CN1618975A - 一种抗逆转录因子高效表达载体 - Google Patents
一种抗逆转录因子高效表达载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1618975A CN1618975A CN 200310115346 CN200310115346A CN1618975A CN 1618975 A CN1618975 A CN 1618975A CN 200310115346 CN200310115346 CN 200310115346 CN 200310115346 A CN200310115346 A CN 200310115346A CN 1618975 A CN1618975 A CN 1618975A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- transcription factor
- expression vector
- reverse transcription
- plasmid
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种抗逆转录因子高效表达载体。本发明通过酶切、连接、转化等技术,把DREB1A抗逆转录因子连接到质粒pC3300表达载体上,从而构建出适合于单子叶植物的农杆菌介导的高效表达载体。经根癌土壤杆菌LBA4404介导,对植物进行转化实验,PCR分析结果显示:DREB1A基因在小麦中转化效率达40%。
Description
技术领域:
本发明涉及一种抗逆转录因子高效表达载体,具体涉及用农杆菌介导法获得的DREB1A抗逆转录因子双元表达载体。
背景技术:
在转基因植物的研究中,应用的技术主要有三种,即基因枪法、花粉管通道法和农杆菌介导法。其中,农杆菌介导法具有一定的优越性。农杆菌是一种天然的植物基因转化系统,农杆菌介导的转化方法能转移较大的DNA片段,转基因拷贝数低,遗传稳定性好。该法目前在双子叶植物中应用较多,由于单子叶植物对农杆菌感染不敏感,极大的限制了农杆菌介导法在单子叶植物上的应用。虽然该方法在一些单子叶植物上获得了一定的转化效率,但总的来说转化效率还很低,特别是在小麦上很少有成功的报道。
此外,干旱、盐渍、低温等逆境条件是严重影响我国农作物生产的主要非生物胁迫因素,培育抗逆新品种适应多变的生态环境是目前迫切需要解决的问题。大量研究和实践表明,与植物抗虫、抗病等其它性状比较,植物的抗逆性状要复杂得多。植物对干旱、高盐及低温耐性的强弱往往不取决于单一因子,其性状受到许多因子的影响。利用单一基因,如脯氨酸合成酶基因或甜菜碱合成酶基因进行转化,虽能改善植物的耐盐性或耐旱性,但不能使植物的抗逆性得到较为理想的综合改良。
发明内容:
本发明的目的是从改良或增强一个关键的转录因子的调控能力着手,使植物抗逆性得到综合改良。
本发明用农杆菌介导法获得了一种抗逆转录因子的高效表达载体。所述抗逆转录因子是DREB(dehydration responsive element binding)1A,它可以调控多个与植物抗逆性相关的功能基因的表达。
本发明的技术方案是通过酶切、连接、转化等技术,把DREB抗逆转录因子连接到质粒pC3300表达载体上,从而构建出适合于单子叶植物的农杆菌介导的高效表达载体。经农杆菌中的根癌土壤杆菌LBA4404介导,对植物进行转化实验,PCR分析结果显示:DREB1A基因在小麦中转化效率达40%。
上述抗逆转录因子的高效表达载体中,所述抗逆转录因子DREB是DREB1A基因,该基因来源自拟南芥植物。
附图说明:
图1是植物表达载体的构建过程。
图2是pC3300IS-DREB1A质粒的酶切检测电泳图。其中:1,6为对照,2-5为EcoRI单酶切,7-10为XbaI单酶切,11为Marker,其中2,3,7,8为正连,4,5,9,10为反连。
图3是对转化植株的鉴定的PCR检测结果。其中M是λDNA/EcoRI+HindIIIMarker;
+是阳性对照;-是阴性对照;1-10是转化植株。
具体实施方式:
实施例1植物农杆菌介导的双元表达载体的构建
1材料
1.1菌种和质粒
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefacience)LBA4404(由山东大学提供)、质粒pAHC25(由清华大学提供)、质粒pC3300(由山东大学提供)、质粒pTripIEx2-IS(由山东大学提供)。
1.2植物材料
小麦品种H6756(中国农业科学院作物育种栽培研究所提供)
1.3主要生化试剂
限制性内切酶EcoRI、HindIII、XbaI,T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶(以上酶均购自宝生物工程公司),DNA片段快速纯化/回收试剂盒(购自鼎国生物公司)卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampicin),乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)。
2方法(见附图1)
1.用EcoR I和HindIII双酶切pC3300,电泳回收大片段;用EcoR I和HindIII双酶切pTripIEx2-IS,电泳回收659bp大小的片段;再用T4DNA连接酶连接到回收的pC3300大片段上得到pCIS;
2.制备大肠杆菌DH5α感受态,用pCIS质粒转化大肠杆菌,涂板培养过夜。从平板上挑取单菌落接种到液体培养基中振荡培养,然后提取质粒进行EcoR I和HindIII双酶切检测,其中12个转化子的酶切电泳图得到了转化的659bpIS片段,证明这12个转化子为构建的pCIS。
