CN109652455B - 一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

为解决不结球白菜再生率低，受基因型影响大，使得转化效率低的技术问题，本发明提供一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，包括将含有外源基因的质粒与具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe₃O₄的磁性纳米载体以质量比1：1连接，得到基因—磁性纳米载体复合物；在花粉培养基中混合基因—磁性纳米载体与待转化植物花粉，在0.1～0.5T的磁场介导下进行磁转化，直接递送基因—磁性纳米载体复合物进入花粉细胞；然后通过植物授粉和受精过程实现待转化植物的外源基因遗传转化。本发明花粉培养基配方、磁性纳米粒子和质粒DNA的质量比、磁转化时间三者的组合，能够保证不结球白菜的花粉活力并有效提高磁转化效率，建立简单高效的遗传转化体系。

Description

一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其应用。

背景技术

白菜(结球白菜和不结球白菜)原产于中国北方，是十字花科芸薹属用蔬菜，通常指大白菜；也包括小白菜以及由甘蓝的栽培变种结球甘蓝，即"圆白菜"或"洋白菜"。引种南方，南北各地均有栽培。十九世纪传入日本、欧美各国。白菜中含有B族维生素、维生素C、钙、铁、磷，白菜中微量元素锌的含量是非常高的，以柔嫩的叶球、莲座叶或花茎供食用，栽培面积和消费量在中国居各类蔬菜之首。利用转基因技术对白菜进行改造与改良，提升白菜品质，是现代社会对于蔬菜品质的必然要求。

植物基因工程是应用重组DNA技术，将外源基因导入到受体植物细胞内，使受体植物获得新的遗传性状。20世纪80年代，在细胞和组织培养、分子生物学研究领域取得一系列重大进展的基础上，植物基因工程到得到了迅猛的发展。

1.农杆菌转化法

对于白菜来说，农杆菌转化法是最成熟、最理想的转基因方法。通过定向改造农杆菌的T—DNA区域，将外源基因嵌入到这一区域，利用农杆菌侵染植物后，将T—DNA区域整合进植物DNA序列的能力，实现外源基因的转化。利用农杆菌转化白菜类蔬菜的例子已有很多，利用得最多的是章鱼碱型根癌农杆菌LBA4404，但是农杆菌侵染外植体后，会大大降低外植体的分化能力，从而影响转化频率。

2.其他转化方法

针对白菜类蔬菜难分化这一特点，人们开始将研究转向那些不借助组织培养的转化方法。近年来，许多非组织培养途径的遗传转化方法在白菜类蔬菜上进行了尝试并取得了成功，使用原位真空抽滤法、子房注射法、种子共培养法、花粉管通道法、蘸花法、喷花法、种子抽滤法、滴涂法将目的基因转入大白菜和普通白菜。

子房注射法，在对植株进行自交授粉后，次日使用消毒注射器注射DNA，通过对整个植株的早期胚细胞进行转化，不使用细胞培养或者原生质体培养，可以在大棚或者田间使用。

花粉管通道法，首先进行植株自交授粉，在花粉管萌发之前，使用消毒注射器对植株子房进行注射，使外源DNA沿着花粉管形成的通道，进入珠心、胚囊，在形成细胞壁之前，转化合子。

蘸花法，将植株去除初生花序，保留次生花序，使用菌液对每朵花进行逐一侵染，然后使用保鲜膜进行保湿，之后连续侵染几次，直到植株成熟。

目前，这些非组织培养途径的遗传转化方法的转化条件尚不成熟，还没有得到大规模的应用。

磁转化是一种磁性纳米载体介导的植物转基因方法，具体包括，将具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的磁性纳米载体与外源基因相结合，构建出基因——磁性纳米载体复合物，将基因——磁性纳米载体复合物与植物花粉或花药共培养，并以0.1～0.5T的磁场介导，进而将基因——磁性纳米载体复合物转入植物花粉或花药细胞，通过植物授粉和受精过程实现外源目的基因的遗传转化。

