CN103215285B - 野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用。首次从茄子中克隆出CYP77A2基因，命名为StCYP77A2。构建植物表达载体，利用农杆菌介导法将其转入栽培种烟草中，获得转基因烟草植株。采用灌根法，进一步对经过验证的转基因植株的黄萎病的抗性进行分析，结果表明，在接种黄萎病菌后，过量表达StCYP77A2的转基因烟草的发病率和病情指数分别为88.89%和52.78，低于对照的100%和77.78，可以说明该基因对黄萎病有一定抑制作用。因此，StCYP77A2基因可以作为抗性基因资源被应用于茄子等作物的抗黄萎病育种中。

Description

野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

细胞色素P450(Cytochrome P450，以下简称CYP450)是一类血红素氧化酶系，从简单的细菌到高等动植物普遍存在，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化而进行电子传递，参与生物界多种重要的代谢过程。研究表明，其三维结构非常保守，经典的CYP450在催化中心有高度保守的FXXGXRXCXC的结构域。P450应用于植物抗病工程有着巨大潜力,如:1)抑制基因活性:从烟草毛状腺分离的具有羟化酶活性P450(CYP71D16),在运用反义和共抑制技术鉴定其功能时,发现CYP71D16催化的底物(cembratrieneol)明显增加,使得植株避免了蚜虫的侵染。最近,已获得CYP71D16的启动子,可调控植株产生新的分泌物,提高植物的抗病能力。植株经伤口处理后,CYP74的过量表达则能引起茉莉酸过早过量的积累,说明AOS的过量表达可能是控制高等植物抗病动力学的1种途径。2)引进外源代谢途径:非豆科类的拟南芥植株,经转入异黄酮合酶基因后,能在体内积累5,7,45-三羟基异黄酮（催化生氰糖苷合成的3个酶基因(CYP79A1、CYP71E1和UGT85B)转入拟南芥中,获得的转基因植株在生理表型和适应性上没有发生变，但是,植株能合成新的天然产物(生氰糖苷),获得对跳甲(Phyllotreta nemorum)的抗性。

1994年，Toshihiro Toguri和Kazuhisa Tokugawa从茄子下胚轴组织中克隆得到2个序列相同为71%的CYP450家族基因，但这两个基因的cDNA序列与其他任何CYP450家族基因的同源性均低于30%，因此将这两个基因命名为CYP77Al和CYP77A2的，属于一种新的P450家族。目前，对CYP77家族的研究还很有限，也仅限于少数的几个物种中克隆得到部分全长cDNA或中间片段。CYP77A2目前仅在少数几种植物上被克隆，如栽培种茄子和葡萄。

黄萎病（Verticillium Wilt）,是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）侵染引起的茄子重要病害之一。该病原菌分布广，寄主多，如陆地棉、茄子、番茄、马铃薯、甘蓝、油菜、白菜、辣椒等，严重影响了这些作物的产量与品质，造成巨大的经济损失。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2。

本发明的另一目的是提供含有该基因的表达载体。

本发明的有益效果提供该基因及其表达载体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

StCYP77A2基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

所述的StCYP77A2基因编码的蛋白质StCYP77A2，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

含有所述的StCYP77A2基因的表达载体。

所述的表达载体优选以PCB2008E为出发载体，将所述的StCYP77A2基因插入PCB2008E的Hind III和BamH I酶切位点间所得。

所述的StCYP77A2基因在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

所述的StCYP77A2基因的表达载体在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

有益效果：

本发明以野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）为材料,采用同源克隆法扩增StCYP77A2基因。将StCYP77A2基因构建转烟草表达载体，以烟草NC89为供体，进行农杆菌侵染，获得的再生植株经PCR、southern验证，检测出转基因植株。采用灌根法和伤根法进一步对经过验证的转基因植株的黄萎病的抗性进行分析，结果表明，在接种黄萎病菌后，过量表达StCYP77A2的转基因烟草的发病率和病情指数明显低于对照组，可以说明该基因对黄萎病有一定抑制作用。因此，StCYP77A2基因可以作为抗性基因资源被应用于茄子等作物的抗黄萎病育种中。

