CN102925488B - 磁性纳米载体介导的植物转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种磁性纳米载体介导的植物转基因方法，具体包括：将具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的磁性纳米载体与外源基因相结合，构建出基因－纳米磁颗粒载体复合物；将基因－纳米磁颗粒载体复合物与植物花粉或花药共培养，利用磁性纳米载体的高穿透性，在0.1~0.5T的磁场的驱动下，将基因－纳米磁颗粒载体复合物转入植物花粉或花药细胞，通过授粉受精过程实现外源目的基因的遗传转化。本发明方法操作简单、易于掌握、便于推广、不受外源基因种类和大小限制、打破了受体材料遗传背景的限制、直接获得转基因种子、获得转基因材料的时间短、转化效率高，可广泛应用于植物遗传转化。尤其对重要农作物的遗传改良和功能基因组的研究具有重大价值。

Description

磁性纳米载体介导的植物转基因方法

技术领域

本发明涉及纳米生物技术和生物纳米材料应用等领域，具体指一种以磁性纳米载体介导的植物转基因方法。

背景技术

植物基因工程是应用重组DNA技术，将外源基因导入到受体植物细胞内，使受体植物获得新的遗传性状。20世纪80年代，在细胞和组织培养、分子生物学研究领域取得一系列重大进展的基础上，植物基因工程到得到了迅猛的发展。棉花是我国重要的经济作物，对农业和棉纺行业的发展具有举足轻重的作用，但传统的育种方法多限于品种间或种间的染色体重组，具有很大的局限性。因此利用基因工程技术培育棉花新品种具有十分重要的意义。我国棉花生物技术研究起始于20世纪70年代，近年来随着植物转基因研究的蓬勃发展，转基因技术的不断改进和完善，转基因技术已经应用于棉花抗虫、抗除草剂、抗病、提高产量和品质改良育种的实践中，并得到了抗虫、抗除草剂、抗病等转基因新品种(系)，有些已经进入商品化生产，取得了显著的经济效益和社会效益，特别是中国农业科学院郭三堆等科学家培育成功的转基因抗虫棉的大面积推广，极大地促进了我国棉花产业的发展，不仅使棉花产量得到了显著提高，也大量减少了杀虫剂的使用，充分体现了转基因作物在农业生产中重要的经济与社会价值。因此，充分运用转基因技术，在高产、优质的棉花品种上，进一步导入抗病虫、抗除草剂、耐盐碱、耐干旱等基因，获得抗逆性优良的转基因棉花种质新材料，对转基因棉花新品种具有重要的现实意义。应用于棉花的转基因技术主要有农杆菌介导的外源基因导入方法、外源基因直接导入的花粉管通道法和基因枪法，这三种方法也是应用最广泛的植物遗传转化手段。

自从1987年Umbeck和Firoozababy等通过根癌农杆菌介导转化获得第一个表达外源基因的转基因植物以来，该方法在棉花遗传转化中得到了迅速应用。当前通过各种转基因技术已获得的近200种转基因植物，其中80%以上是利用根癌农杆菌转化方法获得的。该方法以转基因低拷贝、遗传稳定性好、能够转化大片段的DNA、转化效率高等优点倍受人们的关注，是目前转化机理研究最清楚，应用最广泛的方法。棉花的遗传转化采用的根癌农杆菌为土壤喜居菌，革兰氏染色呈阴性（李俊兰，2002）。利用农杆菌转移外源基因的过程一般是（1）将目的基因导入中间载体或二元载体；（2）将带有目的基因的中间载体或二元载体导入农杆菌；（3）使农杆菌感染寄主（受体）植物细胞或组织；（4）筛选转化细胞并诱导其再生植株；（5）对转基因植株进行分子检测。农杆菌介导的基因转移所适用的外植体非常广泛，包括叶片、茎段、胚轴、叶柄、子叶、幼胚或成熟种子。在棉花上常用的为下胚轴。