不结球白菜的遗传转化虽取得了一些进展，但还存在着很多问题。白菜类蔬菜由于携带不易再生的AA基因组型，因此是芸薹属作物中最难转化的种。

所以由于白菜类蔬菜再生率低，受基因型影响大，使得白菜类蔬菜的转化效率很低。因此建立不结球白菜高频再生体系一直是研究者探索的重要课题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种不结球白菜的一种高效遗传转化方法，将磁转化这种遗传转化体系成功应用在不结球白菜上，使用磁转化法直接递送DNA，使不结球白菜的转化效率大大提高，在转化过程中无需愈伤组织的培养和再生，操作简单高效的，可重复，为不结球白菜基因功能的研究及利用转基因技术培育优良性状的种质资源打下坚实的基础。

本发明利用一种磁性纳米载体作为介导，通过静电作用，将磁性纳米颗粒与载有外源目的基因的质粒结合，形成基因一磁性纳米颗粒复合物，置于磁板产生的强磁场之上。在磁场的介导下，将基因一磁性纳米颗粒复合物通过花粉孔传递到悬浮在花粉液体培养基的花粉中，经过人工授粉，得到转基因种子，稳定转化T₀植物并将目的基因整合到植物基因组中，通过植物授粉和受精过程实现外源目的基因的遗传转化。

本发明技术方案如下：

本发明的第一个目的在于提供一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，所述方法包括将含有外源基因的质粒与具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe₃O₄的磁性纳米载体连接，得到基因—磁性纳米载体复合物；在花粉液体培养基中混合基因—磁性纳米载体复合物与待转化植物花粉，在0.1～0.5T的磁场介导下进行磁转化，直接递送基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；然后通过植物授粉和受精过程实现待转化植物的外源基因遗传转化。

进一步的，待转化植物为不结球白菜。本发明的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法具体操作步骤包括：

1)提取含有外源目的基因的质粒，将浓度浓缩为100～1000ng/ul；

2)待转化植物人工授粉前一天去雄，细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染；

3)将步骤1)提取的质粒与磁性纳米载体按质量比1：l混合，室温连接30min，得到基因—磁性纳米载体复合物；

4)转化当天收集花粉，将培养皿放置于同种待转化植物开放但未散粉的花朵下，轻拍花朵使其花粉散落在培养皿孔中，每个孔取0.1～0.2克花粉，立即加入300～500ul的花粉液体培养基，使花粉悬浮在花粉液体培养基中；优选的收集花粉时间为，在天气晴朗条件下，早晨九点时收集，花粉活力好，散粉多。

5)将步骤3)中连接好的基因—磁性纳米载体复合物加入带有花粉的培养基中，使基因—磁性纳米载体复合物(单位：ul)与花粉(单位：g)数量比值为10:1，置于0.1～0.5T的磁场下30min，使基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；

6)使用移液枪吸走培养皿上层的液体，将下层花粉放置到滤纸上吸干水分，然后将花粉晾干。注意花粉不能长时间处于液体中，也不能放置于阳光下暴晒，应在30～35℃，10～15min内晾干。

7)田间授粉，将步骤2)中去雄并进行生殖隔离的细管去掉，将步骤6)中得到的花粉用毛笔蘸取涂抹与柱头上，再用细管重新套住柱头，并做好标记；

8)将步骤7)授粉后的植株培养至自然成熟后收获种子，播种后待长出第二片真叶后，取第二片真叶的叶片组织在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，能够观察到相应荧光的即为候选阳性植株；在候选阳性植株长出第四片真叶和第八片真叶时，分别在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，对叶片组织进行两次筛选，均能够观察到相应荧光的即为转化了基因—磁性纳米载体复合物的T₀代阳性植株；

