CN109652444A - 发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用，涉及桃生物技术和分子育种领域。本方法是：①无菌实生苗培养；②转化受体材料外植体制备；③侵染菌液制备；④侵染；⑤共培养；⑥转基因根诱导培养；⑦转基因根检测；⑧复合型桃植株获得。本方法的应用是：①获得含重要农艺性状基因的转基因根+野生芽复合型桃植株；②进行桃根结线虫抗性改良研究；③进行桃根系干旱、盐碱的胁迫抗性研究。本发明不仅可以获得转基因根+野生芽复合型桃植株，而为今后开展桃根系病虫害及抗性育种研究提供了重要的技术支撑。

Description

发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用
技术领域
本发明涉及桃生物技术和分子育种领域，尤其涉及一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用；具体地说，发根农杆菌介导的桃转化方法体系建立为开展桃耐盐碱，抗重金属毒害、抗涝、抗线虫等方面的研究及加强桃抗性育种奠定了基础。
背景技术
植物转基因技术是将感兴趣的外源基因转入植物的基因组上，以获得含目标性状植株的方法，其主要应用于植物性状分子机理基础研究和植物品种改良以及新品种培养等方面。目前，一些重要的农作物如棉花、大豆、水稻和苹果等通过转基因技术改良已获得了具有高产、高抗、多抗和高品质等优良性状的转基因新品种，为推动未来农业的发展奠定了基础。
桃是多年生类重要的核果果树，基因组大小230Mb，约为拟南芥基因组大小的两倍，其稳定转化工作难度较大，严重阻碍了桃的分子遗传改良研究进程。目前仅有少量文献报道桃的农艺性状探索研究，尚无高效稳定的转基因体系建立公布。另外，转基因植物通常是利用农杆菌介导离体外植体进行转化获得转基因植株。农杆菌有两种，一种是根癌农杆菌，该类型的菌株被广泛地用于转基因植株的获得；另一种是发根农杆菌，主要是用于转基因根的获得。通过总结前人的研究发现，利用根癌农杆菌介导桃外植体转化极难获得桃转基因材料。因此，建立高效稳定的转化体系已成为当前致力于桃农艺性状基础研究和分子遗传改良研究迫切待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于攻克桃稳定转化难的技术瓶颈，提供一种一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用，即利用发根农杆菌介导桃芽段外植体稳定转化获得转基因根+野生型芽桃复合型株系的体系建立。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
通过将目的基因插入表达载体，利用发根农杆菌的侵染实现外源基因向植物体细胞的转移和整合，将外植体培养在无激素的筛选培养基上筛选培养，被菌液侵染的伤口处先形成瘤状组织，再分化形成根，在体视荧光显微镜下观察红色荧光蛋白激发的荧光，确定转基因根。该方法操作简单，周期短，从侵染到转基因根的获得仅需1个月时间即可获得转基因根+野生型芽桃复合型株系，因此该方法适用于针对桃根病害及抗耐性方面的研究。
一、发根农杆菌介导的桃芽段株稳定转化方法
本方法包括下列步骤：
①无菌实生苗培养
A、收集以枣油桃7成熟果实，去除果肉，用20%的商业化漂白剂浸泡30min后，去除漂白剂，风干桃核，4℃保存2个月；
B、4℃取出桃核，去除内果皮，在超净台上，将枣油桃种子置于烧杯中，用 75%的酒精消毒种子30s和20% 商业化漂白剂附加0.02% Tween-20混合消毒液搅拌器浸泡25min后，无菌水润洗6-8次，将种子置于新的装有ddH2O的无菌瓶中过夜；
C、在超净台上，用无菌刀片去除种皮，将种子接种在1/2MS + 0.05mg/L IBA + 0.5mg/L 6-BA发芽培养基，培养基PH 5.8，25±1℃，黑暗条件培养15d；实生苗茎段长10cm后，移至25±1℃，16h光照，8h黑暗的光周期条件下生长10d，叶片完全舒展和变绿；
