CN102492721A - 一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法 - Google Patents
一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102492721A CN102492721A CN2011104124531A CN201110412453A CN102492721A CN 102492721 A CN102492721 A CN 102492721A CN 2011104124531 A CN2011104124531 A CN 2011104124531A CN 201110412453 A CN201110412453 A CN 201110412453A CN 102492721 A CN102492721 A CN 102492721A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sesame
- explant
- agrobacterium
- agriculture bacillus
- bacillus mediated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及了一种农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法,由以下方法获得:(1)以萌发芝麻种子的下胚轴为外植体,进行农杆菌侵染和共培养;(2)对外植体进行抗性愈伤组织的诱导及再生;(3)通过获得抗性愈伤组织进而获得抗性再生植株;(4)通过PCR和GUS染色方法检测植株。具有以下优点:(1)以芝麻萌发种子的下胚轴为外植体,并采用农杆菌介导方法完成遗传转化,试验材料的预处理及试验操作步骤简便易行,周期短,试验开展不受芝麻生产季节限制;(2)该方法通过愈伤组织诱导及分化等步骤获得转基因植株,遗传转化效率高,成本低,且转基因材料繁殖快速方便,可在短时间内为芝麻功能基因研究提供大批试验材料;(3)该方法可用于今后的芝麻基因组大片段的转基因研究、芝麻转基因种质创新和突变体库构建以及重要基因的功能分析等研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种以芝麻下胚轴为外植体的农杆菌介导的芝麻遗传转化方法,属于植物转基因技术领域。
背景技术
近年来转基因技术已成为植物分子生物学研究强有力的实验手段,更是基因功能和基因组研究必不可少的实验工具。由于芝麻属于植株再生较困难的作物,芝麻转基因技术进展缓慢。我国尚未有芝麻转基因获得成功的研究报道,国外公开报道的芝麻转基因技术多采用农杆菌侵染茎尖等外植体,通过诱导丛生芽获得转基因植株。但由于此方法不具有重复性,转化效率低,不能很好地用于芝麻分子生物学研究。因此,当前急需探讨一种稳定高效的芝麻遗传转化技术方法,为芝麻重要基因的功能验证及芝麻T-DNA插入突变体库构建等提供技术支撑。
发明内容
本发明目的在于提供一种以芝麻下胚轴为外植体,采用农杆菌介导进行外源基因转化成功获得抗性芝麻愈伤组织及植株农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法。
为了实现上述目的,本发明的技术方案采用了一种农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法,由以下方法获得:
(1)以萌发芝麻种子的下胚轴为外植体,进行农杆菌侵染和共培养;
(2)对外植体进行抗性愈伤组织的诱导及再生;
(3)通过获得抗性愈伤组织进而获得抗性再生植株;
(4)通常PCR和GUS染色方法检测植株。
步骤(1)中外植体的获得方法如下:首先挑选饱满健康的芝麻种子,在超净工作台内表面消毒后,加入无菌水培养到种子露白;然后在无菌条件下接种于培养基上,在25℃~28℃的温度下培养,下胚轴长约4-5cm时,将下胚轴切成0.2-0.8cm时小段待用。
所述的培养基的组成为MS培养基+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂粉,pH为5.8。
步骤(1)的侵染和共培养为:在超净工作台上,用共培养液体培养基将带有表达载体质粒(如pBI121)的农杆菌4404菌株稀释至OD600值为0.5;将切好的0.5cm芝麻下胚轴小段浸泡在农杆菌液体中,10min后,用灭菌滤纸吸干外植体周围多余的菌液;将外植体放在铺有一层灭菌滤纸的共培养固体培养基上,用封口膜封口,共培养2天。
所述的液体培养基组成为:MS+0.1mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖,pH为5.8。
所述的固体培养基组成为MS+0.1m g·L-1NAA+2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂,pH为5.8。
步骤(3)的抗性愈伤组织诱导及再生具体为:先共培养2天后,将外植体放于抗性愈伤诱导培养基上;待愈伤上出现绿色的小芽时,将其剥离继代到抗性筛选培养基上,之后进行生根培养。
所述的抗性愈伤诱导培养基组成为:MS+0.1mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA+8g·L-1琼脂+30mg·L-1卡那霉素+500mg g·L-1头孢霉素+30g·L-1蔗糖。
所述的继代到抗性筛选培养基组成为MS+8g·L-1琼脂+20mg·L-1卡那霉素+200mg·L-1头孢霉素+30g·L-1蔗糖,pH为5.8。
本发明的方法以芝麻下胚轴为外植体,采用农杆菌介导方式,在转化过程中筛选使用最适于芝麻遗传转化的农杆菌浓度、浸染时间、共培养时间、抗生素筛选浓度和时间,诱导出抗性愈伤及抗性植株,最终获得了芝麻转基因植株。本发明建立了一套完整的农杆菌介导的芝麻遗传转化技术体系,利用该方法可以高效地获得芝麻抗性愈伤组织,并成功完成愈伤组织分化和转基因植株再生过程;解决了芝麻遗传转化的技术难题,为芝麻重要基因的功能验证、T-DNA插入突变体库构建等研究奠定了技术基础,促进了我国芝麻基因工程技术的发展。具有以下优点:(1)以芝麻萌发种子的下胚轴为外植体,并采用农杆菌介导方法完成遗传转化,试验材料的预处理及试验操作步骤简便易行,周期短,试验开展不受芝麻生产季节限制;(2)该方法通过愈伤组织诱导及分化等步骤获得转基因植株,遗传转化效率高,成本低,且转基因材料繁殖快速方便,可在短时间内为芝麻功能基因研究提供大批试验材料;(3)该方法可用于今后的芝麻基因组大片段的转基因研究、芝麻转基因种质创新和突变体库构建以及重要基因的功能分析等研究。
附图说明:
图1是下胚轴与农杆菌共培养;
图2是农杆菌浸染后,对下胚轴进行愈伤组织诱导培养;
图3是对抗性愈伤组织进行分化培养;
图4是获得的抗性再生幼苗;
图5是对获得的抗性再生植株进行生根培养;
图6是抗性再生植株营养钵移栽;