9)本发明的外源目的基因为红色荧光蛋白RFP、绿色荧光蛋白GFP、黄色荧光蛋白YFP。以外源目的基因绿色荧光蛋白为例，取第二片真叶的叶片组织在荧光显微镜下，采用波长为490nm的紫外线激发后，能够观察到绿色荧光的即为候选阳性植株；在候选阳性植株长出第四片真叶和第八片真叶时，分别在荧光显微镜下，采用波长为490nm的紫外线激发后，均能够观察到绿色荧光的即为转化了基因—磁性纳米载体复合物的T₀代阳性植株。摘取T₀代阳性植株叶片，提取基因组DNA，利用目的基因引物进行PCR检测，经测序筛选出包括目的基因的T₀代阳性植株。

进一步的，所述磁性纳米载体粒径为100nm。

进一步的，所述质粒与磁性纳米载体按质量比1:1混合，即2ul体系中含有1ul(lug/u1)磁性纳米载体和1ul(1ug/ul)质粒DNA，通过静电吸引作用进行连接。

进一步的，在0.1～0.5T的磁场介导下进行所述磁转化时间为30min。

进一步的，所述花粉液体培养基配方如下：每100mL花粉液体培养基包括15g蔗糖、10mgH₃BO₃、5.3mgKNO₃，10.3mgCa(NO₃)₂，51.7mgMnSO₄，10.3mg MgSO₄·7H₂O和3mgGA₃，用蒸馏水定容。

进一步的，所述待转化植物花粉选自尚未散粉的花苞，授粉的待转化植物在人工授粉前一天去雄，并保证柱头生殖隔离且完整健康。

进一步的，待转化植物为十字花科蔬菜作物。

本发明的第二个目的是提供前述磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法在十字花科蔬菜作物中的应用。

进一步的，所述磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法在不结球白菜中的应用。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：

本发明利用磁转化的方法，提供了一个简单高效的，可重复的，在转化过程中无需愈伤组织的培养和再生，而是使用磁转化法直接递送载体的转化方法。该方法操作简单，省去了组培过程所带来的污染与繁琐步骤，以及植株再生的困难和耗时长等缺点，为白菜基因功能的研究及利用转基因技术培育优良性状的种质资源打下坚实的基础。

本发明相对于现有技术的有益效果：将磁转化这种遗传转化体系在不结球白菜上成功建立，同时针对不结球白菜的磁转化，优化了转化体系，特别是提供了质粒与磁性纳米载体的连接质量比、花粉液体培养基配比和磁转化时间三者的最优结合，能够保证不结球白菜的花粉活力并有效提高磁转化效率，具有耗时较短，转化效率高，操作简单易行等优点，这为不结球白菜基因功能的研究提供了重要的转化工具，也为利用转基因技术来培育新品种奠定了良好的基础。

附图说明

图1：为实施例1载体Pcambia1302的结构示意图。

图2：为实施例1磁转化过程示意图。

图3：为实施例1转基因植株与未转基因植株对比图，图3a为T₀代未转基因植株，图3b为T₀代转基因植株。

图4：为实施例1转基因植物与未转基因植物荧光对比图，图4a为T₀代未转化植株第八片真叶叶片组织阴性对照荧光显微结果，图4b为T₀代转化植株第八片真叶叶片组织荧光显微荧光表达。

图5：为实施例1转基因植株的外源目的基因PCR鉴定。

其中，M:DL 2000bp DNAmarker；+:质粒阳性对照；NT:非转基因植株；1-3:转基因植株：1、3为不包括mgfp5基因的转基因阳性植株，2为包括mgfp5基因的转基因阳性植株。

具体实施方式

下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用未标明的试剂均为可以购买得到的常规试剂产品。

下面对本发明技术方案进行详细说明,但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例1

(1)含有外源基因的重组载体的制备

选择含有外源目的基因的重组载体Pcambia1302质粒(购买自

http://www.miaolingbio.com/plasmid/P0654.html)，外源目的基因是Pcambia1302质粒上的mgfp5基因(属于绿色荧光蛋白GFP基因)，用大提试剂盒提取质粒，浓度浓缩1000ng/ul。其中重组载体Pcambia1302的结构示意如图1所示。