但是，影响农杆菌介导法的因素较多，主要有外植体类型和生理状态、外植体是否进行预培养、Vir基因活化状况、pH值、温度、渗透压、肌醇浓度以及一些糖类。棉花农杆菌介导遗传转化方法，由于其转化受体材料严格受基因型的限制、通过再生途径获得的转基因苗周期长、获得转基因苗由于其脱分化和再分化导致体细胞变异而突变率高等因素，制约了农杆菌介导的遗传转化方法在棉花基因工程中的应用。

花粉管通道途径（pollen tube pathway）是周光宇等人（1978）提出DNA片段杂交理论之后设计的自花授粉后外源DNA导入植物的转基因技术。棉花胚珠在授粉之前，珠心是一个封闭的体系，授粉后随花粉管的伸入，从珠孔到胚囊的一些珠心细胞退化形成一条通道，以利于花粉管进入胚囊，外源DNA可以通过花粉管通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞从而参与到新形成的种子中。由于这些细胞不具备正常的细胞壁，可作为天然的原生质体，易于DNA转化，受精后细胞DNA复制活跃，易于外源DNA的整合。用同位素示踪技术已经证实外源DNA是通过花粉管通道而不是通过花粉管进入胚囊的（龚蓁蓁，1988；黄国存，1998）。黄骏麒等(1981)应用花粉管通道法成功地将抗病基因导入高产、优质、感病的棉花品种中，获得耐黄萎病、抗枯萎病的棉花3118新品种。倪万朝等（1998）通过花粉管通道法将Bt基因导入泗棉3号，选育出了我国第一批通过审定的转基因抗虫棉GK1。

花粉管通道法应用于棉花基因工程，不仅打破了转化受体材料的基因型限制，无需大型仪器设备，而且整个转化过程在大田中实施、对转化条件要求比较简单、由转基因材料培育出新品种的周期短，可直接获得正常种子，因此在国内棉花遗传转化中得到了广泛的应用。但是，该方法转化后对子房机械损伤大，单棉铃的得籽率较低（单棉铃可收10粒以下种子），转化效率较低（按照转化的花朵数算，其转化效率0.03%～0.1%左右），工作量大，转化用的载体骨架结构也整合于棉花基因组中，获得的转基因材料中外源DNA一般为多拷贝，后代纯合速度较慢。

基因枪法又称粒子轰击法，是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。其基本原理是通过火药爆炸高压放电或高压气体作为动力加速带有基因的金属颗粒（如金粒或钨粒）使其进入带壁细胞。在此过程中质粒首先沉淀在微弹（金粒或钨粒）表面，结合有DNA分子的微弹经加速而获得足够的动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞，随后释出DNA分子并随机的整合到寄主的基因组内。Finer和Mullen（1990）以棉花胚性悬浮细胞为转化受体最先用基因枪法将GUS和NPTⅡ基因导入到棉花中，成功地获得了转基因棉花；吴敬音等（1994）应用基因枪轰击法将CPTI基因和NPTⅡ基因的重组质粒导入到棉花茎尖分生组织，培养获得卡那霉素抗性植株；刘传亮等（2003）采用基因枪导入技术将外源导入受体棉花品种的茎尖或茎尖分生组织，成功地育成转基因棉花品种（系）。

基因枪法由于将整个质粒表达载体通过金属颗粒引入细胞中，获得的转基因材料外源DNA一般为多拷贝，表达载体骨架结构序列也整合于基因组中；该方法也需要受体材料通过组织培养过程获得再生苗，导致转化受体材料严格受基因型的限制、通过再生途径获得的转基因苗周期长、获得转基因苗由于其脱分化和再分化引起体细胞变异而突变率高；转化用的金属颗粒比较昂贵，技术成本较高。因此该方法在棉花遗传转化中应用较少。