图7是转基因植株的PCR检测,M:DL2000;1:以水为模板的阴性对照;2:未进行遗传转化的普通植株;3:假阳性转基因植株;4:阳性转基因植株;
图8是转基因愈伤的GUS染色检测,1:阴性对照;2-3:假阳性转基因植株,GUS染色为无色;4:阳性转基因植株,GUS染色为兰色;
图9是转基因植株叶片GUS染色(左图为对照;右图为转基因植株GUS染色为阳性)。
具体实施方式
本实施例以农杆菌介导的pBI121空表达载体芝麻遗传转化的方法,包括以下步骤:
(1)无菌外植体的获得
1)挑选饱满健康的野芝1号芝麻种子,在超净工作台内用70%乙醇表面消毒种子1min,然后用3%次氯酸钠消毒8~10min;无菌水冲洗种子3次,加入无菌水振荡培养18-24h,待到种子露白;
2)在无菌条件下接种于培养基(MS培养基+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂粉,pH=5.8)上,25℃~28℃培养,6d后将下胚轴切成0.5cm左右小段待用;
(2)浸染和共培养
1)农杆菌活化:挑取带有表达载体质粒pBI121的农杆菌4404菌株,接种于农杆菌液体培养基中(LB液体培养基+50mg·L-1卡那霉素+20mg·L-1利福平,pH=7.0),28℃振荡培养,用于活化菌株;
2)农杆菌培养:蘸取少量农杆菌菌液在平板培养基(LB固体培养基+50mg·L-1卡那霉素+20mg.L-1利福平,pH=7.0)划单菌落培养,28℃下过夜。挑取单菌落于农杆菌液体培养基中(成分同上),28℃振荡培养。待菌株进入对数生长期时,离心收集菌体。然后用LB液体共培养基悬浮,使OD600约为0.5;
3)农杆菌侵染前处理:在超净工作台上,用共培养液体培养基(MS+0.1mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖,pH=5.8)将带有表达载体质粒pBI121的农杆菌4404菌株稀释至OD600值为0.5;
4)将切好的0.5cm芝麻下胚轴小段浸泡在农杆菌液体中,10min后,用灭菌滤纸吸干外植体周围多余的菌液;
5)将外植体放在铺有一层灭菌滤纸的共培养固体培养基(MS+0.1mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂,pH=5.8)上,用封口膜封口,共培养2天(图1);
(3)抗性愈伤组织诱导及再生
1)共培养2天后,将外植体放于抗性愈伤诱导培养基(MS+0.1mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA+8g·L-1琼脂+30mg·L-1卡那霉素+500mg·L-1头孢霉素+30g·L-1蔗糖)上(图2);
2)待愈伤上出现绿色的小芽时(图3),将其剥离继代到抗性筛选培养基(MS+8g·L-1琼脂+20mg·L-1卡那霉素+200mg·L-1头孢霉素+30g·L-1蔗糖,pH=5.8)上(图4),之后进行生根培养(图5)及植株移栽(图6);
(4)转基因植株的检测
1)PCR检测:无菌条件下取小植株2-3片叶,提取DNA,进行标记基因的PCR扩增(图7),GUS基因引物为:
Forward Prim er:5’-TTGCA ACTGGACAAGGCACTAGCGG-3’;
Reverse Primer:5’-ACATTGACGCAGGTGATCGGACGC-3’,
扩增片段长度为712bp,扩增程序为:95℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火1min,72℃延伸40s,35个循环,72℃延伸10min;
2)GUS染色检测:抗性愈伤gus基因组织化学检测:将0.1g愈伤置于1.5mL无菌的Eppendorf管中,加入200μL gus组织化学检测液,37℃保温摇晃培养过夜,70%的酒精洗涤愈伤三次,呈现蓝色的愈伤为阳性愈伤。以未转基因的作为对照,(图8)。
再生植株叶片gus基因组织化学检测:将切成小块的叶片转到0.5mL无菌的Eppendorf管中,加入20μL gus组织化学检测液,37℃保温培养过夜,70%的酒精洗涤三次,呈现深蓝色者为阳性。以未转基因的作为对照,(图9)。gus组织化学检测液组成:50mmol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0),5mmol·L-1K4Fe(CN)6,5mmol·L-1K3Fe(CN)6,10mmol·L-1EDTA,0.1%TritonX-10,0.1mg·mL-1X-Gluc。
Claims (9)
1.一种农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法,其特征在于:由以下方法获得:
(1)以萌发芝麻种子的下胚轴为外植体,进行农杆菌侵染和共培养;
(2)对外植体进行抗性愈伤组织的诱导及再生;
(3)通过获得抗性愈伤组织进而获得抗性再生植株;
(4)通常PCR和GUS染色方法检测植株。
2.根据权利要求1所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法,其特征在于:步骤(1)外植体的获得方法如下:首先挑选饱满健康的芝麻种子,在超净工作台内表面消毒后,加入无菌水培养到种子露白;然后在无菌条件下接种于培养基上,在25℃~28℃的温度下培养,下胚轴长约4-5cm时,将下胚轴切成0.2-0.8cm时小段待用。
3.根据权利要求2所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法,其特征在于:所述培养基的组成为MS培养基+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂粉,pH为5.8。
4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法,其特征在于:
步骤(1)的侵染和共培养为:在超净工作台上,用共培养液体培养基将带有表达载体质粒pBI121的农杆菌4404菌株稀释至OD600值为0.5;将切好的0.5cm芝麻下胚轴小段浸泡在农杆菌液体中,10min后,用灭菌滤纸吸干外植体周围多余的菌液;将外植体放在铺有一层灭菌滤纸的共培养固体培养基上,用封口膜封口,共培养2天。
5.根据权利要求4所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法,其特征在于:所述的液体培养基组成为:MS+0.1mg·L-1 NAA+2mg·L-1 6-BA+30g·L-1蔗糖,pH为5.8。
6.根据权利要求4所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法,其特征在于:所述的固体培养基组成为MS+0.1m g·L-1 NAA+2mg·L-1 6-BA+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂,pH为5.8。