3.HindIII单酶切pCIS,电泳回收,去磷,再电泳回收。
4.HindIII单酶切pAHC25,电泳回收3.2kb大小的片段(包含Ubi1启动子、DREB1A基因和NOS3’终止子)。
5.用T4DNA连接酶连接到去磷的pCIS HindIII酶切位点间得到pC3300IS-DREB1A。制备大肠杆菌DH5α感受态,用pC3300IS-DREB1A质粒转化大肠杆菌,涂板培养过夜。挑取单菌落接种到液体LB培养基中振荡培养,然后提取质粒进行EcoR I和XbaI单酶切检测。
6.最后把构建的pC3300IS-DREB1A用冻融法导入根癌土壤杆菌LBA4404。
7.载体构建的检测结果
提取pC3300IS-DREB1A质粒进行EcoR I和XbaI单酶切检测,其中4个转化子酶切电泳图得到预定大小的片段,通过酶切片段可以看出2个为正连,2个为反连(见附图2)。EcoRI酶切得到片段:正连10175bp 2670bp 933bp,反连12152bp 933bp 835bp。XbaI酶切得到片段:(只在导入的3260bp片段上有酶切位点所以正连和反连酶切片段相同)10835bp2152bp 933bp。
实施例2小麦的转化和再生
1.建立受体系统
1)种子灭菌:取饱满干净的种子用70%乙醇浸泡5分钟,再用0.1%HgCl2浸泡15分钟,然后用无菌水冲洗4次,灭菌期间不断晃动种子。
2)灭菌后的种子放在无菌的三角瓶中,加适量无菌水,放置15-35℃黑暗条件下萌发。
3)种子萌动后转到MS培养基上,放置15-35℃黑暗条件下继续萌发。
待胚芽长至2-3厘米时,剥离胚芽鞘和幼叶,暴露茎尖生长锥用于转化。
2.工程菌的制备
将实施例1中获得的带有pC3300IS-DREB1A载体的农杆菌LBA4404在附加利福平、卡那霉素的Yep液体培养基中震荡培养,震荡速率110转/分,培养温度28℃。培养到对数生长期(OD=0.5),然后4000rpm/min离心10分钟,弃上清,再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)的MS液体培养基中悬浮用于转化。
3.转化
将无菌苗的茎尖生长锥浸泡在悬浮的农杆菌菌液中6分钟,期间不停晃动,然后倒掉菌液,种子表面用滤纸吸干,再将苗放在MS培养基上,黑暗条件下共培养2-3天。
4.移栽和筛选
将植株移栽到装有蛭石的花盆中,植株顶部覆盖蛭石,待长出新叶后,将沾有1/1000Basta除草剂的棉球放置在新叶上,待棉球干燥后取下。未转化的植株逐渐死亡,转化植株对除草剂有抗性存活下来。最后将存活植株移植到大田中。
5.转化植株的鉴定
转化的200株无菌苗,经除草剂Basta筛选获得143株抗性植株。对抗性植株进一步做PCR检测,结果显示50株转化植株扩增出特定大小的片段,转化率达40%(见附图3)。
实施例3转基因植株的PCR检测
用CTAB法从转化植株叶片中提取总DNA,然后以总DNA为模板作PCR。特异性引物:(由博亚公司合成)
DREB1A-5F primer(19bp):5’-TTTAGTTACCTTATCCAGT-3’Tm=41.2℃
DREB1A-3R primer(18bp):5’-TTACACTCGTTTCTCAGT-3’Tm=41.2℃
反应体系:
待测小麦DNA(模板) 1ul
ddH2O 3ul
10×Buffer 1ul
MgCl2(25mM) 0.7ul
4×dNTP(each 2mM) 1ul
5F primer 1ul
3R primer 1ul
BSA(0.1%) 1ul
TagDNA(3U/ul) 0.3ul
Total 10ul
反应程序:
Claims (6)
1.一种抗逆转录因子高效表达载体,特征是将抗逆转录因子DREB与质粒pC3300表达载体连接而得到的。
2.权利要求1所述的表达载体,所述抗逆转录因子DREB是DREB1A基因。
3.权利要求1所述的表达载体,所述抗逆转录因子DREB转录因子克隆自拟南芥类植物。
4.权利要求1所述的表达载体的用途,是在转基因植物的研究中,经农杆菌介导的用于单子叶植物基因转化的高效表达载体。
5.权利要求1所述的表达载体的制备方法,特征是把DREB抗逆转录因子连接到质粒pC3300表达载体上而构建出的。
6.权利要求4所述的表达载体的制备方法,所述把DREB抗逆转录因子连接到质粒pC3300表达载体上,是通过酶切、连接、转化技术进行的。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200310115346 CN1618975A (zh) | 2003-11-20 | 2003-11-20 | 一种抗逆转录因子高效表达载体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200310115346 CN1618975A (zh) | 2003-11-20 | 2003-11-20 | 一种抗逆转录因子高效表达载体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1618975A true CN1618975A (zh) | 2005-05-25 |
Family
ID=34760401
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200310115346 Pending CN1618975A (zh) | 2003-11-20 | 2003-11-20 | 一种抗逆转录因子高效表达载体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1618975A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1328288C (zh) * | 2005-10-10 | 2007-07-25 | 中国科学院植物研究所 | 一个水稻dreb类转录因子及其编码基因与应用 |
