CN101979602B - 一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法，步骤是：A、农杆菌培养及转化前处理；B、超声辅助农杆菌介导的遗传转化：选择植株，去除开放的花朵，将植株的花序用转化培养基溶解的农杆菌菌液进行不同时间倒置超声侵染处理，标明处理时间，侵染完后倒置油菜，将其处理部位用保鲜膜套住，阴处平放，除去保鲜膜，蒸馏水冲洗植株后，于土壤钵中置培养，待成熟期收获种子；C、卡那霉素抗性筛选：将收集到的部分T1代种子进行卡那霉素抗性植株筛选；D、PCR检测抗性植株中的基因：将筛选到的抗性植株进行PCR快速检测。方法易行，操作简便，成本低，可2人1天内同时对1500-2000株植株进行转化，加强了菌液的渗透率，显著提高了遗传转化效率。

Description

一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物转基因领域，更具体涉及一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化的转基因方法，适用于油菜、芝麻、大豆、拟南芥等大部分作物的转基因。

背景技术

随着DNA重组和植物组织培养技术的发展，分子育种已成为植物育种的一个重要研究领域。植物分子育种即基因工程育种，经过多年的科学实践已发展建立了一整套有别于传统植物遗传育种的、切实可行的外源基因（DNA）转化、筛选和鉴定的技术。由于它可以打破物种间遗传物质横向转移的壁垒，创造出新的作物品种，因此为作物品种改良开辟了一条更为直接有效的途径。基因工程育种方法可分为3类：直接基因导入法（通过物理或化学方法引起）和载体介导法（即将目的基因插入到农杆菌质粒或病毒DNA 分子上，随着载体DNA 的转移而将目的基因导入植物基因组）以及第三类种质系统法（花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等）。以上方法获得的转基因植株多数通过组织培养途径获得，且转基因后代所形成的细胞无性系变异较大，遗传稳定性差，植株再生频率低。