7.根据权利要求1所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法,其特征在于:步骤(3)的抗性愈伤组织诱导及再生具体为:先共培养2天后,将外植体放于抗性愈伤诱导培养基上;待愈伤上出现绿色的小芽时,将其剥离继代到抗性筛选培养基上,之后进行生根培养。
8.根据权利要求7所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法,其特征在于:所述的抗性愈伤诱导培养基组成为:MS+0.1mg·L-1 NAA+2mg·L-1 6-BA+8g·L-1琼脂+30mg·L-1卡那霉素+500mg·L-1头孢霉素+30g·L-1蔗糖。
9.根据权利要求7所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法,其特征在于:所述的继代到抗性筛选培养基组成为MS+8g·L-1琼脂+20mg·L-1卡那霉素+200mg·L-1头孢霉素+30g·L-1蔗糖,pH为5.8。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011104124531A CN102492721A (zh) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | 一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011104124531A CN102492721A (zh) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | 一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102492721A true CN102492721A (zh) | 2012-06-13 |
Family
ID=46184583
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011104124531A Pending CN102492721A (zh) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | 一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102492721A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104593410A (zh) * | 2015-01-05 | 2015-05-06 | 北京农学院 | 一种基于发根农杆菌介导的草莓转基因方法 |
CN106399355A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-02-15 | 华中农业大学 | 一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法 |
CN109207514A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-01-15 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 高山杜鹃农杆菌介导的整株感染法的高效遗传转化方法 |
CN109652444A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-04-19 | 中国科学院武汉植物园 | 发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用 |
CN114807219A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-07-29 | 河南省农业科学院芝麻研究中心 | 一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03164118A (ja) * | 1989-08-24 | 1991-07-16 | Ajinomoto Co Inc | ゴマ野生種の植物体再生方法 |
CN101445808A (zh) * | 2008-11-24 | 2009-06-03 | 广东省农业科学院作物研究所 | 以花生种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法 |
-
2011
- 2011-12-12 CN CN2011104124531A patent/CN102492721A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03164118A (ja) * | 1989-08-24 | 1991-07-16 | Ajinomoto Co Inc | ゴマ野生種の植物体再生方法 |
CN101445808A (zh) * | 2008-11-24 | 2009-06-03 | 广东省农业科学院作物研究所 | 以花生种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法 |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
《Plant Cell Tiss Organ Cult》 20100713 Manju Yadav et al Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.) 摘要部分 1-9 第103卷, * |
《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技特辑》 20110331 崔彦慧 农杆菌介导芝麻转双价抗虫基因的研究 第16页第21-31行、第17页第9行至第19页第22行、第20页第19-21行 1-9 , 第3期 * |
KEMAL MELIH TASKIN: "A.tumefaciens-mediated transformation of sesame", 《TR. J. OF BOTANY》, vol. 23, 31 December 1999 (1999-12-31), pages 291 - 295 * |
MANJU YADAV ET AL: "Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.)", 《PLANT CELL TISS ORGAN CULT》, vol. 103, 13 July 2010 (2010-07-13) * |
卫双玲 等: "芝麻子叶及下胚轴愈伤组织诱导研究", 《河南农业科学》, no. 2, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 41 - 45 * |