附图说明

图1植物表达载体PCB2008E-CYP77A2的构建

图2StCYP77A2转基因烟草植株的PCR检测

+:质粒阳性对照；-：未转基因烟草;1～11:转基因烟草

图3转CYP77A2基因烟草的southern分析

c1：质粒阳性对照；c2野生型对照；3，5,8,10,11,14：转CYP77A2基因烟草株系

图4灌根法检测转CYP77A2基因烟草抗病性

A：未处理野生型烟草;B：未处理转CYP77A2基因烟草55-14;C：侵染3d后野生型烟草;D：侵染3d后转CYP77A2基因烟草55-14

图5伤根法检测转CYP77A2基因烟草抗病性

a，c：未处理野生型烟草;b：未处理CYP77A2基因烟草55-8;d：野生型烟草水对照;

e：侵染3d后野生型烟草;f：侵染3d后CYP77A2基因烟草55-8。

具体实施方式

实施例1野生茄子托鲁巴姆StCYP77A2基因的克隆

根据来GenBank中已有的栽培品种茄子CYP77A2基因的mRNA序列进行分析，设计包含完整开放阅读框的引物CYP77-s：（5'-ATGGATTTTTTCTCAACTTCCT-3'，SEQ ID NO.3）；CYP77-a：（5'-ATTCTTGGTTTAATTTTAGCTCT-3'，SEQ ID NO.4））。以野生茄子幼叶cDNA第一链为模板，进行RT-PCR，反应体系为25ul，PCR循环程序如下：94℃5分钟；94℃50秒，62℃40秒，72℃50秒（共35个循环）；72℃10分钟。测序得到长约1600bp的片段。PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳后用宝生物公司的胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测单克隆，进行测序。用DNAssist软件对测序结果进行分析，StCYP77A2基因ORF为1536bp，起始密码子ATG；终止密码子TAA，序列如SEQ ID NO.1所示；cDNA编码一个由511个氨基酸残基组成的蛋白，序列如SEQ ID NO.2所示；蛋白分子量为58.08kDa；理论等电点为9.17。

实施例2野生茄子托鲁巴姆StPP5基因过表达载体的构建（图2）

将克隆出的基因StCYP77A2的cDNA全长去掉TAA终止密码子，连接到过表达载体PCB2008E（Zhi-Yong Lei,Ping Zhao et al.(2007)High-throughput Binary Vectors for Plant GeneFunction Analysis,Journal of Integrative Plant Biology49(4):556-567）上的35S启动子后的多克隆位点上，与报告基因GFP蛋白进行融合。将重组载体转化至大肠杆菌DH5α中，PCR挑取阳性单克隆菌落进行摇菌并提质粒，测序。测序结果表明目的基因已成功插入PBC2008E载体,将重组质粒命名为PCB2008E-StCYP77A2。具体步骤如下：

在StCYP77A2基因（不含TAA）片段的cDNA正反向两端分别加上Hind III和BamH I酶切位点，正向引物为77BAMH-S（5'-CCCAAGCTTCTTGGTTTAATTTTAGCTCT-3'，SEQ ID NO.5），反向引物为77HIND-A（5'-CGCGGATCCATGGATTTTTTCTCAACTTCCT-3'，SEQ ID NO.6）。

对加酶切位点的PCR产物电泳后，用胶回收试剂盒纯化回收，回收产物与pMD18-T Vector相连，然后转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单克隆进行检测，将得到的阳性菌落进行摇菌并提取质粒，用Hind III和BamH I酶于37℃进行双酶切，双酶切完全后电泳，用胶回收试剂盒纯化回收带有各自酶切位点粘性末端的目的基因，用于与载体的连接。

将提取的过表达载体PBC2008E质粒用Hind III和BamH I两种内切酶于37℃进行双酶切，电泳，回收的大片段即为带Hind III和BamH I酶切位点粘性末端的重组载体的质粒部分。