CN101565460B (zh) * | 2008-04-21 | 2011-12-07 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 胡杨DREB2转录因子cDNA序列、含有该序列的表达载体及其应用 |
CN101492498B (zh) * | 2008-12-26 | 2012-05-09 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 植物抗逆性相关蛋白及其编码基因TaERECTA与应用 |
-
2003
- 2003-11-20 CN CN 200310115346 patent/CN1618975A/zh active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1328288C (zh) * | 2005-10-10 | 2007-07-25 | 中国科学院植物研究所 | 一个水稻dreb类转录因子及其编码基因与应用 |
CN101565460B (zh) * | 2008-04-21 | 2011-12-07 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 胡杨DREB2转录因子cDNA序列、含有该序列的表达载体及其应用 |
CN101492498B (zh) * | 2008-12-26 | 2012-05-09 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 植物抗逆性相关蛋白及其编码基因TaERECTA与应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102154364A (zh) | 一种根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法 | |
WO2022135246A1 (zh) | 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用 | |
CN104059937B (zh) | 一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途 | |
CN101955521A (zh) | 植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用 | |
CN104046636A (zh) | 一种密码子植物化改造的pmi基因及其应用 | |
CN101063139A (zh) | 一种种子特异性高效启动子及其应用 | |
CN104829699B (zh) | 一种与植物抗逆性相关蛋白Gshdz4及其编码基因与应用 | |
CN106148400A (zh) | 一种根癌农杆菌介导的番茄转化方法 | |
CN1618975A (zh) | 一种抗逆转录因子高效表达载体 | |
CN103290014A (zh) | 一个逆境诱导表达的基因启动子及其应用 | |
CN108220290B (zh) | 水稻小分子RNAosa-miR171b在抗水稻条纹叶枯病上的应用 | |
CN102321662A (zh) | 植物茎尖转化方法及其专用工具 | |
CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
CN103589750A (zh) | 一种在植株水平上删除转基因水稻标记基因的方法 | |
CN104628840B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白VrDREB2A及其编码基因与应用 | |
CN107056907A (zh) | Nac062d转录因子蛋白及其编码基因在抑制种子发芽中的应用 | |
CN101058813A (zh) | 一种植物组织特异性表达dna调控元件 | |
CN1277928C (zh) | 一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法 | |
CN102776231A (zh) | 一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法 | |
CN1168377C (zh) | 一种快速棉花转基因的方法 | |
CN102206662B (zh) | miR399融合基因及其构建方法和在植物育种中的应用 | |
CN1291024C (zh) | 一种高效获得多年生黑麦草转基因植株的农杆菌介导转化体系及其应用 | |
CN114149993B (zh) | 一种调控植物可溶性糖含量的lncRNA及其应用 | |
CN116606362B (zh) | 绿豆VrAP1基因及其在调控植物株型和开花中的应用 | |
Sharma et al. | Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of transformants of Brassica juncea |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |