CN102776231A - 一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法，其是用悬浮于AAM-AS培养基中的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染日本结缕草的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织置于N₆D₂-AS培养基中共培养2-3天，最后洗去根癌农杆菌，筛选并培养愈伤组织。本发明针对农杆菌介导日本结缕草遗传转化体系影响转化效率的三大重要影响因子，摸索出最佳菌液浓度(OD₆₀₀值为0.3-0.4)，侵染时间(1.5-2h)及共培养时间(2-3天)。结合培养基的改良，最终转化效率达到50％以上；另外，本发明通过改进农杆菌清洗方法，使在筛选培养的过程中排除了农杆菌的污染，与以往的农杆菌介导转化方法相比，大大减少了工作量，节约了成本，避免了愈伤材料的浪费。

Description

一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法

技术领域

本发明基因工程领域，具体地说，涉及一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法。

背景技术

日本结缕草(Zoysia Japonica Steud.)是我国资源丰富的唯一不需要进口的草坪草种，具有适应性强，耐旱、抗热、抗寒、耐践踏和耐贫瘠等许多优良性状。其缺点主要是发芽迟缓，出苗成坪慢，导致易被杂草侵占。所以，一般育种目标都集中在延长绿期，提高其质地和耐寒性，加快苗期生长、发芽速率等方面，但在这方面的研究很少，国内外只在打破种子休眠上做了一些基本的研究。由于植物抗逆性本身的复杂性和其数量性状位点连锁关系的复杂性使得利用传统育种方法获得优良的抗性品种十分困难，利用基因工程技术获得适应或抵抗这些不利环境因素的草坪草品种将是解决这些问题快速且有效的方法之一。近20年来，随着植物分子生物学和基因工程方面的研究进展，尤其是转基因技术在禾本科作物育种中的发展，近年来，草坪草转基因技术方面发进展迅速。

农杆菌介导转化法的原理是：根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)侵染植物时，独立于其染色体外的Ti质粒的一段DNA(T-DNA)可以转入植物细胞，并稳定地保留在植物细胞染色体中，变为植物细胞新增加的一群基因，最终能通过有性世代遗传给子代(Matthews等，2001)。两者的主要过程包括：含目的基因的重组质粒导入农杆菌→农杆菌与转化受体共培养→转化受体的处理→转化体的筛选和再分化植株→拟转化植株的分子检测与遗传稳定性研究。它介导的转化频率高，再生植株可育率高，可转移圈套片段DNA，不需要原生质体培养技术，导入的外源基因拷贝数较低，所需实验条件简单，价格低，有人认为它是一种“天然”的转化方法，可能有助于避免基因沉默。另外，添加乙酰丁香酮、葡萄糖、没食子酸等的改良农杆菌介导法在水稻等单子叶植物已进行广泛的研究，并获得了较高的转化频率。

早先的研究认为双子叶植物是农杆菌的天然宿主，单子叶植物很难用农杆菌侵染，但随着农杆菌介导转化法在小麦(Deng等，1988)和水稻(Chan等，1993)上相继成功的应用，近年来也在草坪草转基因育种中获得成功。最早是由Rosset等人1998年(Rosselt等，1998)报道的，在多年生黑麦草和多花黑麦草都被成功转化，潮霉素抗性率为1.7％-4.5％，标志着农杆菌介导转化法在草坪草遗传转化上的突破。随后，农杆菌介导转化法在匍匐翦股颖(Chai等，2000；Luo等，2004；Fu等，2005；Han等，2005)、细弱翦股颖(Chai等，2000；2004)、鸭茅(Lee等，2000)、结缕草(Chai等，2000；Toyama等，2003)、高羊茅(Lee，2000；Bettany等，2003；Lee等，2004；Wang等，2005)、多年生黑麦草(Bettany等，2003)、草地早熟禾(Chai等，2003)等多种草坪草的研究中也获得成功。

虽然农杆菌介导转化法在以上草种中已经获得转基因植株，但还存在着对基因型的限制。单子叶植物难以用农杆菌感染的原因主要是(叶健明，1999；郭殿京，1997)：①单子叶植物很少或完全不能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子；②单子叶植物转化的靶组织或细胞不能进行有效的细菌粘附，无明显的创伤反应，不能诱导创伤附近的细胞脱分化形成大量感受态细胞，而只有那些再生和整合转化能力强的感受态细胞才能得到转化植株。至今，以日本结缕草胚性愈伤组织为受体的农杆菌介导法转化体系尚停留在实验室研究阶段。

农杆菌介导的外源基因转化是农杆菌菌株与植物细胞之间相互作用的结果，凡是能够影响植物细胞转化应答能力和农杆菌侵染能力及转化子再生能力的各种因素都会对转化效果产生影响。因此，农杆菌转化效率的提高依赖于对各种影响因子的优化和转化条件的改善(易自力，2001)。

发明内容

本发明的目的克服现有农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷，提供一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法，包括步骤：1)当根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的菌液OD₆₀₀值为0.3-0.4时，离心收获菌体，然后向菌体中加入AAM-AS培养基悬浮菌体；2)用悬浮于AAM-AS培养基中的根癌农杆菌侵染日本结缕草的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织置于N₆D₂-AS培养基中共培养2-3天，优选共培养2天，最后洗去根癌农杆菌，筛选并培养愈伤组织；

其中，AAM-AS培养基配方为：463mg/L(NH₄)₂SO₄+283mg/LKNO₃+185mg/L  MgSO₄·7H₂O+400mg/L  KH₂PO₄+166mg/L  CaCl₂·2H₂O+4.4mg/L MnSO₄·4H₂O+1.5mg/L ZnSO₄·7H₂O+1.6mg/LH₃BO₃+0.8mg/L KI+0.4mg/L甘氨酸+0.02mg/L维生素B1+0.1mg/L维生素B6+0.1mg/L烟酸+37.24mg/L Na₂-EDTA+27.84mg/L FeSO₄·7H₂O+100mg/L肌醇+900mg/L L-谷氨酰胺+300mg/L L-天冬氨酸+176.7mg/L L-精氨酸+10mg/L盐酸硫胺+68.5g/L蔗糖+36g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2；

N₆D₂-AS培养基配方为：463mg/L(NH₄)₂SO₄+2830mg/LKNO₃+185mg/L MgSO₄·7H₂O+400mg/L KH₂PO₄+166mg/L CaCl₂·2H₂O+10mg/L MnSO₄·4H₂O+2mg/L ZnSO₄·7H₂O+3mg/L H₃BO₃+0.75mg/LKI+0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O+0.025mg/L CuSO₄·5H₂O+0.025mg/LCoCl₂·6H₂O+37.24mg/L Na₂-EDTA+27.84mg/L FeSO₄·7H₂O+10mg/L盐酸硫胺素+1mg/L盐酸吡哆素+1mg/L烟酸+100mg/L肌醇+500mg/LL-脯氨酸+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L谷氨酰胺+2mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+10g/L葡萄糖+1.0g/L水解酪蛋白+100μmol/L乙酰丁香酮+2g/L植物凝胶，pH5.2。

前述的方法，侵染时间为1.5-2h，优选1.5h。

前述的方法，洗去根癌农杆菌包括步骤：1)将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水冲洗3-5次，边洗边振荡，直至清洗后的液体澄清；2)然后将愈伤组织悬浮于含有450-550mg/L头孢霉素和150-250mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25-28℃，100-120rpm，1.5-2h。

前述的方法，所述根癌农杆菌为含有目的基因的转化的根癌农杆菌，其出发菌株优选为EHA105。

前述的方法，日本结缕草的愈伤组织的制备方法为：将日本结缕草种子浸于次氯酸钠溶液中在磁力搅拌器上消毒，将消毒后的种子用无菌水洗3-5次，4℃下浸泡3-4d；浸泡后的种子再用次氯酸钠溶液消毒15-25min，用无菌水洗3-5次后，吸干种子表面的水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，26-30℃黑暗条件下诱导愈伤；愈伤组织每月继代一次，继代时挑选白色或黄色、颗粒状愈伤组织转接到继代培养基上培养，即得；其中，使用的愈伤组织诱导培养基配方为：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8；愈伤组织继代培养基配方为：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8。