    为了解决再生培养体系等问题，1993年，Bechtold等发明了截然不同于离体方法的in planta转化法，研究发现将活体拟南芥植株浸泡在农杆菌菌液的同时将菌液和植株进行抽真空处理，可明显提高基因的转移频率，转化率达到0.4%。（Bechtold N., Ellis J. and Pelletier G. In planta Aarobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R. Acad Sci Paris,  Life Sci., 1993, 316:1194-1199）。In planta法是以生物自身的种质细胞为媒体，特别是植物生殖系统的细胞(花粉，卵细胞，子房，幼胚等)，将外源DNA导入完整植物细胞，实现遗传转化的基因导入技术，称之为种质转化(germ line transformation)，也称为整株活体转化(in planta transformation)或植物原位转化（闫新甫主编.转基因植物.北京:科学出版社,2003）。In planta方法有多种: vacuum infiltration，floral-dip，spraying，点滴微管法等。近年来，floral-dip转化法（花序浸渍法）是拟南芥功能基因研究中广泛采用的一种In planta转基因方法。Feldmann和Marks（Feldmann K.A. and Marks M.D., 1987, Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach. Mol. Gen. Genet., 208:1-9）最先在拟南芥中应用原位渗透法获得了转基因成功。Chang等（Chang S.S., Park S.K. and Nam H.G., 1990, Transformation of Arabidopsis by Agrobacterium inoculation on wounds, Plant J., 5(4):551-558）利用摘下的幼嫩花序和受伤的拟南芥植株进行农杆菌接种感染获得转基因植株，但遗传转化率相对较低，而且遗传转化不稳定。Clough和Bent（Clough S.J. and Bent A. Floral-dip: a simplified method for Agrobacteruim-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J., 1998, 16:735-743）用拟南芥作为受体用表面活性剂silwet-77取代抽真空处理，通过floral-dip转移基因获得成功。Floral-dip转移外源基因的最大优点在于能直接获得转化的种子，避免了烦琐的组织培养和继代培养，并且基因转化频率高，一般在0.5%-1%（转基因成功种子与收获种子之比），且转基因后代遗传稳定（刘凡,王国英,曹鸣庆.2003,农杆菌介导的植物原位转基因方法研究进展,分子植物育种,1(1):108-116）.据报道In planta转基因方法已成功应用于苜蓿，白菜和萝卜中，在油菜中已有初步应用（Trieu A.T., Burleigh S.H., Kardailsky I.V., Maldonado-Mendoza I.E., Versaw W.K., Blaylock L.A., Shin H., Chiou T., Kataki H., Dewbre G.R., Weigel D., and Harrison M.J., 2000, Transformation of Medicago Truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium, Plant J., 22(6):531-541; Somers D.A., Samac D.A., and Olhoft P.M., 2003, Recent advances in Legume transformation, Plant Physiol., 131:892-899; Curtis I.S., and Nam H.G., 2001, Transgenic radish(Raphanussativus L. longipinnatus Bailey) by floral-dip method-plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency, Transgenic Research, 10:363-371; Cao M.Q., Liu F., Yao L., Bouchez D., Tourneur C., Li Y., and Robaglia C., 2000, Transformation of Pakchoi (Brassica rapa L.ssp.chinensis) by Agrobacterium infiltration, Mol. Breed., 6:67-72;徐光硕,饶勇强,陈雁,张椿雨,孟金陵,2004,用in planta方法转化甘蓝型油菜,作物学报,30(1):1-5），但转化频率仍然不高。芝麻作为世界上重要的油料作物之一，其组织培养研究较其他主要作物落后，组织培养再生比较困难（RAMR et al. Sesame: New approaches for crop improvement[C] //: JANICK J, SIMON J.E.(eds). Advances in New Crops: Timber Press, Portland, 1990:225-228. BEATRICE et al. In vitro regeneration of sesame( Sesamum indicum L.) from seedling cotyledon and hypocotyl explants[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2006, 85: 235-239），从而制约了芝麻再生技术体系的建立，极大地阻碍了芝麻细胞工程和遗传转化的深入研究，滞缓了芝麻生物技术育种的步伐。虽然研究者们在芝麻离体培养方面进行了较多的尝试，但相关研究报道不多. 2010年7月，Manju Yadav等才首次成功报道了利用农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，转化频率也仅为1.01%（Manju Yadav, Darshna Chaudhary, Manish Sainger, Pawan K. Jaiwal, 2010, Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.), Plant Cell Tissue and Organ Culture, DOI 10.1007/s 11240-010-9791-8）。芝麻组织培养研究的整体水平较低，且已有的研究结果重复性较差， 尚未形成一套通用的或具有突破性的高频率再生培养体系（孙建,张秀荣.芝麻组织培养研究进展与展望.山地农业生物学报.2009,28(1):72-78）。利用In planta植物遗传转化法，能直接获得转化的种子，避免了烦琐的组织培养和继代培养，同时为一些不易建立遗传再生体系的作物类型提供了基因转移的新途径，而且在拟南芥上的研究结果还表现出对基因型的不敏感性，一些应用其它方法转化率低的生态型，也能够获得较高的转化频率。（Mysore K S, Kumar C T, Stanton B G. Arabidopsis ecotypes and mutants that are recalcitrant to Agrobacterium root transformation are susceptible to germ line transformation. The plant Journal, 2000, 21(1):9-16）。但是此法在模式植物上的应用较多，其他作物上较为少见，有的甚至尚未成功，且有效性不高。当前，技术难点的攻克和空白薄弱领域的深入研究是影响高效稳定转基因植物研究取得突破的关键问题之一，因此有必要建立和发展多种植物遗传转化方法。