②转化受体材料外植体制备
将约1.5cm长的芽段外植体从无菌苗上切割下来作为转化用的受体材料，切口斜切，以增加菌与伤口的接触面积；
③侵染菌液制备
本实验使用的转基因菌株是携带红色荧光蛋白基因35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌菌株；从-80℃冰箱取出保存在甘油中的MSU440转基因菌，于LB固体培养基附加50mg/L壮观霉素的培养皿上划线，28℃暗处倒置培养36 -48h获得单菌落；挑取单菌落于100mL LB液体培养基附加50mg/L壮观霉素的无菌培养瓶中，200rpm，28℃振荡培养至菌液浓度是OD600 0.8，4000rpm，5min离心菌液，除去上清液，剩下的菌用适量体积的重悬液MS+2%蔗糖+20mg/L AS重悬培养1.5-2h后，作为待用侵染液，待用侵染液浓度是OD600 0.8；
④侵染
用含有35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌重悬液OD600 0.8侵染有伤口的外植体30min；
⑤共培养：
用无菌滤纸吸干芽段外植体上的菌液，然后接种在MS + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂 + 20mg/L AS共培养基， 25+1℃，黑暗条件共培养3d；
⑥转基因根诱导培养
用400mg/L头孢润洗液润洗共培养3d的芽段外植体3-5次，然后置于无菌滤纸吸干水后，将接种在MS + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂 + 400mg/L头孢 + 50mg/L 壮观霉素的诱导培养基，25±1℃，黑暗条件培养诱导转基因毛状根发生；
⑦转基因根检测
待根发出后，在体视荧光显微镜下观察MSU440发根农杆菌诱导获得的毛状根激发的红色荧光蛋白信号，初步确定其转基因根，PCR实验对其再进行确定为转基因根；
⑧复合型桃植株获得
将含有转基因根的复合型植株在16h光照，8h黑暗光周期，25±1℃条件，水培一周后栽培到含营养元素的土壤中生长以获得含转基因根的复合型桃植株。
工作机理：本发明充分利用发根农杆菌能诱导植物外植体伤口细胞分化再生出根的特性；我们利用含目标基因表达盒的发根农杆菌菌液侵染外植体的伤口，使外源目标基因片段向植物体细胞转移和整合，然后将菌液侵染过的外植体培养在无激素的筛选培养基上筛选培养，被菌液侵染的伤口处会形成瘤状组织，再分化形成根，最后通过对再生根进行阳性检测，确定其是否为转基因根。
二、发根农杆菌介导的桃复合植株稳定转化方法的应用
①获得含重要农艺性状基因的转基因根+野生芽复合型桃植株：例如糖酸含量、色素积累等重要果实性状，可以通过复合型植株中转基因根系研究代谢通路；
②进行桃根结线虫抗性改良研究：复合型植株可用于生物学逆境抗性转基因材料的创制及抗性机理相关研究；
③进行桃根系干旱、盐碱等胁迫抗性研究：复合型植株可用于创制非生物学逆境，如干旱、盐碱等转基因材料，并用于相关抗性机理的研究。
与现有桃基因功能研究的转化技术比较，本发明具有下列优点和积极效果：
①打破了获得桃转基因材料难的技术瓶颈，利用发根农杆菌介导桃芽段外植体稳定转化，在短时间内就可以获得转基因根材料+野生型芽桃复合型株系；
②成功构建了桃的转化体系，使当前桃依赖于番茄、烟草等模式植物受体开展的桃基因功能研究转向在桃本体开展相关的基因功能研究成为可能；
③本发明所建立的转化体系稳定，转化率高，耗时短，为今后开展桃病虫害及抗耐性研究提供了重要的技术支撑，同时，将推动桃的重要性状的分子遗传改良研究发展，为获得优良目标性状的桃品种奠定了基础；
④本发明是国内外首次公开的桃稳定转化方法，与其他农作物的转化方法相比，利用该方法获得桃复合型植株其转基因部分仅仅是地下的根，不存在转基因安全风险，使今后利用和推广优良性状的转基因桃植物成为可能。
附图说明