本发明针对农杆菌介导日本结缕草遗传转化体系影响转化效率的三大重要影响因子，摸索出最佳菌液浓度(OD₆₀₀值为0.3-0.4)，侵染时间(1.5-2h)及共培养时间(2-3天)。结合培养基的改良，使用AAM培养基(AS100μmol/L，pH5.2)作为农杆菌悬浮培养基，N₆D₂培养基(AS100μmol/L，pH5.2)作为共培养培养基，最终转化效率达到50％以上。

另外，本发明通过改进农杆菌清洗方法，将共培养的愈伤组织先用无菌蒸馏水冲洗3～5次，再悬浮于含有450-550mg/L头孢霉素和150-250mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25-28℃，100-120rpm，1.5-2h，用60目细胞筛将愈伤滤出，以无菌滤纸吸干，转接于选择培养基上，在筛选培养的过程中排除了农杆菌的污染，与以往的农杆菌介导转化方法相比，大大减少了工作量，节约了成本，避免了愈伤材料的浪费。

附图说明

图1为载体pCAMBIA1301的结构示意图。

图2为植物表达载体pc1301-ubi的结构示意图。

图3为载体pc1301-ubi-ZjGA20-dsRNAi的结构示意图。

图4为pc1301-ubi-ZjGA20-RNAi载体构建流程图。

图5A-D为在选择培养基上筛选3个月的抗性愈伤。

图6A-C为转基因植株的再生及培养，A-C分别表示分化、壮苗和植株移栽。

图7为抗性植株RT-PCR检测结果，ck0：未转基因植株；ck1：转空载体植株；1～7：转基因植株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的试剂和材料，如无特殊说明，均为市售商品。

实施例1农杆菌介导日本结缕草遗传转化体系最佳条件的筛选

1受体植物材料

将日本结缕草品种‘Zenith’成熟种子(‘Zenith’品种种子购自美国TMI公司(TurfMerchants，Inc))浸泡在次氯酸钠溶液(购自北京化工厂，＞5％活性氯，加入1-2滴吐温20)中，在磁力搅拌器上消毒1小时，以无菌水冲洗3-5次，4℃下浸泡3d，再以次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水冲洗3次后，用无菌滤纸吸干多余水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，黑暗状态下28℃诱导愈伤。愈伤组织每月继代一次，继代时挑选白或黄色、颗粒状愈伤组织转接到继代培养基上培养，作为基因转化的受体材料。

2菌株与载体

大肠杆菌(Escherichia coli)感受态DH5a，农杆菌菌株EHA105购自北京全式金生物公司。植物表达载体(空载体)pCAMBIA1301(图1)，筛选基因为hph，由CaMV35S启动子调控。植物表达载体pc1301-ubi(图2)的构建过程如下：

(1)Ubi启动子的获得：以玉米基因组为模板扩增Ubi启动子，在Ubi启动子的上游引入HindIII酶切位点，下游引入BamHI酶切位点。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上测序确认Ubi序列的正确性。用HindIII+BamHI双酶切从pMD18载体上释放Ubi启动子。

(2)在pCAMBIA1301的多克隆位点引入终止子：用SacI+EcoRI分别双酶切pBI121和pCAMBIA1301，从pBI121上酶切下来的小片段(Noster终止子)和双酶切后的pCAMBIA1301大片段连接。

(3)将Ubi启动子引入pCAMBIA1301的多克隆位点：HindIII+BamHI双酶切pCAMBIA1301，和上述用同样内切酶酶切下来的Ubi启动子连接。

用表达载体转化农杆菌后，经检测并保存，待用于农杆菌介导转基因。

3培养基

3.1细菌培养基

LB培养基(用于培养大肠杆菌)：蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+NaCl10g/L，pH7.2。