超声波作为一种物理手段也可以介导外源DNA分子进入带壁的植物细胞和组织。在超声转化条件下，以空化机制为主产生的高温高压作用于领近气泡周围的组织、气泡，从而可能导致这些细胞的细胞壁和质膜的击穿或可逆的质膜透性改变，使高分子的外源DNA进入细胞。贾士荣等(贾士荣,曹冬孙.转基因植物.植物学通报,1992,9:3-15)发展了这种转化方法，其转化率可达22.3%。王国英等（王国英,张宏,丁群星等.几种玉米基因转移技术的研究及转基因植株的获得.生物工程学报,1996,12(1):45-49）通过超声波处理，成功地把Bt基因导入玉米未成熟胚和胚性愈伤组织。章力健等（章力健,陈乐玫,袁静等.超声波直接导入外源基因高效烟草转化系统的建立.中国农业科学,1991,24(2):83-89）用超声波处理烟草叶片获得了gus表达的转基因烟草植株。Joersbo等（Joersbo M., Donalason I. and Kreiberg J., et al. Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Mol. Breed., 1998, 4:111-117）利用超声波法将cat基因导入甜菜和烟草原生质体，并获得短暂表达。Santarem( E.R. Santarém, H.N. Trick, J.S. Essig and J.J. Finer, Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression, Plant Cell Rep., 1998, (17), pp. 752–759)和Tang等（Tang, Additional virulence genes and sonication enhance Agrobacterium tumefaciens-mediated loblolly pine transformation, Plant Cell Rep., 2003, (21), pp. 555–562）利用农杆菌介导同时结合超声的方法在植物体内进行gus基因转化，有效的促进了gus基因在植物体内大量表达，并且发现超声处理从0.5到2秒时间段内，外源基因瞬间表达频率最高。Syed Sarfraz hassain（Syed Sarfraz hassain, Tayyab Husnain and S.Riazuddin, Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation( SAAT ): an alternative method for cotton transformation, Pak. J. Bot., 2007, 39(1):223-230）以棉花成熟胚为外植体将农杆菌侵染和超声物理方法结合起来有效的促进了gus基因在植物体内大量表达。上述方法主要是在植物组织培养和细胞上有应用，但是超声辅助法尚未应用于in planta为基础的植物遗传转化。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种农杆菌介导的植物in planta遗传转化的转基因方法，该方法易行，操作简便，成本低，周期短，可2人1天内同时对1500-2000株植株进行转化，加强了菌液的渗透率，显著提高了遗传转化效率并拓展了该方法在不同植物中的适用范围。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明技术要点一：常规的in planta转化法在模式植物拟南芥上应用较多，转化的对象主要是胚珠，而在其他植物应用上少见且转化频率较低，这是因为农杆菌侵染受限于大多数植物的花器官大小，不能进入细胞内部，转化难以发生。通过超声辅助法使农杆菌侵染时能够克服更多的花器官物理屏障，能进入到不同植物的花器官细胞内，使大多数花器官大植物能有效使用此方法，从而使转化更容易发生。技术要点二：通过超声使转化不仅仅发生在胚珠，柱头等雌配子细胞内，外源基因还可通过农杆菌侵染进入到花粉，花药，花丝等雄配子细胞当中。这是由于农杆菌是通过伤口侵入的，利用超声波的“空化作用” 处理植物的受体系统，使植物受体细胞或组织上造成伤口，这样农杆菌中T-DNA携带外源基因能够更容易进入，并高效、稳定地再生无性系，接受外源DNA整合后，转化选择对抗生素敏感的再生系统，提高转化效率。技术要点三：本发明能直接获得转化的T1代种子，避免了烦琐的组织培养和继代培养，而对于那些难以建立甚至尚未建立再生体系的植物，意义更加重大。技术要点四：不受植物株型大小以及基因型的限制，如芝麻、大豆、油菜（甘蓝型，白菜型，芥菜型），拟南芥等不同作物均可采用本专利所述的方法实施高效转化。技术要点五：本发明专利操作简单，成本低，周期短，可同时对大批量植株进行转化。技术要点六：本发明专利不依赖于抗生素筛选，可用不同的筛选标记进行转基因植物筛选鉴定。

一种超声辅助农杆菌介导植物遗传转化的转基因方法，其步骤是：

1、农杆菌培养及转化前处理 ：将农杆菌菌株EHA105-gus-2301接种于LB培养基，28℃，摇床培养1～2d后，再转接新鲜的LB培养液中，摇菌24 h左右（使OD₆₀₀在1.8～2.0）。6000rpm 离心收集菌体10～15min，室温为20-25℃。2倍体积转化培养基溶解。

2、超声辅助农杆菌介导的in planta遗传转化：

选择待处理的甘蓝型油菜浙油18等植株，去除所有已开放的花朵。将所有植株的主花序用转化培养基溶解的农杆菌菌液进行2～30 sec不同时间倒置超声侵染处理，同时挂牌标明处理时间。侵染完后倒置油菜，将其处理部位用保鲜膜套住，阴处平放22-26h后，除去保鲜膜，蒸馏水冲洗植株后，于土壤钵中置正常生长条件下培养，待成熟期收获T1代种子。

所述的待处理植株为甘蓝型油菜浙油18（Brassica napus L.），拟南芥{Arabidopsis thaliana(ecotype Columbia)},白菜型油菜0639,3965（Brassica rapa L.）;芥菜型油菜2522,2565（Brassica juncea L.），野芥野油41（Sinapis arvensis L.），苏芝-1（Sesamum indicum L.）； 