(2)不结球白菜花粉去雄

待转化授粉材料为不结球白菜，选取30朵花进行人工去雄操作，去雄时间为人工授粉前一天，然后使用细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染。

(3)mgfp5基因—ployMAG磁性纳米载体复合物的制备

将(1)中大提的质粒Pcambia1302与磁性纳米载体ployMAG按质量比1:1混合，即体系中含有1u1(lug/u1)磁性纳米颗粒和1ul(1ug/ul)质粒DNA，室温下，通过静电吸引作用连接30min，得到mgfp5基因—ployMAG磁性纳米载体复合物。

(4)实验花粉的制备

磁转化当天清晨收集花粉，将培养皿放置于不结球白菜开放但未散粉的花朵下，轻拍花朵使其花粉散落在培养皿孔中，每个孔取0.2g花粉，立即加入300ul的花粉液体培养基，使花粉悬浮在培养基中。花粉液体培养基的配置为：每100mL花粉液体培养基包括15g蔗糖、10mgH₃BO₃、5.3mgKNO₃，10.3mgCa(NO₃)₂，51.7mgMnSO₄，10.3mg MgSO₄·7H₂O和3mgGA₃，用蒸馏水定容。

(5)花粉磁转化

将步骤(3)中连接好的mgfp5基因—ployMAG磁性纳米载体复合物加入带有花粉的培养基中，基因—磁性纳米载体复合物(单位：ul)与花粉(单位：g)数量比值为10:1，置于磁板下，0.5T的磁场下室温放置，磁转化30min，使mgfp5基因—ployMAG磁性纳米载体复合物通过花粉孔进入花粉细胞(图2)。

(6)磁转化花粉处理

磁转化后用移液枪吸走培养皿上层的液体，将下层花粉用滤纸吸干花粉上的水分，置于30℃的环境中10分钟，彻底晾干花粉。注意花粉不能长时间处于液体中，也不能放置于阳光下暴晒，应在30～35℃，10～15min内晾干。

(7)田间授粉

将(2)中去雄并进行生殖隔离的30朵花柱头上的细管去掉，将步骤(6)晾干的花粉用毛笔蘸取涂抹与柱头上，再用细管重新套住柱头并做好标记。

(8)收集转基因种子及转基因植株的荧光检测

待步骤(7)授粉后的不结球白菜自然成熟后收获种子，播种后待长出第二片真叶，取第二片真叶的叶片组织在荧光显微镜下，用波长约490nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光获得的候选阳性植株，在长出第四片真叶和第八片真叶时，分别取叶片组织在荧光显微镜下，用波长约490nm的紫外线激发后，进行两次筛选，均能够观察到绿色荧光的即为转化了mgfp5基因—ployMAG磁性纳米载体复合物的即为T₀代阳性植株。

T₀代植株如图3所示，转基因植株与未转基因植株在外观上无显著区别。T₀代第八片真叶叶片组织荧光显微结果如图4所示，转基因植株的荧光结果显示为绿色的亮点荧光，未转基因植株与之对比区别显著，未见绿色荧光。

(9)转基因植株PCR鉴定

摘取T₀代阳性植株叶片，提取基因组DNA，利用mgfp5基因引物进行PCR检测，引物序列优选为：上游引物：5’-CTCAGGACTTGTCTATTTGCAT-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物：5’-ATGCAAATAGACAAGTCCTGAG-3’(SEQ ID NO.2)，PCR扩增程序(20ul反应总体系：其中植物基因组DNA 1ul；PCRMix(2X)10ul；引物L1ul；引物R1ul；补加水至20ul)：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸70s，38个循环；72℃延伸2min，4℃保存。产物经w＝1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，于UVP凝胶成像系统观察照相。目的片段长度为1049bp。