磁性纳米颗粒作为基因载体在动物和人体细胞的基因转导已经取得了成功，在基因转导和基因治疗等方面显示了广阔的应用前景（Soeren，2004；庄乾元，2007）。磁性纳米颗粒作为基因载体的优点主要表现在：（1）磁性纳米载体为非病毒载体，无免疫原性；（2）磁性纳米载体的比表面积大，能装载大量的大片段DNA；（3）磁性纳米载体表面修饰带正电的PEI基团，能有效结合带负电的DNA；（4）磁性纳米载体结合DNA能够使其免遭组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏，且纳米载体还可以介导外源基因在细胞染色体DNA中的整合，从而获得转基因长期稳定的表达；（5）磁性纳米载体具有超顺磁性，在磁场作用下能运送基因到目标位置，具有靶向性，能够人为进行操纵；（6）在磁性纳米颗粒表面常包覆一些生物材料，具有良好的生物相容性。

利用纳米颗粒作为基因载体，将外源基因转入植物细胞，能够克服传统的植物转基因方法的不足。Torney等（2007）利用中孔氧化硅微米颗粒为载体，携带外源基因物质，成功实现了GFP在烟草原生质体（Nicotiana tabacum）中的表达，首次将纳米基因载体带入植物细胞生物学的领域，研究指出纳米载体具有极大的比表面积，能够包裹大片段的DNA及调控物质，进入植物细胞，并实现调控表达。此外，Vijayakumar等（2010）利用纳米载体成功将外源基因导入水稻、烟草、银合欢等多种植物，纳米载体不存在宿主限制，并且当载体小到纳米级别后，其具有更高的穿透能力，能够有效进入植物细胞。王凤华等（2010）以磁性纳米颗粒为载体，用电击法介导基因导入水稻悬浮细胞，并获得瞬时表达，磁性纳米颗粒经过修饰，具有良好的生物相容性，并且对裸露的DNA起到保护作用，有效提高了转化效率。然而，利用磁性纳米基因载体转染植物花粉的研究未有人报道。

发明内容

一种磁性纳米载体介导的植物转基因方法，具体包括，将具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的磁性纳米载体与外源基因相结合，构建出基因－纳米磁颗粒载体复合物，将基因－纳米磁颗粒载体复合物与植物花粉或花药共培养，并以0.1~0.5T的磁场介导，进而将基因－纳米磁颗粒载体复合物转入植物花粉或花药细胞，通过植物授粉和受精过程实现外源目的基因的遗传转化。

在本发明中，基因－纳米磁颗粒载体复合物转化的植物材料为花粉或者花药，如含有基因－纳米磁颗粒载体复合物的花粉在授粉受精过程中，将目的基因导入受精卵并整合于染色体DNA，最后发育成含有目的基因的种子。本发明找出0.1~0.5T这个合适的磁场范围，而成功实现驱动磁性纳米载体DNA复合物进入花粉或花药细胞。

棉花、油菜、玉米等重要农作物花粉粒大、花粉数量多、易于收集，其萌发孔区域细胞壁较薄；纳米载体粒径小，具有较高的渗透性，磁性纳米载体处理植物花粉在不损伤花粉的前提下使它能携带外源DNA，随花粉管生长顺利进入胚囊，形成合子，从而直接得到转基因种子。此方法形成转化合子的机率大，对细胞的损伤小，操作简单，转化率较高，遗传稳定性好。

本发明是利用磁性纳米基因载体的超顺磁性和生物相容性，有效携带外源目的基因转染植物花粉，显著的提高了植物细胞的基因转化效率，从而建立了基于磁性纳米基因载体的植物转基因方法。本发明首次将磁性纳米基因载体应用到植物花粉的基因转导，建立了一种全新的磁场驱动下纳米磁性颗粒作基因载体的植物转基因方法。本发明方法具有操作简便、转导效率高和不受基因种类和数量限制等优点，可以广泛应用于植物转基因技术。

在本发明中，优选该磁性纳米载体粒径在10-500nm之间，该磁性纳米载体为天然的、人工合成的或从生物体内分离制备的。该磁性纳米载体在磁场驱动下，能携带外源目的基因定向进入植物细胞。更优选该磁性纳米载体为Fe₃O₄颗粒。

