生型和ARAG1反义转基因植株完全死亡。表明ARAG1超表达转基因植株比野生型对照植株具有更强的耐盐能力。

实施例9、ARAG1蛋白的GFP荧光定位

将实施例5构建的ARAG1超表达(融合表达)载体p1302-35s-ARAG1-GFP通过冻融法转化农杆菌EHA105，然后用Yang等(Plant J 2000，22：543-551)的方法再将阳性重组子导入洋葱表皮中进行培养，以只导入pCAMBIA-1302空载体的洋葱表皮细胞为对照。利用荧光显微镜(Zeiss)在FITC虑光片下检测GFP荧光信号。结果在对照细胞中GFP信号均匀分布于细胞核与细胞质中，而在导入p1302-35s-ARAG1-GFP融合表达载体的细胞中GFP信号主要存在于细胞核中，表明ARAG1是一核蛋白。

                              序列表

<160>2

<210>1

<211>225

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>1

Met Asp Asp Ser Ser Phe Gly Ser Glu Pro Thr Thr Ser Ser Ser Gly

1               5                   10                  15

Gly Glu Ala Pro Ala Ser Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ser Ser Ser Asp

            20                  25                  30

Gly Ala Gly Gly Lys Lys Lys Arg Pro Arg Lys Asp Gly His His Pro

        35                  40                  45

Thr Tyr Arg Gly Val Arg Met Arg Ser Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu

    50                  55                  60

Ile Arg Glu Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Ala

65                  70                  75                  80

Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile

                85                  90                  95

Lys Gly Arg Ala Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala His Glu Leu

            100                 105                 110

Pro Arg Pro Ala Thr Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala

        115                 120                 125

Leu Ala Ala Ala Ala Asp Phe Pro Ala Ser Ser Ala Asn Ala Gly Ala

    130                 135                 140

Ser Asn Asn Pro Asp Gly Ser Asp Asp Ala Ser Ala Gly Ser Ala Ser

145                 150                 155                 160

Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Ala Asp Asp Ala Leu Phe Asp Leu Pro

                165                 170                 175

Asp Leu Leu Leu Asp Leu Arg Tyr Gly Pro Pro Ser Ser Gly Leu Ser

            180                 185                 190

Cys Ala Ser Ser Trp Glu Asp Glu Val Gly Leu Ile Ser Gly Ala Gly

        195                 200                 205

Ala Ala Ala Ala Gly Val Phe Arg Leu Glu Glu Pro Leu Leu Trp Glu

    210                 215                 220

Tyr

225

<210>2

<211>678

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>2

atggacgact cgtcgttcgg ttccgagccg accacgtcct cctcgggcgg ggaggcgccg     60

gcctccccgc cgtccaccgc gtcgtcgtcc tcagacggcg ccggcggcaa gaagaagcgg    120

ccgcgcaagg acgggcacca cccgacgtac cgcggggtgc gcatgcggag ctggggcaag    180

tgggtgtcgg agatcaggga gccgcggaag aagtcgcgca tctggctggg caccttcgcc    240

accgccgaga tggccgcgcg cgcgcacgac gtcgccgcgc tcgccatcaa gggccgcgcc    300

gcgcacctca acttcccgga cctcgcccac gagctgccgc gcccggccac cgcggcgccc    360

aaggacgtcc aggccgcagc cgcgctcgcc gccgccgccg acttcccggc ctcctccgcc    420

aatgcgggcg ccagcaataa ccccgacgga tcggacgacg cgagcgccgg gtccgcctcg    480

ccgcccccgc cgccggacgc cgctgacgac gcgctgttcg acctccccga cctcctcctc    540

gacctcagat acggcccgcc cagctcgggc ctctcgtgcg cgtcgtcttg ggaagacgaa    600

gtgggcttaa tctccggcgc cggtgccgcc gccgccggcg tgttccgcct ggaggagcca    660

cttctgtggg agtactaa                                                  678

Claims (10)

1、水稻的DREB类转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的水稻的DREB类转录因子，其特征在于：所述蛋白具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列。

3、编码权利要求1所述的水稻DREB类转录因子的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID№：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、根据权利要求3所述的水稻DREB类转录因子的基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。

5、含有权利要求3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

6、一种提高植物耐逆性的方法，是将权利要求3所述的水稻的DREB类转录因子基因导入植物组织或细胞，得到耐逆性提高的植物。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述水稻的DREB类转录因子基因通过含有所述水稻DREB类转录因子基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用于构建所述植物表达载体的出发载体为pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为p1302-35s-ARAG1-GFP。

10、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述植物宿主为水稻、小麦、大豆、烟草、拟南芥、玉米或棉花。

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