所述的待处理植株为刚开放1-2朵花花蕾期的植株；

所述的超声辅助农杆菌介导的植物in planta高效遗传转化的对象为未开花的花蕾；

所述的农杆菌为根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105，所含质粒pCAMBIA 2301携带含内含子的gus报告基因，抗性标记为卡那霉素（Km）和利福平（Rif）抗性，gus基因通过CaMV35S启动子启动表达。

所述的超声仪器为双频数控超声清洗仪（KQ-500VDE型）

所述的超声辅助处理时装有农杆菌转化液的仪器为大容积的塑料大烧杯；

所述的超声波处理的参数为：电源220V 50Hz超声频率为28/45 KHz，超声电功率为500W；

所述的超声处理时间为2 sec，5 sec，15 sec，30sec 4个处理，分别以未经超声直接侵染处理的植株为各自对照：2 sec ck，5 sec ck，15 sec ck，30 sec ck；

3、卡那霉素抗性筛选：将收集到的部分T1代种子进行卡那霉素抗性植株筛选，所述的卡那霉素抗性筛选最适浓度为350 mg/L，此时油菜等幼苗下胚轴呈现淡紫色，叶片严重黄化。而在此浓度以上油菜等幼苗全部死亡。详细筛选步骤见实施例1.6.1

4、PCR检测抗性植株中的gus基因：将筛选到的抗性植株进行PCR快速检测，所述的PCR检测抗性植株中的gus基因所用到的引物是：

GusF2（5’to 3’）：CGGCAAAGTGTGGGTCAAT

GusR2（5’to 3’）：AAGGGTAATGCGAGGTACGGT。

本发明得到Gus基因扩增片段长度为500bp，并且超声15sec处理时，gus基因转化频率达到20%  

本发明与现有技术相比，具有以优点和效果：

1.本发明已经成功应用于不易建立遗传再生体系作物芝麻，提供了基因转移的新途径，得到了转基因芝麻种子。 

2.本发明利用超声技术对植株进行in planta转化大大提高了外源基因转化效率。

3.本发明借助超声打破植物屏障，外源基因可成功进入各种细胞中，如胚珠，花瓣，花梗，胚囊等，对不同植物的不同组织提高了转化效率。 

4.本发明已经成功获得了油菜、拟南芥、芝麻等转基因种子，并且每粒种子都是一个独立转化事件。

5.本发明操作简单，成本低，周期短，可2人1天内同时对1500-2000株植株进行转化，且不受基因型限制。

6.本发明已经成功的用抗除草剂bar基因，gus基因（基因），卡那霉素基因进行转基因植株的筛选，每粒转基因种子都是独立转化事件。其中，本发明得到的gus基因转化频率可达20%，卡那霉素筛选转化频率达到78.38%。

附图说明

图1为一种卡那霉素抗性植株示意图

图2为一种油菜（子叶，下胚轴）gus基因化学组织染色示意图

图3，4为一种白菜型油菜0639、3965gus基因化学组织染色示意图

图5为一种野芥gus基因化学组织染色示意图

图6为一种拟南芥gus基因化学组织染色示意图

图7为一种芝麻gus基因化学组织染色示意图。

具体实施方式

下文将通过实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

一种超声辅助农杆菌介导植物遗传转化的转基因方法，其步骤是：

1材料与方法

1.1供试植物材料：

选择初花期的甘蓝型油菜浙油（Brassica napus L.）18

1.2农杆菌质粒及外源基因

菌株为根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105(项友斌等.农杆菌介导的苏云金杆菌抗虫基因cry1A（b）和cry1A（c）在水稻中的遗传转化及蛋白表达.生物工程学报,1999,15(4):494-500），所含质粒pCAMBIA 2301（Manju Yadav, Darshna Chaudhary, Manish Sainger, Pawan K. Jaiwal, 2010, Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.), Plant Cell Tissue and Organ Culture, DOI 10.1007/s 11240-010-9791-8）(该质粒携带含内含子的gus报告基因，抗性标记为卡那霉素（Km）和利福平（Rif）抗性，gus基因通过CaMV35S启动子启动表达) 

 1.3农杆菌培养及转化前处理

将农杆菌菌株EHA105-gus-2301接种于LB培养基（蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 10 g/L，NaCl 5 g/L，NaOH调节至pH=7），含Km（50 mg/L）和Rif（30 mg/L），28℃，200 rpm，摇床培养1～2d后，再转接新鲜的LB培养液中，摇菌24 h左右（使OD₆₀₀在1.8～2.0）。6000rpm 离心收集菌体10～15min，室温为20-25℃。2倍体积转化培养基溶解。所述的农杆菌菌种为EHA105-gus-2301（Agrobacteriumtumefaciens）；转化培养基为：MS基本培养基+6-BAP（0.01ng/L）+蔗糖5%（m/v） + Silwet-77 0.05%（v/v），（pH=5.8左右）