在本发明中，优选的是，磁性纳米载体与外源基因按照质量比5:1~1:20混合进行偶联，更优选该比值为2:1~1:5。本发明通过控制与纳米磁性载体结合的外源基因的量，使得转入的外源基因的拷贝数得到有效地控制。

在本发明中，优选所述磁性纳米载体与外源基因通过静电吸引作用相结合。磁性纳米载体能够在静电吸引作用下，将如为DNA的外源基因吸附至表面PEI薄膜的孔隙内。优选所述外源基因为质粒DNA、线性DNA、基因组DNA或RNA，且所述外源基因为单基因、多基因或混合质粒DNA；其中，该混合质粒DNA例如为文库。

在本发明中，所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物，且优选所述植物为棉花、油菜、黄瓜、西红柿、烟草、水稻或玉米。另外，优选所述植物为健壮的完整开花植株，其授粉部位为经过去雄并生殖隔离的柱头。

本发明的优点为：首先，本发明转染方法操作简单，易于掌握，便于推广。其次，本发明的转染方法不受外源基因种类和大小限制，不要求有受体细胞特异性，可广泛应用于植物转基因技术。再次，在本发明转染方法中，用纳米磁性粒子作基因载体，在磁场的介导下，外源目的基因进入花粉，整合到细胞基因组，显著提高了基因的转化效率。最后，本发明通过控制与纳米磁性载体结合的外源基因的量，可有效地控制转入的外源基因的拷贝数。

附图说明

图1为与实施例1相应的不同重量比的纳米载体/质粒pGBIF4ABC-α凝胶电泳图；

图2为实施例1中卡纳霉素进行筛选最终获得的T₀代阳性棉花植株的照片；

图3为实施例1中T₀代阳性棉花植株PCR检测结果；

图4为实施例1中T₁和T₂代棉花叶片DNA的Bt基因稳定性Southernblot分析；

图5为与实施例2相应的不同质量比的纳米载体/pK7G-HSERK的凝胶电泳图；

图6为与实施例3相应的不同质量比的纳米载体/BAC的凝胶电泳图；

图7为与实施例4相应的不同质量比的纳米载体/线性DNA的凝胶电泳图。

具体实施方式

实施例1

纳米Fe₃O₄/PEI基因载体介导双基因转化棉花花粉细胞：将棉花抗虫质粒（pGBIF4ABC-α，其含转化Bt和Cpti融合抗虫基因植物表达载体，卡那霉素抗性标记）与磁性纳米粒连接后转化棉花，具体步骤如下。a：受体材料开花前一天去雄，用细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染；b：摘取当天开放但未散粉的花朵，取出花药；c：将质粒pGBIF4ABC-α与纳米载体Fe₃O₄/PEI按质量比2：1连接，即每50ul体系中含有1ul（1ug/ul）磁性纳米粒和2ug质粒DNA，室温连接30min；d：将步骤c的体系稀释1000倍，将步骤b取得的花药浸泡其中，每100ml处理10个花药，置于0.3T的磁场下，驱动磁性纳米载体DNA复合物进入花粉细胞，处理30min；e：取出花药，吸水纸吸干花药残留的液体，置于阳光下晾晒，等待花粉散出后收集花粉，装入授粉瓶；f：田间授粉，将步骤a中去雄并生殖隔离柱头的细管拔掉，将步骤e所得花粉涂抹在柱头上，再用细管套住，防止其他花粉污染，并做好标记；g：棉花自然成熟后收获种子，播种后待第二片真叶出来后，将1000ppm的卡那霉素涂抹于叶片上进行筛选，未出现黄斑的植株即为候选阳性植株；将获得的候选阳性植株，在长出第四片真叶和第八片真叶时分别利用卡纳霉素再进行两次筛选，获得T₀代阳性植株，其照片如图2所示；h：摘取T₀代阳性植株叶片，提取基因组DNA，利用Bt基因引物进行PCR检测，结果图见图3，最终确定阳性植株，该方法转化效率为10%。i：筛选获得的性状优良的T₀代植株种子，播种后按照T₀代卡纳霉素和分子检测筛选方法继续筛选，获得T₁代转基因材料，收取种子后继续筛选获得稳定表达抗虫基因的T₂代转基因棉花植株材料。图4相应的T₁和T₂材料中Bt基因Southern blot分析表明Bt基因在T₁、T₂代棉花植株中能够稳定遗传。

