CN110331167B - 一种不依赖于玉米基因型的dna导入方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不依赖于玉米基因型的DNA导入方法，采用带正电荷的磁性纳米颗粒作为基因载体与带负电荷的DNA结合，在磁场作用下，结合了DNA的磁性纳米颗粒通过花粉孔将DNA转运至玉米花粉中，并通过授粉和结实的自然生殖过程，实现目的基因的导入。本发明可实现目的基因在所有玉米中的高效导入和瞬时及稳定表达，突破了当前基于组织培养的主流玉米基因导入方法受限于极少数受体材料、导入效率低、操作繁琐等瓶颈问题。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效的纳米磁珠介导的花粉转染体系和适用于所有玉米基因型的DNA导入方法。
背景技术
玉米是世界上非常重要的农作物，也是我国第一大作物，我国年种植面积超4亿亩。我国是玉米第二大主产国和消费国，玉米在粮食生产和国民经济中占有极其重要的地位。玉米是主要的饲料和重要的工业加工原料，兼有粮、经、果、饲、能等多方面用途。随着饲料、淀粉、燃料乙醇等用量迅速增加，需求强力拉动，我国玉米供求关系已发生明显变化，从自给有余略有出口的基本平衡型向着供应偏紧，需少量进口补充的紧平衡状态过渡。玉米的种业市场规模巨大，是国际种业巨头竞争的主战场。过去200多年来虽然传统杂交育种给玉米产业带来了巨大好处，但依然面临着许多挑战难以解决：如生物与非生物逆境胁迫、产量与品质提高等困难。聚合当代先进分子育种技术可以有效解决这些困境。玉米的高效DNA导入技术是现代分子育种的重要手段，目前现有的DNA导入技术如基因枪法、农杆菌法、PEG介导等都是过度依赖于高效的玉米组培体系，玉米的组培严重受限于玉米基因型，商品化品种的组培效率非常低，难以满足玉米种业现代分子育种的需求。
发明内容
本发明的目的在于开发出一种简便高效的适用所有玉米基因型的DNA导入技术体系方法，该方法直接利用田间生长的玉米进行转化，无需昂贵的仪器设备，操纵简便，成本低廉，适用于所有玉米品种。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种不依赖于玉米基因型的DNA导入方法，采用带正电荷的磁性纳米颗粒作为基因载体与带负电荷的DNA结合，在磁场作用下，结合了DNA的磁性纳米颗粒通过花粉孔将DNA转运至玉米花粉中，并通过授粉和结实的自然生殖过程，实现目的基因的导入。目的基因导入到玉米花粉中，可实现目的基因在花粉中的瞬时表达。授粉后，目的基因可在花丝、幼胚和子代植株中表达，并产生携带目的基因的可遗传的后代植株。具体操作步骤为：
1)质粒DNA的提取及纯化；
2)磁性纳米颗粒与质粒DNA混合并在室温下结合25～35min得到磁性纳米颗粒与DNA的复合物：MNP-DNA；所用2)磁性纳米颗粒其巨大的比表面积使其能够装载大容量的基因，且其体积微小而具有较强的穿透性，在花粉内高效地运输，并保持核酸分子较高的生物功能活性、最终实现高转染效率；
3)收集玉米花粉并过100目筛除去花药；所用玉米花粉直径在60-120μm之间(图2)，可穿过孔径为150μm的100目筛，达到筛除杂质的目的；
4)配制玉米花粉培养液，使用玉米花粉培养液重悬步骤2)获得的MNP-DNA得到MNP-DNA悬浮液，并将MNP-DNA悬浮液加入到步骤3)获得的过筛玉米花粉中，搅拌，置于磁板上室温静置转染15～30min；所述玉米花粉培养液中各成分含量为：蔗糖200g/L、H3BO3103mg/L、KNO3 53mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 148mg/L、MnSO4·H2O 578.7mg/L、MgSO4·7H2O103mg/L、GA3 30mg/L；所述玉米花粉培养液中蔗糖浓度为200g/L，用以维持玉米花粉渗透压，硼酸、无机盐和赤霉素用于维持玉米花粉活力；
5)转染结束后，吸去花粉上层的悬浮液，将转染后的花粉转移至500目尼龙布上铺匀，并用滤纸吸干水分；所用500目尼龙布孔径为25μm，可截留玉米花粉，而过滤液体，从而最大限度的保留转染的玉米花粉；
6)将尼龙布展开，撒玉米淀粉，用刷子将黏在尼龙布上的花粉和玉米淀粉混匀并分散得花粉-玉米淀粉混合物；所用玉米淀粉可快速吸干转染玉米花粉表面的的水分，缩短花粉干燥时间，保持花粉活力；
7)将步骤6)获得的花粉-玉米淀粉混合物过100目筛并收集；所用100目筛孔径为150μm，可将花粉-玉米淀粉混合物颗粒化，更有利于均匀授粉；
8)对正在吐丝的雌蕊进行授粉。
进一步的，所述磁性纳米颗粒的直径为50-200nm。