图1是发根农杆菌介导的桃芽段外植体转化过程和转基因根获得及检测图，
a：无菌苗培养；
b：转化受体材料外植体制备；
c：菌液侵染外植体；
d：共培养；
e-g：转基因根诱导及获得；
h-i：荧光显微镜检测转基因根：检测到红色荧光蛋白信号的是阳性转基因根系。
图2是复合植株根系PCR阳性鉴定图。
图3是转基因桃复合型植株水培图。
图4是转基因桃复合型植株土培生长图。
具体实施方式
实施例1：
本方法利用携带红色荧光蛋白基因35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌介导枣油桃转化获得了表达红色荧光蛋白的转基因根+野生型芽桃复合型株系；DsRED1基因的大小是443bp，表达的产物红色荧光蛋白在体视荧光显微镜下能激发强力的红色荧光信号。本体系具体实施步骤如下：
①无菌实生苗培养：见图1a，由此可见实生苗获得。
A、收集以枣油桃7成熟果实，去除果肉，用20%的商业化漂白剂浸泡30min后，去除漂白剂，风干桃核， 4℃保存2个月；
B、4℃取出桃核，去除内果皮，在超净台上，将枣油桃种子置于烧杯中，用 75%的酒精消毒种子30s和20% 商业化漂白剂附加0.02% Tween-20混合消毒液搅拌器浸泡25min后，无菌水润洗8次，将种子置于新的装有ddH2O的无菌瓶中过夜；
C、在超净台上，用无菌刀片去除种皮，将种子接种在1/2MS + 0.05mg/L IBA + 0.5mg/L 6-BA发芽培养基，培养基PH 5.8，25℃，黑暗条件培养基15d。实生苗茎段长10cm后，16h光照，8h黑暗的光周期条件下生长10d，叶片完全舒展和变绿；
②外植体制备：见图1b，由此可见芽段外植体准备。
将约1.5cm长的芽段外植体从无菌苗上切割下来作为转化用的受体材料，切口斜切，以增加菌与伤口的接触面积；
③侵染菌液制备:
本实验使用的转基因菌株是携带红色荧光蛋白基因35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌菌株。从-80℃冰箱取出保存在甘油中的MSU440转基因菌，在LB固体培养基附加50mg/L壮观霉素的培养皿上划线，28℃暗处倒置培养36h获得单菌落；挑取单菌落于100mLLB液体培养基附加50mg/L壮观霉素的无菌培养瓶中，200rpm，28℃振荡培养至菌液浓度是OD600 0.8，4000rpm/5min离心菌液，除去上清液，剩下的菌用适量体积的重悬液MS+2%蔗糖+20mg/L AS重悬培养2h后，作为待用侵染液，待用侵染液浓度是OD600 0.8；
④侵染：见图1c，由此可见菌液侵染外植体。
用含有35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌重悬液,OD600 0.8,侵染有伤口的外植体30min；
⑤共培养：见图1d，由此可见菌与外植体共培养3d。
用无菌滤纸吸干芽段外植体上的菌液，然后接种在MS + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂 +20mg/L AS共培养， 25℃，黑暗条件共培养3d；
⑥转基因根诱导培养: 见图1e-g,由此可见诱导获得转基因根。
用400mg/L头孢润洗液润洗共培养3d的芽段外植体5次，然后置于无菌滤纸吸干水后，将接种在MS + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂 + 400mg/L头孢 + 50mg/L 壮观霉素的诱导培养基, 培养基PH 5.8，25℃，黑暗条件培养诱导转基因毛状根发生，培养30d后，在伤口处形成的瘤状组织分化形成根。
⑦转基因根检测：见图1h-i和图2，由此可见转基因根检测结果为阳性。
在体视荧光显微镜下观察MSU440发根农杆菌诱导获得的毛状根激发的红色荧光蛋白信号，初步确定其转基因根，PCR实验对其再进行确定为转基因根。