图1显示了不同重量比的纳米载体/质粒pGBIF4ABC-α复合物凝胶电泳图，图1中将纳米载体与质粒DNA按一系列质量梯度比例连接，即MNPs：DNA依次为0:1、2:1、1:1、1:5、1:10、1:20和1:40；DNA若能与纳米载体完全结合，则DNA滞留在点样孔中不能显现出条带，如图中的2:1和1:1。从图中可以看出，纳米载体与DNA能很好地结合，随着DNA用量的增大，至MNPs与DNA的质量比为1:20时，DNA明显不能与纳米载体完全结合，出现条带。在实施例1中为使DNA在完全与纳米载体结合的前提下使得载体尽量多携带DNA，因而选择MNPs：DNA为1:2，即质粒与载体的比例为2:1进行上述实验。图2为卡纳霉素进行筛选最终获得的T₀代阳性棉花植株的照片。图3为T₀代阳性棉花植株PCR检测结果；具体为，提取T₀代阳性棉花植株叶片基因组DNA，利用Bt基因引物进行PCR检测，结果显示目的基因Bt成功整合到细胞基因组中。图4为T₁和T₂代转基因棉花植株材料的叶片基因组DNA的Bt基因稳定性Southern blot分析；其中1、3、5泳道为T₁代，2、4、6泳道为T₂代；从图中结果表明转入的外源Bt基因在T₁、T₂代棉花植株中能够稳定遗传。

实施例2

纳米Fe₃O₄/PEI基因载体介导单基因转化棉花花粉细胞：棉花体细胞胚发育相关基因（pK7G-HSERK，卡那霉素抗性标记）与磁性纳米粒连接后转化棉花，其转化和遗传鉴定步骤与实施例1步骤a至i相同。图5显示了不同质量比的纳米载体/pK7G-HSERK复合物的凝胶电泳图。最终统计出本实施例中的转化效率为2%。

实施例3

纳米Fe₃O₄/PEI基因载体介导多基因人工染色体转化棉花花粉细胞：棉花基因组DNA细菌人工染色体（BAC，含氯霉素标记）与磁性纳米粒连接后转化棉花，其转化和遗传鉴定步骤与实施例1步骤a至i相同；不同的是，在步骤c中采用BAC与纳米载体按质量比1：1连接。图6显示了不同质量比的纳米载体/BAC复合物的凝胶电泳图。最终统计出本实施例中的转化效率为10%。

实施例4

纳米Fe₃O₄/PEI基因载体介导线性DNA转化棉花花粉细胞：草苷膦抗性基因（线性DNA，含卡那霉素标记）与磁性纳米粒连接后转化棉花，其转化和遗传鉴定步骤与实施例1步骤a至i相同。图7显示了不同质量比的纳米载体/线性DNA复合物的凝胶电泳图。最终统计出本实施例中的转化效率为10%。