检测获得4株已整合mgfp5基因的阳性植株，分别命名T₀-1，T₀-2，T₀-3，T₀-4。图5。

实施例2

建立高效遗传转化体系的同时，为探究不结球白菜上转化效率最高的方案，进行此实验。

实验中，使用的花粉液体培养基配方为每100mL花粉液体培养基包括：蔗糖，H₃BO₃，5.3mgKNO₃，10.3mgCa(NO₃)₂，51.7mgMnSO₄，10.3mgMgSO₄·7H₂O和3mgGA₃。

为确定不结球白菜的最佳转化效率方案，除实施例1的设置外，另设置对比方案(表1中对比方案2～9)。

花粉液体培养基中，根据文献报道，在花粉离体培养中，蔗糖和H₃BO₃对花粉活力的影响最大，所以在本实验的花粉磁转化培养基优化实验中，首先对于蔗糖和H₃BO₃两种成分进行设置变量，蔗糖设置10g、15g、20g每100mL三个梯度，H₃BO₃设置5mg、10mg、15mg每100mL三个梯度，其他培养基组成成分维持不变。

其次在对比不同磁性纳米粒子和质粒DNA的质量比和不同磁转化时间对于花粉活力和转化效率的影响时，设置磁性纳米粒子和质粒DNA的质量比为1:10、1:4、1:1三个梯度，磁转化时间为30min、40min、50min三个梯度。

将花粉液体培养基配方、磁性纳米粒子和质粒DNA的质量比、磁转化时间3者组合进行变量试验，其他成分和操作保持不变，确定本发明方法为在不结球白菜上应用的最佳实验方案。

同时设置未作处理的花粉作为空白对照组。

上述所有花粉液体培养基配方除去实验变量蔗糖和H₃BO₃外，均为方案1(即实施例1)的配方。

实验方案如下：

方案1(即实施例1)：15g蔗糖+10mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mgMnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:1+磁转化30min；

对比方案2：15g蔗糖+5mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mg MnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:1+磁转化30min；

对比方案3：15g蔗糖+15mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mg MnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:1+磁转化30min；

对比方案4：10g蔗糖+10mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mg MnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:1+磁转化30min；

对比方案5：20g蔗糖+10mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mg MnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:1+磁转化30min；

对比方案6：15g蔗糖+10mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mg MnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:10+磁转化30min；

对比方案7：15g蔗糖+10mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mg MnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:4+磁转化30min；

对比方案8：15g蔗糖+10mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mg MnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:1+磁转化50min；

对比方案9：15g蔗糖+10mg H₃BO₃+5.3mg KNO₃+10.3mg Ca(NO₃)₂+51.7mg MnSO₄+10.3mg MgSO₄·7H₂O+3mg GA₃+1:1+磁转化40min。

上述实施例二中的所有实验操作与田间操作，均按照实施例1中的相关方法与步骤进行。

表1不同处理方案的花粉活力和转化效率对比

通过对比实验我们得出了以下结论。

1.方案1(即实施例1)为不结球白菜转化实验的最佳方案。方案1中花粉液体培养基配方、磁性纳米粒子和质粒DNA的质量比、磁转化时间三者的组合所得出的花粉活力和转化效率在所有的实验方案中最高，分别为78.23％和13.33％；

2.由方案1、对比方案6、7的结荚数、结荚率数据，我们可以得出磁性纳米粒子和质粒DNA的质量比对于花粉活力的影响差异较小，但是对于磁转化效率存在较大影响，当质量比为1:1时，转化效率最高，原因为当质粒DNA浓度过高时，由于静电吸引作用，质粒会不断聚集在磁性纳米粒子周围，使复合物的直径不断变大以至于无法通过花粉表面的孔径，也就无法完成遗传转化的过程，所以会出现方案1、对比方案6、7的结荚率差异很小，但是遗传转化效率差异巨大的现象。