YEB培养基(用于培养农杆菌)：牛肉浸膏5g/L+酵母提取物1g/L+蛋白胨5g/L+MgSO₄·7H₂O0.5g/L+蔗糖5g/L，pH7.0。

3.2农杆菌介导转化改良培养基

I.受体材料培养基

(1)愈伤组织诱导培养基：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8。

(2)愈伤组织继代培养基：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8。

II.农杆菌介导转化用培养基

(1)农杆菌悬浮培养基：AAM培养基+AS100μmol/L，pH5.2。

(2)共培养培养基：N₆D₂培养基AS100μmol/L，pH5.2。

(3)愈伤组织筛选培养基：NB-CH培养基，pH5.8。

(4)抗性愈伤组织再生培养基：1/2MS-KT-CH。

(5)抗性植株壮苗培养基：1/2MS-C。

各培养基配方如表1所示。

表1日本结缕草组织培养和遗传转化过程中使用的培养基

4农杆菌介导日本结缕草的遗传转化

4.1农杆菌的培养与活化

(1)农杆菌的培养

将菌液涂板于含1倍抗生素(50mg/L Rif，50mg/L Kan)的YEB固体选择培养基上。倒置，28℃，暗培养1-2d。

(2)农杆菌的活化

活化第一次：2mL菌液于含1倍抗生素的YEB培养基中，28℃，200rpm/min培养过夜。

活化第二次：2mL菌液于不含抗生素的YEB培养基中，28℃，200rpm/min培养，600nm下测其OD₆₀₀值分别为0.3，04，0.5，0.6，0.7，0.8，准备侵染愈伤组织。

4.2一种新的农杆菌介导日本结缕草遗传转化体系的建立

(1)在菌液OD₆₀₀值分别为0.3，04时，将菌液转入50mL离心管中，4℃，4500rpm/min，8min。倒上清。

(2)每支离心管加入等体积的AAM(AS100μmol/L，pH5.2)农杆菌悬浮培养基，混匀后转移到250mL三角瓶中，将愈伤挑入三角瓶中，25℃，120rpm，侵染1.5-2h。

(3)用60目细胞筛将愈伤滤出，以无菌滤纸吸干。愈伤转入N₆D₂共培养基中，25℃黑暗下共培养2-3天。

(4)农杆菌的清洗：将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水冲洗3～5次，边洗边振荡，直至清洗后的液体澄清，将细菌全部洗去，再悬浮于含有500mg/L头孢霉素和200mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25℃，120rpm，2h。

(5)选择培养：用60目细胞筛将愈伤滤出，以无菌滤纸吸干后，转至选择培养基上(NB-CH)进行筛选培养2个月，统计抗性愈伤率。

5实验结果

本发明针对农杆菌介导日本结缕草遗传转化体系影响转化效率的三大重要影响因子，尝试了一种新的转化体系，即降低菌液浓度(OD₆₀₀值为0.3-0.4)，延长侵染时间(1.5-2h)，共培养时间不作调整(2～3天)，结合培养基的改良，使用AAM培养基(AS100μmol/L，pH5.2)作为农杆菌悬浮培养基，N₆D₂培养基(AS 100μmol/L，pH5.2)作为共培养培养基，最终转化效率达到50％(如表2)。

表2菌液浓度降低和延长侵染时间时农杆菌转化抗性愈伤率

5.2农杆菌清洗方法的改进

本发明通过改进农杆菌清洗方法，将共培养的愈伤组织先用无菌蒸馏水冲洗3～5次，再悬浮于含有500mg/L头孢霉素和200mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25℃，120rpm，2h，用60目细胞筛将愈伤滤出，以无菌滤纸吸干，转接于选择培养基上，在筛选培养的过程中排除了农杆菌的污染，与以往的农杆菌介导转化实验相比，大大减少了工作量，节约了成本，避免了愈伤材料的浪费。

实施例2农杆菌介导法将RNA干扰(RNAi)植物表达载体pc1301-ubi-ZjGA20-dsRNAi转入日本结缕草中获得转基因植株

1受体植物材料

日本结缕草品种‘Zenith’成熟种子浸泡在次氯酸钠溶液(购自北京化工厂，＞5％活性氯，加入1-2滴吐温20)中，在磁力搅拌器上消毒1小时，以无菌水冲洗3-5次，4℃下浸泡3d，浸泡后的种子再以次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水冲洗3次后，用无菌滤纸吸干多余水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，黑暗状态下28℃诱导愈伤。愈伤组织每月继代一次，继代时挑选白或黄色、颗粒状愈伤组织转接到继代培养基上培养，作为基因转化的受体材料。