将目的基因的双酶切产物与载体PCB2008E双酶切产物按照摩尔比为(3～10):1混合，在T4连接酶的作用下于16℃下过夜连接，连接产物直接用于转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆，PCR检测，选取PCR阳性的单克隆进行大量摇菌，提取质粒，经酶切以及测序验证后命名为重组质粒PCB2008E-StCYP77A2，-70℃冻存备用。

实施例3利用农杆菌介导的转化法获得转StCYP77A2基因烟草

采用农杆菌介导的基因转化方法，取烟草子叶先进行预培养2d，然后用农杆菌悬浮液侵染5min，在共培养培养基上共培养2d。将烟草叶片外植体用农杆菌侵染后，转到愈伤分化培养基上，15d左右产生愈伤组织，20d左右出现不定芽，随后将所有形成的不定芽转入含20mg/L Hyg B的MS培养基中进行二次筛选，非转化芽因为没有抗生素抗性，最终白化死亡。随后将得到的阳性植株转入MS培养基中扩繁，经PCR及southern验证，最终获得转基因烟草植株。具体步骤如下：

1烟草无菌苗的获得

挑选少许饱满的烟草种子于1.5mL离心管中，先用无菌水洗3次。取1ml70%的酒精浸泡30s，弃上清，用无菌水洗1次。取1ml1%的HgCl₂，将种子放入其中摇动消毒3min，弃上清。无菌水冲洗3～4次。用滤纸吸干。将种子播种于1/2MS固体培养基上。一周后种子萌发，三周左右烟草长出两片子叶。

2烟草叶片在转化前的预培养

选取长势良好的5-6叶期烟草植株，切去叶片的边缘及叶脉部分，用剪刀剪成约0.5cm²的小块。放于MS培养基上在培养箱内进行2天预培养。

3农杆菌菌液的制备

将重组载体成功转化到农杆菌EH105的菌液涂布平板，挑取单菌落，接种到1mL加有抗生素的LB液体培养基（含50mg/L Kan+50mg/L Rif）中进行活化，于28℃、200rpm条件下避光振荡培养24h。随后取200μL摇出的菌液加入到50mL的液体LB液体培养基（含50mg/LKan+50mg/L Rif）中，于28℃、200rpm条件下振荡培养。在菌液到对数生长期（OD₆₀₀=0.5～0.6）时，4,000g离心10min，收集的菌体用MS液体培养基重悬，再离心收集菌体，最后用MS液体培养基稀释成OD₆₀₀=0.5～0.7的工程菌液。

4烟草组织与农杆菌共培养

将预培养的烟草子叶放入农杆菌菌液悬浮液中侵染，于28℃，200rpm条件下震荡5min。弃菌液，用无菌滤纸吸干叶片上的液体，置于共培养培养基（MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA）中。28℃黑暗条件下共培养2d。

5烟草植株的再生培养

筛选长势良好的幼嫩叶片，用含250mg/L Cef的MS液体培养冲洗4～5次，除去多余的菌体。取出子叶，放在无菌滤纸上面晾干液体，转入愈伤培养基（MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+250mg/L Cef+20mg/L Hyg）中。待愈伤长出后转入芽分化培养基（MS+3mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+250mg/L Cef+20mg/L HYg）中，4～5周可以看到愈伤分化出小芽，期间更换1～2次培养基。待芽长至1.5～2.0cm时，将芽切下插入生根培养基（MS+2mg/L NAA+250mg/L Cef+20mg/L Hyg）中。一般情况2周后可长出1～4条根，并有4～6片叶子。

6再生植株的抗性筛选

待植株长高到2～3cm后，把每棵苗的主茎从叶片的腋芽之间切开，插入生根培养基（MS+2mg/L NAA+250mg/L Cef+20mg/L Hyg）中培养进行转基因植株的筛选。

7转基因植株的扩繁

待转基因植株长高后，剪取带有腋芽的茎段，插入固体MS培养基中进行扩大繁殖，准备足够的材料进行下一步的检测。

8转基因烟草的PCR检测

依据GFP序列引物来进行DNA烟草的PCR检测，GFP1：5’-ATCCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3’（SEQ ID NO.7）；GFP2：5’-ATCGCATGCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’（SEQ ID NO.8），以转化植株的基因组DNA为模板，未转化植株总DNA作为阴性对照，PCB2008E载体质粒作为阳性对照进行扩增，对得到的11株抗生素阳性的StCYP77A2转化烟草植株进行PCR鉴定，结果如图2所示，8株为阳性，分别将其命名为77-1,77-2，77-5,77-7,77-8,77-9,77-10,77-11。

9转基因烟草的Southern blot检测

9.1基因组DNA酶切及转膜固定

（1）提取高质量的基因组DNA，浓度大于1μg、EcoR I酶切，37℃保温过夜(16～20h)。

（2）电泳：分别在转基因和对照的DNA酶切混合液中加入1/10体积的Loading Buffer，混匀，然后点样于0.8%的琼脂糖凝胶，最后点上Maker，先用100V电压电泳5min，将所有样品从点样孔压入凝胶，然后将电压调节到30V电泳6h。

（3）电泳结束后，凝胶于EB溶液中染色20min，紫外灯下拍照。

（4）修去凝胶多余部分，切一角作为标记；并于ddH₂O中漂洗片刻。

（5）室温下凝胶在0.25M HCl中浸泡15min，使DNA脱嘌呤，摇床上缓慢摇动。

（6）凝胶转移到10倍于凝胶体积的变性液（1.5M NaCl，0.5M NaOH）中轻轻振荡20min，换液一次；继续漂洗20min。

（7）超纯水漂洗凝胶片刻，然后置于10倍凝胶体积的中和液中轻轻振20min，换中和液重复一次。

（8）用滤纸和玻璃板做一个平台，置于白瓷盘上，倒入20×SSC溶液，待平台的滤纸湿透后，用玻棒赶走气泡。

（9）将尼龙膜漂浮于超纯水中至完全浸润，转移至20×SSC转移缓冲液中浸泡15min。

（10）组装转移装置：玻璃板+滤纸桥(边缘完全充分浸入20×SSC转移缓冲液)+1张滤纸+凝胶(背面朝上)+尼龙膜（做好标记）+滤纸（3层）+吸水纸+玻璃板+500g重物，毛细管法转膜24h，及时更换吸水纸。

（11）转膜结束后，凝胶拍照检测DNA残留情况。

（12）小心取出尼龙膜，平铺到预先用20×SSC溶液中平衡的滤纸上，紫外交联（1.5J/cm²）3min。

（13）双蒸水漂洗尼龙膜后，空气中干燥，用保鲜膜包好，存于4℃备用。

9.2Southern杂交

1)探针的制备与标记

（1)以质粒为模板，PCR扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度。

（2）将1μg的DNA探针（质粒回收产物）用蒸馏水稀释至16μl。

（3）沸水浴处理10min后迅速于冰上冷却使DNA变性。

（4）摇匀DIG-High Prime（vial1），取4μl加入变性液中，混合后稍离心，37℃保温20h，65℃处理10min终止反应。

（5）取1μl检测，标记好的DNA探针－20℃备用。

2）杂交与洗膜

（1）配制地高辛杂交液—64ml的无菌超纯水分两次加入DIG Easy Hyb Granules（vial7）中，迅速于37℃振荡5min至溶解。

（2）将事先加入杂交液（DIG Easy Hyb，vial7，10ml/100cm²）的杂交瓶预热至42℃，固定好的尼龙膜轻轻卷成圆柱状放入杂交瓶中42℃预杂交30min，以封闭非特异性位点。

（3）倒掉预杂交液。标记好的探针(25ng/ml)沸水浴5min迅速冰上冷却后加入预热至42℃的杂交液中（3.5ml/100cm²尼龙膜，混合均匀避免产生气泡。加液顺序：沿壁加5ml杂交液－探针－5ml杂交液，防止产生气泡。