1.4超声处理：

选取初花期的甘蓝型油菜浙油18进行2sec，5sec，15sec，30sec不同的超声处理（以未经超声直接侵染处理的植株为对照CK），进行农杆菌侵染实验，每处理随机选择20株，各4个重复，同时挂牌标明处理时间。侵染完后倒置油菜，将其处理部位用保鲜膜套住22-26 h，将植株用蒸馏水冲洗，阴处平放。除去保鲜膜，蒸馏水冲洗植株后，放置于土壤钵中正常生长条件下培养直至角果成熟。

1.5种子收获：收集处理部位成熟角果，脱粒，得到甘蓝型油菜T1代种子。

1.6转基因植株的筛选：

1.6.1卡那霉素抗性筛选：

取部分收获的T1代种子经75%（v/v）酒精表面消毒30 s，0.1%（v/v）HgCl₂消毒10 min，铺在MS基本培养基上，将正常生长的绿苗转到抗性筛选培养基中（含卡那霉素浓度为350 mg/L) ，两周后，统计并记录绿色苗子生长及变化情况.再将正常生长的绿色苗转移到土钵中培养，为开展后续实验备用.

统计结果表明：在卡那霉素浓度为350 mg/L时，少数植株死亡，部分叶片严重黄化，真叶呈现深紫色（见图1）。农杆菌侵染结合超声处理所得到的绿色抗性植株比例均高于未经超声而直接侵染所得到的绿色抗性植株比例，并且4个处理中，超声15 sec得到的抗性转化频率可高达78.38%（见表1），初步表明超声处理结合农杆菌转化可大大提高转基因植株获得的机率，有效的促进外源基因在植株中高效的表达，从而获得大量的绿色正常生长的转基因植株。

1.6.2 gus基因的组织化学法筛选：

分别选取上述初步经过卡那霉素筛选到的绿色抗性植株子叶、下胚轴、根部不同部位进行组织化学染色法检测，弃去染色液，分别统计被染成蓝色或未被染成蓝色部位（见图2），镜检观察并进行数据统计（见表2）。

结果表明：农杆菌侵染并结合超声处理植株被染成蓝色的比例均高于未经超声而直接侵染植株，处理15 sec时，gus基因染色比例最高可达77.06%，与以上抗性植株筛选得到的结果基本一致，进一步说明此发明涉及的超声处理结合农杆菌转化方法可大大提高转基因植株获得的机率，有效促进外源基因在植株中高效的表达。实施中发现油菜根部最容易被染上蓝色，下胚轴次之，子叶染上蓝色比例最小，并且各部位染色深浅程度各不一致，说明转基因油菜中外源基因在植株中表达强度表现不一致，T-DNA可以多位点插入，因此其后代的遗传规律可能会比较复杂。

1.6.3 gus基因的PCR鉴定筛选：

将上述步骤得到的转基因油菜充分研磨，用CTAB法提取植物总DNA，用gus基因引物（GusF2和GusR2）进行PCR扩增。

通过PCR扩增虽然在一定程度上大大的降低了假阳性转基因植株的比例，但结果表明：超声15sec时，gus基因转化频率最高，并且可达到20%，超声处理30sec时可达到12.12%，仍然远远高于其他文献上提到的农杆菌侵染比例（见表3）。该结果进一步说明此发明涉及到的超声处理结合农杆菌转化确实可大大提高转基因植株获得的机率，有效的促进外源基因在植株中高效的表达。

表1 甘蓝型油菜浙油18卡那霉素抗性筛选数据统计表

表2甘蓝型油菜浙油18gus基因的组织化学法筛选数据统计表

表3甘蓝型油菜浙油18 gus基因的PCR鉴定筛选数据统计表

注：以上三个表植株处理数不一致，每粒转基因种子都是独立转化事件。

实施例2 ：

超声辅助农杆菌介导的in planta转化不同植物的瞬时表达。

选择初花期的拟南芥（Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia) ），白菜型油菜0639，3965（Brassica rapa L.）;芥菜型油菜2522，2565（Brassica juncea L.），野芥野油41（Sinapis arvensis L.），苏芝-1（Sesamum indicum L.）数株，按照实施例1法对其进行不同时间段超声转化，待各植株在土钵上生长数日后，分别选取处理后长势旺盛的各植株不同部位（角果，花苞，开放的花）进行Gus化学组织染色（Jefferson et al.，1987基础上改进），倒置显微镜（Olympus IX-70，Japan）下观察其外源基因在不同作物以及各器官上瞬间表达情况， 