崔彦慧: "农杆菌介导芝麻转双价抗虫基因的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技特辑》, no. 3, 31 March 2011 (2011-03-31) * |
易永华 等: "黑芝麻不同外植体离体培养研究", 《西北农业学报》, vol. 6, no. 4, 31 December 1997 (1997-12-31) * |
石淑稳 等: "芝麻下胚轴愈伤组织的诱导和植株再生", 《植物生理学通讯》, 29 August 1989 (1989-08-29) * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104593410A (zh) * | 2015-01-05 | 2015-05-06 | 北京农学院 | 一种基于发根农杆菌介导的草莓转基因方法 |
CN106399355A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-02-15 | 华中农业大学 | 一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法 |
CN109207514A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-01-15 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 高山杜鹃农杆菌介导的整株感染法的高效遗传转化方法 |
CN109207514B (zh) * | 2018-10-23 | 2020-04-24 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 高山杜鹃农杆菌介导的整株感染法的高效遗传转化方法 |
CN109652444A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-04-19 | 中国科学院武汉植物园 | 发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用 |
CN109652444B (zh) * | 2019-02-26 | 2022-04-22 | 中国科学院武汉植物园 | 发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用 |
CN114807219A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-07-29 | 河南省农业科学院芝麻研究中心 | 一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法 |
CN114807219B (zh) * | 2022-04-15 | 2024-02-09 | 河南省农业科学院芝麻研究中心 | 一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113604490B (zh) | 猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用 | |
CN104004781A (zh) | 一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法 | |
CN103966258A (zh) | 一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法 | |
CN102492721A (zh) | 一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法 | |
CN106636181A (zh) | OsSAPK9蛋白及其编码基因在提高水稻白叶枯病抗性中的应用 | |
CN103444524B (zh) | 一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法 | |
CN104450779A (zh) | 一种快速高效的农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化方法 | |
CN111876439B (zh) | 一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法 | |
CN103060372B (zh) | 一种农杆菌介导的培育转基因旱柳植株的方法 | |
CN110305894B (zh) | 一种快速高效的楸遗传转化方法 | |
CN102337295A (zh) | 一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法 | |
CN103215285B (zh) | 野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用 | |
CN116083445A (zh) | 一种CrBZR1基因及其应用 | |
CN102286527A (zh) | Dreb基因转化红掌的遗传转化方法 | |
CN102002512A (zh) | 一种大豆遗传转化方法 | |
CN105039391A (zh) | 一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法 | |
CN104542295A (zh) | 一种青蒿转基因育种方法 | |
CN103952426A (zh) | 一种含有双报告基因的双t-dna载体及其构建方法和应用 | |
CN104017823B (zh) | 一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法 | |
CN102181476B (zh) | 一种删除转基因杨树选择标记基因的方法 | |
CN102031270A (zh) | 利用农杆菌介导高效转化体系培养苹果幼苗的方法 | |
CN109371060A (zh) | 一种桃叶卫矛快速转基因的方法 | |
CN102260706A (zh) | 一种农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的方法 | |
CN100469886C (zh) | 一种非胚转基因法制备转基因棉花的方法 | |
CN100366748C (zh) | 农杆菌介导大豆胚尖再生系统的高效遗传转化方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120613 |
|
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120613 |