对比例1

农杆菌子房注射法：a：用冻融法将质粒pGBIF4ABC-α转入农杆菌LBA4404，制备工程农杆菌；b：挑取工程农杆菌菌落于YEB液体培养基（卡那霉素50μg·mL^-1＋硫酸链霉素50μg·mL^-1+利福平50μg·mL^-1）摇瓶培养（200r·min^-1）18h左右，直到OD600值为0.8（细菌浓度为10⁶~10⁷cell·mL^-1，稀释法确定细菌浓度）；c：在摇好的菌液中加入乙酰丁香酮（30mg·L^-1）再置于摇床中培养2h，取100μL菌液，650μL蔗糖溶液（5%），250μL甘油（60%）混合，4℃保存；d：在注射前3d，将含有目的基因的农杆菌活化，于28℃培养箱，YEB固体培养基上长出直径为1mm的单菌落；e：注射当天，测菌液OD值，用5%的蔗糖溶液稀释到10⁵个/mL，加入乙酰丁香酮（0.1mmol·L^-1）、Silwet L77（0.05%）混匀；f：上午9:00-10:00，温度25~30℃之间，于田间选择果枝和花位较好的子房作为转化对象，以植株中部果枝的子房为好；将雄蕊和花冠剥离，右手持微量注射器，左手轻扶摘除花瓣后的子房，用微量进样器从柱头处沿子房的纵轴方向顺着花柱注入子房2/3处，垂直注射一半菌液，再拔出1/3，垂直注射另一半菌液，不能损伤子房室，共注射菌液10μL；g：注射后的棉铃挂好标牌，棉花自然成熟后收获种子。最终统计出其转化效率为1%。

对比例2

双基因DNA直接转化棉花花粉细胞：棉花抗虫基因质粒（pGBIF4ABC-α，其含转化Bt和Cpti融合抗虫基因植物表达载体，卡那霉素抗性标记）直接转化棉花，具体步骤如下。a：受体材料开花前一天去雄，用细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染；b：摘取当天开放但未散粉的花朵，取出花药；c：将质粒pGBIF4ABC-α稀释至0.2ug/uL；d：将步骤b取得的花药浸泡至c溶液中，每100ml处理10个花药，处理30min；e：取出花药，吸水纸吸干花药残留的液体，置于阳光下晾晒，等待花粉散出后收集花粉，装入授粉瓶；f：田间授粉，将步骤a中去雄并生殖隔离柱头的细管拔掉，将步骤e所得花粉涂抹在柱头上，再用细管套住，防止其他花粉污染，并做好标记；g：棉花自然成熟后收获种子，播种后待第二片真叶出来后，将1000ppm的卡那霉素涂抹于叶片上进行筛选，未出现黄斑的植株即为候选阳性植株；将获得的候选阳性植株，在长出第四片真叶和第八片真叶时分别利用卡纳霉素再进行两次筛选，获得T0代阳性植株。最终统计出本例中的转化效率为0%。

对比例3

单基因质粒直接转化棉花花粉细胞：棉花体细胞胚发育相关基因（pK7G-HSERK，卡那霉素抗性标记）直接转化转化棉花花粉，其转化和遗传鉴定步骤与对比例2步骤a至g相同。最终统计出本例中的转化效率为0%。

对比例4

多基因细菌人工染色体质粒直接转化棉花花粉细胞：棉花基因组DNA细菌人工染色体（BAC，含氯霉素标记）直接转化转化棉花花粉，其转化和遗传鉴定步骤与对比例2步骤a至g相同。最终统计出本例中的转化效率为0%。

对比例5

线性DNA直接转化棉花花粉细胞：草苷膦抗性基因（线性DNA，含卡那霉素标记）直接转化转化棉花花粉，其转化和遗传鉴定步骤与对比例2步骤a至g相同。最终统计出本例中的转化效率为0%。