2菌株与载体

大肠杆菌(Escherichia coli)感受态DH5a，农杆菌菌株EHA105购自北京全式金生物公司。RNA干扰(RNAi)植物表达载体pc1301-ubi-ZjGA20-dsRNAi(图3)，包含日本结缕草GA20氧化酶基因开放阅读框内283bp正义链和283bp负义链，由ubi启动子驱动，筛选基因为hph，由CaMV35S启动子调控。用表达载体转化农杆菌后，经检测并保存，待用于农杆菌介导转基因。

该表达载体的构建流程如图4所示，具体过程为：选择日本结缕草GA20-oxidase氧化酶基因的开放阅读框内283bp的片段构建回文序列，为了方便将该片段以特定的方向连接到载体上，在两对引物前加上用来定向的酶切位点。以连接有GA20-oxidase基因的pEASY-T1(Transgene)载体为模板PCR，分别得到正向和反向片段。

正向片段引物PS 1：5’-GAATTCGCACCACGGAGCTGTTTAC-3’

EcoR I

反向片段引物PS2：5’-AAGCTTCCATCATCTCCAGAGAGAGACG-3’

HindIII

正向片段引物PA1：5’CTCGAGCCATCATCTCCAGAGAGAGACG-3’

Xho I

反向片段引物PA2：5’-GGTACCGCACCACGGAGCTGTTTAC-3’

Kpn I

PCR产物分别命名为正向片段Fga20和反向片段Rga20，并分别连入pEASY-T1simple载体(pEASY-T1simple购自北京全式金生物公司)，获得重组载体pEASY-T1-F和pEASY-T1-R，用EcoR I和HindIII同时酶切中间载体pBluescript SK plus(购自北京全式金生物公司)和重组载体pEASY-T1-F，回收pEASY-T1-F的酶切小片段，连入pBluescript SKplus中，构成中间载体pBluescript SK plus-F，再用Xho I和Kpn I同时酶切中间载体pBluescript SK plus-F和重组载体pEASY-T1-R，回收pEASY-T1-R的酶切小片段，连入pBluescript SK plus-F中，构成中间载体pBluescript SK plus-FR。

用BamH I和Kpn I同时酶切中间载体pBluescript SK plus-FR和植物表达载体pc1301-ubi，回收pBluescript SK plus-FR的酶切小片段，连入pc1301-ubi大片段中，构建植物表达载体pc1301-ubi-ZjGA20-dsRNAi(图3)。表达载体转化农杆菌后，经检测并保存，待用于农杆菌介导转基因。

3培养基

3.1细菌培养基

LB培养基(用于培养大肠杆菌)：蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+NaCl10g/L，pH7.2。