（4）将尼龙膜完全接触杂交液，42℃杂交16～20h，杂交过程避免有气泡。

（5）杂交结束后，用2×SSC，0.1%SDS洗脱液（现配用时25℃预热）15～25℃振荡洗涤2次，每次5min。

（6）用预热的0.5×SSC，0.1%SDS洗脱液（现配）65℃振荡洗涤2次，每次15min（在杂交炉中进行）。

（7）再用100～150ml Washing buffer洗膜5min，滤干洗液进行显色处理。

3）免疫检测（所有操作均在室温进行）

（1）将杂交膜置于盛有100ml封闭液（Blocking solution）的培养皿中，室温缓慢摇动30min。

（2）转到盛有20ml抗体溶液（Antibody solution）的培养皿中，室温缓慢摇动30min。

（3）在100ml的Washing buffer中洗膜2×15min，缓慢振荡。

（4）在20ml检测缓冲液(Detection buffer)中平衡2～5min，缓慢摇动。

（5）用新配制的10ml显色液温浴膜,黑暗静置（37℃培养箱）至出现明显条带（3h－20h）。

（6）用50ml TE buffer洗膜5min停止显色，白光拍照记录。结果见图3，在检测的8株PCR阳性StCYP77A2植株中，有两个株系出现杂交信号，且皆为双拷贝，对照植株没有显示条带，证明目的基因已经整合到烟草NC89的基因组中。

实施例4转StCYP77A2基因烟草抗病性分析

取黄萎病病原菌（V.dahliae），进行固体培养：在察氏固体培养基上28℃恒温培养，2周后菌落基本覆盖整个平板，挑去1cm²大小带培养基菌块3～5块放入察氏液体培养基中28℃恒温下振荡（150rpm）培养10d后，用8层纱布过滤，以考马斯亮蓝法测定并调整粗毒素浓度至8mg/mL。侵染过程分为两种方法，第一种灌根法：将制备好的菌液粗毒素倒入野生型和转基因材料的小杯中，直至饱和流出，以无菌水处理为对照，处理时间为下午5点，接种后置于单独的温室大棚内继续生长，生长条件为25±1℃，正常光照。第二种伤根法：将野生型和转基因材料从土壤中取出，放入含有毒素的试管中培养，以无菌水处理做对照。本实验各选取RT-PCR中mRNA表达量最多的两个株系进行抗病性分析。

接种后2d-10d内进行发病调查，以无新增发病植株时的最后一次调查结果计算病情指数和发病率。分级标准计算方法：0级：叶片上无病斑；1级：1～2枚叶片出现萎凋；2级：3～5枚叶片出现萎凋；3级：大部分叶片出现萎凋；4级：植株萎凋枯死或即将萎凋枯死（叶鹏盛，2006）。发病率的计算公式为发病率＝发病株数×100％/调查总株数。病情指数=[∑（病级株数×代表数值）/株数总和×发病最高级的代表数值]×100。

转StCYP77A2基因烟草株系77-9和77-11及其野生型NC89的黄萎病菌接种试验结果如图4～5和表1所示，在接种后3天，对照植株整株萎焉，而转基因烟草株系77-11则仍然健康；表1中结果表明，转基因烟草株系77-9和77-11的发病率为33.33%和55.56%，低于对照的100%；转基因烟草株系77-9和77-11的病情指数均为33.33，低于对照的77.78。抗病性鉴定发现，StCYP77A2转基因植株的其发病率为对照的1/3到1/2，病情指数为对照的一半。这些结果提示，StCYP77A2基因具有抗黄萎病能力，表明在茄科作物抗病育种中StCYP77A2具有应用潜力。

表1转StCYP77A2基因烟草抗病性鉴定

Claims (6)

1.StCYP77A2基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的StCYP77A2基因编码的蛋白质StCYP77A2，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的StCYP77A2基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是以PCB2008E为出发载体，将权利要求1所述的StCYP77A2基因插入PCB2008E的Hind III和BamH I酶切位点间所得。

5.权利要求1所述的StCYP77A2基因在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

6.权利要求3或4所述的StCYP77A2基因的表达载体在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。