3.由方案1、对比方案2、3、4、5，我们可以得出蔗糖和H₃BO₃的浓度对花粉活力存在一定影响，实验结果表明当每100ml培养基中含有15mg蔗糖和10mgH₃BO₃时，花粉活力最强，进一步使得转化效率最高。

4.由方案1、对比方案8、9，可以得出磁转化实验的转化时间对花粉活力和转化效率存在较大影响，原因在于过长时间的浸泡会显著降低花粉自身的活力，是受精过程受到了一定的影响，导致处理时间越长，结荚率越低，转化效率也就随之降低。

综上可以看出，以本发明花粉液体培养基配方、磁性纳米粒子和质粒DNA的质量比、磁转化时间三者的组合对不结球白菜进行磁转化，能够保证不结球白菜的花粉活力并大大提高磁转化效率。同时也可看出，此三者的优化并非任意组合都能产生显著的效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 南京农业大学

南京市蔬菜科学研究所

<120> 一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcaggactt gtctatttgc at 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcaaatag acaagtcctg ag 22

Claims (5)

1.一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括将含有外源基因的质粒与具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe₃O₄的磁性纳米载体连接，得到基因—磁性纳米载体复合物；在花粉液体培养基中混合基因—磁性纳米载体复合物与待转化植物花粉，在0.1～0.5T的磁场介导下进行磁转化，直接递送基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；然后通过植物授粉和受精过程实现待转化植物的外源基因遗传转化；

质粒与磁性纳米载体质量比为1：l；

所述花粉液体培养基配方如下：每100mL花粉液体培养基组成为15g蔗糖、10mgH₃BO₃、5.3mgKNO₃，10.3mgCa(NO₃)₂，51.7mgMnSO₄，10.3mg MgSO₄·7H₂O和3mgGA₃，用蒸馏水定容；

磁转化时间为30min；

待转化植物为不结球白菜。

2.根据权利要求1所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，具体操作步骤包括：

1)提取含有外源目的基因的质粒，将浓度浓缩为100～1000ng/ul；

2)待转化植物人工授粉前一天去雄，细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染；

3)将步骤1)提取的质粒与磁性纳米载体按质量比1：l混合，室温连接30min，得到基因—磁性纳米载体复合物；

4)转化当天收集花粉，将培养皿放置于开放但未散粉的花朵下，轻拍花朵使其花粉散落在培养皿孔中，每个孔取0.1～0.2克花粉，立即加入300～500ul的花粉液体培养基，使花粉悬浮在花粉液体培养基中；

5)将步骤3)中连接好的基因—磁性纳米载体复合物加入带有花粉的培养基中，使基因—磁性纳米载体复合物与花粉数量比值为10ul:1g，置于0.1～0.5T的磁场下转化30min，使基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；

6)使用移液枪吸走培养皿上层的液体，将下层花粉放置到滤纸上吸干水分，然后将花粉在30～35℃，10～15min内晾干；

7)田间授粉，将步骤2)中去雄并进行生殖隔离的细管去掉，将步骤6)中得到的花粉用毛笔蘸取涂抹与柱头上，再用细管重新套住柱头，并做好标记；

8)将步骤7)授粉后的植株培养至自然成熟后收获种子，播种后待长出第二片真叶后，取第二片真叶的叶片组织在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，能够观察到相应荧光的即为候选阳性植株；在候选阳性植株长出第四片真叶和第八片真叶时，分别在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，对叶片组织进行两次筛选，均能够观察到相应荧光的即为转化了基因—磁性纳米载体复合物的T₀代阳性植株；

9)摘取T₀代阳性植株叶片，提取基因组DNA，利用目的基因引物进行PCR检测，经测序筛选出包括目的基因的T₀代阳性植株。

3.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述磁性纳米载体粒径为100nm。

4.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述待转化植物花粉选自尚未散粉的花苞；授粉的待转化植物在人工授粉前一天去雄，并保证柱头生殖隔离且完整健康。

5.根据权利要求4所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，收集花粉时间为天气晴朗条件下，早晨九点时收集。

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