YEB培养基(用于培养农杆菌)：牛肉浸膏5g/L+酵母提取物1g/L+蛋白胨5g/L+MgSO₄·7H₂O0.5g/L+蔗糖5g/L，pH7.0。

3.2农杆菌介导转化改良培养基

I.受体材料培养基

(1)愈伤组织诱导培养基：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8。

(2)愈伤组织继代培养基：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8。

II.农杆菌介导转化用培养基

(1)农杆菌悬浮培养基：AAM培养基+AS100μmol/L，pH5.2。

(2)共培养培养基：N₆D₂培养基AS 100μmol/L，pH5.2。

(3)愈伤组织筛选培养基：NB-CH培养基，pH5.8。

(4)抗性愈伤组织再生培养基：1/2MS-KT-CH。

(5)抗性植株壮苗培养基：1/2MS-C。

各培养基配方如表1所示。

4农杆菌介导日本结缕草的遗传转化

4.1农杆菌的培养与活化

(1)农杆菌的培养

将菌液涂板于含1倍抗生素(50mg/L Rif，50mg/L Kan)的YEB固体选择培养基上。倒置，28℃，暗培养1-2d。

(2)农杆菌的活化

活化第一次：2mL菌液于含1倍抗生素的YEB培养基中，28℃，200rpm/min培养过夜。

活化第二次：2mL菌液于不含抗生素的YEB培养基中，28℃，200rpm/min培养，600nm下测其OD₆₀₀值分别为0.3，0.4，准备侵染愈伤组织。

4.2一种新的农杆菌介导日本结缕草遗传转化体系的应用

(1)在菌液OD₆₀₀值分别为0.3，0.4时，将菌液转入50mL离心管中，4℃，4500rpm/min，8min，倒掉上清。

(2)每管加入等体积的AAM(AS 100μmol/L，pH 5.2)农杆菌悬浮培养基，混匀后转移到250mL三角瓶中。将愈伤挑入三角瓶中，25℃，120rpm，侵染1.5-2h。

(3)共培养：用60目细胞筛将愈伤滤出，以无菌滤纸吸干。愈伤转入N₆D₂(AS100μmol/L，pH5.2)共培养基中，25℃下共培养2～3天。

(4)农杆菌的清洗：将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水冲洗3～5次，边洗边振荡，直至清洗后的液体澄清，将细菌全部洗去，再悬浮于含有500mg/L头孢霉素和200mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25℃，120rpm，2h。

(5)选择培养：用60目细胞筛将愈伤滤出，以无菌滤纸吸干后，转至选择培养基上(NB-CH)进行筛选培养。

4.3转化子的筛选与培养

愈伤组织在选择培养基上暗培养8周，将新长出的抗性愈伤组织转移至新的选择培养基上，继续筛选4周。

挑选生长良好，结构致密的抗性愈伤组织(图5)转移到抗性愈伤组织再生培养基(1/2MS-KT-CH)上培养，诱导体胚发生和植株再生，约1个月后，待小植株出现(图6)，将其转入无筛选压，但含300mg/L头孢霉素(Cef)的1/2MS培养基(1/2MS-C)中壮苗。

4.4抗性植株的移栽

根系强壮后，炼苗3天，然后小心洗去植株根部琼脂，直接栽入到花盆(基质为沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生长。

5转化植株的分子检测

提取抗性植株RNA进行RT-PCR检测，检测结果如图7所示。

通过RT-PCR实验，共检测抗性植株7株，其中阳性植株6株，转化效率85.7％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法，其特征在于，包括步骤：

1)当根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的菌液OD₆₀₀值为0.3-0.4时，离心收获菌体，然后向菌体中加入pH值为5.2的AAM-AS培养基悬浮菌体；

2)用悬浮于AAM-AS培养基中的根癌农杆菌侵染日本结缕草的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织置于pH值为5.2的N₆D₂-AS培养基中共培养2-3天，最后洗去根癌农杆菌，筛选并培养愈伤组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，侵染时间为1.5-2h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，侵染时间为1.5h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共培养时间为2天。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，洗去根癌农杆菌包括步骤：

1)将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水冲洗3-5次，边洗边振荡，直至清洗后的液体澄清；

2)然后将愈伤组织悬浮于含有450-550mg/L头孢霉素和150-250mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25-28℃，100-120rpm，1.5-2h。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述根癌农杆菌为含有目的基因的转化的根癌农杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转化的根癌农杆菌，其出发菌株为EHA105。

8.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，日本结缕草的愈伤组织的制备方法为：将日本结缕草种子浸于次氯酸钠溶液中在磁力搅拌器上消毒，将消毒后的种子用无菌水洗3-5次，4℃下浸泡3-4d；浸泡后的种子再用次氯酸钠溶液消毒15-25min，用无菌水洗3-5次后，吸干种子表面的水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，26-30℃黑暗条件下诱导愈伤；愈伤组织每月继代一次，继代时挑选白色或黄色、颗粒状愈伤组织转接到继代培养基上培养，即得；

其中，使用的愈伤组织诱导培养基配方为：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8；愈伤组织继代培养基配方为：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8。

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