⑧将含有转基因根的复合型植株在16h光照，8h黑暗光周期，25℃条件，水培1周后,栽培到含营养元素的土壤中生长以获得含转基因根的复合型桃植株。见图3，由此可见转基因桃复合型植株水培过程和见图4转基因桃复合型植株土培生长。
本发明的具体技术效果如下：
桃的稳定转化再生困难是制约桃稳定改良研究的主要瓶颈。本发明利用发根农杆菌介导桃稳定转化，将红色荧光蛋白基因35S：：DsRED1标记基因成功转入桃体细胞，通过诱导培养获得再生的转基因根，创造出转基因根+野生型芽复合型桃株系，突破了桃转化难的技术阻碍，为桃根系抗性育种方面的研究提供了技术支持。

Claims (2)

1.一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法，其特征在于：
①无菌实生苗培养
A、收集以枣油桃7成熟果实，去除果肉，用20%的商业化漂白剂浸泡30min后，去除漂白剂，风干桃核，4℃保存2个月；
B、4℃取出桃核，去除内果皮，在超净台上，将枣油桃种子置于烧杯中，用 75%的酒精消毒种子30s和20% 商业化漂白剂附加0.02% Tween-20混合消毒液搅拌器浸泡25min后，无菌水润洗6-8次，将种子置于新的装有ddH2O的无菌瓶中过夜；
C、在超净台上，用无菌刀片去除种皮，将种子接种在1/2MS + 0.05mg/L IBA + 0.5mg/L 6-BA发芽培养基，培养基PH 5.8，25+1℃，黑暗条件培养15d；实生苗茎段长10cm后，移至25+1℃，16h光照，8h黑暗的光周期条件下生长10d，叶片完全舒展和变绿；
②转化受体材料外植体制备
将约1.5cm长的芽段外植体从无菌苗上切割下来作为转化用的受体材料，切口斜切，以增加菌与伤口的接触面积；
③侵染菌液制备
本实验使用的转基因菌株是携带红色荧光蛋白基因35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌菌株；从-80℃冰箱取出保存在甘油中的MSU440转基因菌，于LB固体培养基附加50mg/L壮观霉素的培养皿上划线，28℃暗处倒置培养36 -48h获得单菌落；挑取单菌落于100mL LB液体培养基附加50mg/L壮观霉素的无菌培养瓶中，200rpm，28℃振荡培养至菌液浓度是OD600 0.8，4000rpm/5min离心菌液，除去上清液，剩下的菌用适量体积的重悬液MS+2%蔗糖+20mg/L AS重悬培养1.5-2h后，作为待用侵染液，待用侵染液浓度是OD600 0.8；
④侵染
用含有35S：：DsRED1表达盒的MSU440发根农杆菌重悬液OD600 0.8侵染有伤口的外植体30min；
⑤共培养：
用无菌滤纸吸干芽段外植体上的菌液，然后接种在MS + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂 + 20mg/L AS共培养基， 25+1℃，黑暗条件共培养3d；
⑥转基因根诱导培养
用400mg/L头孢润洗液润洗共培养3d的芽段外植体3-5次，然后置于无菌滤纸吸干水后，将接种在MS + 3%蔗糖 + 0.8%琼脂 + 400mg/L头孢 + 50mg/l 壮观霉素的诱导培养基，25+1℃，黑暗条件培养诱导转基因毛状根发生；
⑦转基因根检测
待根发出后，在体视荧光显微镜下观察MSU440发根农杆菌诱导获得的毛状根激发的红色荧光蛋白信号，初步确定其转基因根，PCR实验对其再进行确定为转基因根；
⑧复合型桃植株获得
将含有转基因根的复合型植株在16h光照，8h黑暗光周期，25+1℃条件，水培1周后栽培到含营养元素的土壤中生长以获得含转基因根的复合型桃植株。
2.一种发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法的应用
①获得含重要农艺性状基因的转基因根+野生芽复合型桃植株；
②进行桃根结线虫抗性改良研究；
③进行桃根系干旱、盐碱的胁迫抗性研究。
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