对比例6

无磁场条件下，纳米Fe3O4/PEI基因载体介导双基因转化棉花花粉细胞：将棉花抗虫质粒（pGBIF4ABC-α，其含转化Bt和Cpti融合抗虫基因植物表达载体，卡那霉素抗性标记）与磁性纳米粒连接后转化棉花，具体步骤如下。a：受体材料开花前一天去雄，用细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染；b：摘取当天开放但未散粉的花朵，取出花药；c：将质粒pGBIF4ABC-α与纳米载体Fe₃O₄/PEI按质量比2：1连接，即每50ul体系中含有1ul（1ug/ul）磁性纳米粒和2ug质粒DNA，室温连接30min；d：将步骤c的体系稀释1000倍，将步骤b取得的花药浸泡其中，每100ml处理10个花药，处理30min；e：取出花药，吸水纸吸干花药残留的液体，置于阳光下晾晒，等待花粉散出后收集花粉，装入授粉瓶；f：田间授粉，将步骤a中去雄并生殖隔离柱头的细管拔掉，将步骤e所得花粉涂抹在柱头上，再用细管套住，防止其他花粉污染，并做好标记；g：棉花自然成熟后收获种子，播种后待第二片真叶出来后，将1000ppm的卡那霉素涂抹于叶片上进行筛选，未出现黄斑的植株即为候选阳性植株；将获得的候选阳性植株，在长出第四片真叶和第八片真叶时分别利用卡纳霉素再进行两次筛选，获得T0代阳性植株。最终统计出本例中的转化效率为0%。

对比例7

无磁场条件下，纳米Fe₃O₄/PEI基因载体介导单基因转化棉花花粉细胞：棉花体细胞胚发育相关基因（pK7G-HSERK，卡那霉素抗性标记）与磁性纳米粒连接后转化棉花，其转化和遗传鉴定步骤与对比例6步骤a至g相同。最终统计出本例中的转化效率为0%。

对比例8

无磁场条件下，纳米Fe3O4/PEI基因载体介导多基因人工染色体转化棉花花粉细胞：棉花基因组DNA细菌人工染色体（BAC，含氯霉素标记）与磁性纳米粒连接后转化棉花，其转化和遗传鉴定步骤与对比例6步骤a至g相同；不同的是，在步骤c中采用BAC与纳米载体按质量比1：1连接。最终统计出本例中的转化效率为0%。

对比例9

无磁场条件下，纳米Fe₃O₄/PEI基因载体介导线性DNA转化棉花花粉细胞：草苷膦抗性基因（线性DNA，含卡那霉素标记）与磁性纳米粒连接后转化棉花，其转化和遗传鉴定步骤与对比例6步骤a至g相同。最终统计出本例中的转化效率为0%。

表1

由表1可以看出，实施例1中棉花抗虫质粒的转化效率达到10%，远高于对比例1中农杆菌子房注射法1%的转化效率，且本发明操作更简便。而对比例2~5中单独用DNA处理花药，转化效率为0%，即没有得到转基因植物。对比例6~9中，使用了磁性纳米载体，但没有磁场驱动，转化效率为0%，即基因－纳米磁颗粒载体复合物无法进入花粉中。因此，本发明在外加磁场驱动的条件下，尤其是在0.1~0.5T的磁场下，磁性纳米基因载体介导花粉转基因方法能够获得遗传性稳定的转基因棉花植株。因此，磁性纳米基因载体介导花粉转基因方法是一种优良的转基因植物培育新方法。

Claims (5)

1.一种磁性纳米载体介导的植物转基因方法，其特征在于：将具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe₃O₄磁性纳米载体与外源基因相结合，且二者按照质量比5:1～1:20混合进行偶联，构建出基因－纳米磁颗粒载体复合物，将基因－纳米磁颗粒载体复合物与植物花粉或花药共培养，并以0.1～0.5T的磁场介导，进而将基因－纳米磁颗粒载体复合物转入植物花粉或花药细胞，通过植物授粉和受精过程实现外源目的基因的遗传转化；且所述磁性纳米载体与外源基因通过静电吸引作用相结合，所述植物为棉花、油菜、黄瓜、西红柿、烟草、水稻或玉米。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该磁性纳米载体粒径在10-500nm之间。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：磁性纳米载体与外源基因按照质量比2:1～1:5混合进行偶联。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源基因为质粒DNA、线性DNA、基因组DNA或RNA，所述外源基因为单基因、多基因或混合质粒DNA。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述植物为健壮的完整开花植株，其授粉部位为经过去雄并生殖隔离的柱头。