     分别对拟南芥，油菜，芝麻等植株进行gus基因组织化学染色，结果表明:gus基因表达可发生在不同植物的不同部位上，根据染色部位和染色比例，雌配子发生转化甚至可高达66.7%.显微镜下可观察到拟南芥和白菜型油菜0639，野芥的胚珠，花瓣，萼片，花托，子房，雌蕊柱头，花柱等部位都呈现不同程度的蓝色斑点；表明外源gus基因此时已经转入到各种植物的花器官不同部位进行表达。（图3，4，5，6）同时，利用本发明获得的转基因芝麻在显微镜下也有蓝色斑点出现（图7）。在油菜转化中， T-DNA可以多位点插入，因此其后代的遗传规律可能会比较复杂。再者，外源基因插入植物基因组是一种随机过程，位置效应即插入位点不同，有可能影响转基因植株的其他性状。此外，gus基因在各个转基因植株中的表达强度不一，表现出基因型和器官的特异性（图3，4，5，6），此结论与贾士荣 等（1992)在文献中提到的观点一致。通过本发明涉及到的高效转化，可获得众多的转基因植株种子，提供更多的选择机会，从而达到既不改变原品种的优良性状，又能转进某一目的基因的品种改良目标。

序列表（SEQUENCE LISTING）

 

<110>  中国农业科学院油料作物研究所

<120>  一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法

<130>  一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

cggcaaagtg tgggtcaat                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

aagggtaatg cgaggtacgg t                                               21

 

Claims (2)

1.一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法，其步骤是：

A、农杆菌培养及转化前处理：

将农杆菌菌株接种于LB培养基，28℃，摇床培养1～2d后，再转接新鲜的LB培养液中，摇菌22-26h，使OD₆₀₀在1.8～2.0，6000rpm离心收集菌体10～15min，室温为20-25℃，2倍体积转化培养基溶解；

B、超声辅助农杆菌介导的in planta遗传转化：

选择待转化的油菜或芝麻植株，去除所有已开放的花朵，将待转化的油菜或芝麻的主花序用转化培养基溶解的农杆菌菌液进行2～30sec不同时间倒置超声侵染处理，同时挂牌标明处理时间，侵染完后倒置油菜或芝麻，将其处理部位用保鲜膜套住，阴处平放22-26h后，除去保鲜膜，蒸馏水冲洗油菜或芝麻后，于土壤钵中置正常生长条件下培养，待成熟期收获T1代种子；

所述的待转化的油菜或芝麻为刚开放1-2朵花花蕾期的植株；

所述的超声辅助农杆菌介导的油菜和芝麻in planta遗传转化的对象为未开花的花蕾；

所述的超声波处理的参数为：电源220V 50Hz超声频率为28/45KHz，超声电功率为500W；

所述的超声处理时间为2 sec，5 sec，15 sec，30sec 4个处理，分别以未经超声直接侵染处理的植株为各自对照：2 sec ck，5 sec ck，15 sec ck，30 sec ck；

所述的农杆菌菌株为含有pCAMBIA2301质粒的EHA105农杆菌；

所述的转化培养基配方为：MS基本培养基+0.01ng/L 6-BAP+5％蔗糖m/v+0.05％ Silwet L-77v/v，pH＝5.8；

C、卡那霉素抗性筛选：将收集到的部分T1代种子进行卡那霉素抗性植株筛选，所述的卡那霉素抗性筛选浓度为350mg/L；

D、PCR检测抗性植株中的gus基因：将筛选到的抗性植株进行PCR快速检测，所述的PCR检测抗性植株中的gus基因所用到的引物是：

GusF2：CGGCAAAGTGTGGGTCAAT    5’to 3’

GusR2：AAGGGTAATGCGAGGTACGGT  5’to 3’

Gus基因扩增片段长度为500bp。

2.根据权利要求1所述的一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法，其特征在于：所述的待处理植株为甘蓝型油菜浙油18，拟南芥，白菜型油菜0639，3965，芥菜型油菜2522，2565，野芥野油41。

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