进一步的，所述磁性纳米颗粒为采用聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米颗粒，其内核为Fe3O4。
进一步的优化具体操作步骤为：
1)用碱裂解法提取及纯化质粒DNA，并用灭菌双蒸水稀释至1μg/μL；
2)磁性纳米颗粒与质粒DNA按质量比1:4混合并在室温下结合30min得到磁性纳米颗粒与DNA的复合物：MNP-DNA；
3)收集玉米花粉并过100目筛除去花药，将过筛玉米花粉转移至培养皿中；
4)配制玉米花粉培养液，使用玉米花粉培养液重悬步骤2)获得的MNP-DNA得到MNP-DNA悬浮液，并将MNP-DNA悬浮液加入到步骤3)获得的过筛玉米花粉中，搅拌，盖上培养皿的盖子，置于磁板上室温静置转染30min；所述玉米花粉培养液中各成分含量为：蔗糖200g/L、H3BO3 103mg/L、KNO3 53mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 148mg/L、MnSO4·H2O 578.7mg/L、MgSO4·7H2O 103mg/L、GA3 30mg/L；过筛玉米花粉与玉米花粉培养液的比值为1g/4mL；
5)转染结束后，吸去花粉上层的悬浮液，将转染后的花粉转移至500目尼龙布上铺匀，并用滤纸吸干水分；
6)将尼龙布展开，撒上玉米淀粉，用刷子将黏在尼龙布上的花粉和玉米淀粉混匀并分散得花粉玉米淀粉混合颗粒；玉米淀粉与步骤3)获得的过筛玉米花粉的质量比为2:5；
7)将步骤6)获得的花粉玉米淀粉混合物过100目筛并收集；
8)对正在吐丝的雌蕊进行授粉。
本发明的有益效果：
本发明采用不依赖于基因型的纳米磁珠介导法，可实现目的基因在所有玉米中的高效导入和瞬时及稳定表达，突破了当前基于组织培养的主流玉米基因导入方法受限于极少数受体材料、导入效率低等瓶颈问题。该方法充分利用玉米开花结实的自然生殖过程，对受体材料和环境条件影响小，节省人力物力，成本低廉。其次，该转染方法操作快捷，从收集玉米花粉到完成转染并授粉的整个过程可在1-2h完成，极大限度的保持了玉米花粉的活力，有利于提高转化结实率，获得大量可供筛选的转化后代。再次，该方法简便高效，仅需提供既定磁场即可完成转化，无需昂贵的仪器设备，可在田间和基地实现大规模玉米转化。
附图说明
图1为载体pYBA1132结构示意图；
图2为玉米花粉磁转染过程示意图；
图3为EGFP基因在玉米花粉中的表达；
MNP+EGFP：磁转染EGFP基因的玉米花粉；MNP：仅加磁珠处理的玉米花粉；CK：未转染的玉米花粉；Merge：绿色荧光和明场叠加；GFP：绿色荧光；Bright：明场。
图4为EGFP基因在玉米花丝和幼胚中的表达；
(a).授粉后24小时的花丝；(b).授粉后48小时的幼胚；MNP+EGFP：磁转染EGFP基因的玉米花丝/幼胚；CK：未转染的玉米花丝/幼胚；Merge：绿色荧光和明场叠加；GFP：绿色荧光；Bright：明场。
图5为EGFP基因在T1代玉米中的表达；
(a).三叶期幼叶；(b).三叶期幼根；(c).开花期阳性植株花粉；MNP+EGFP：磁转染EGFP基因的玉米幼叶/幼根/花粉；CK：未转染的玉米幼叶/幼根/花粉；Merge：绿色荧光和明场叠加；GFP：绿色荧光；Bright：明场。
图6为转染EGFP京92T1代植株分子检测。
(a).EGFP基因的PCR检测；(b).EGFP和ZmActin1的RT-PCR检测；(c).EGFP蛋白的Western blot检测；M：DL2000DNA分子量标记；图片上方的数字代表对应的T1代植株编号；CK：未转染对照；B：空白对照；P：pYBA1132质粒；L：生物素标记的蛋白marker；EGFP：重组EGFP蛋白。
具体实施方式
实施例1
一种不依赖于玉米基因型的DNA导入方法：
采用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)修饰的带正电荷的Fe3O4磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles，MNPs，货号9006，德国Chemicell公司)作为基因载体，结合并保护带负电荷的DNA。在磁场的作用下，纳米磁珠通过花粉孔将DNA转运至玉米花粉中，并通过授粉和结实的自然生殖过程，实现目的基因的导入。
所用玉米材料为骨干自交系：178、B73、HZ178、京92和郑58。
所用载体为本单位构建的含有绿色荧光蛋白的表达载体pYBA1132(Liu等，PlantGenomics in China XIV，2013，169)，pYBA1132载体序列为SEQ ID NO.1所示，包括SEQ IDNO.2所示的CaMV 35S启动子(p35S)和SEQ ID NO.3所示的增强型绿色荧光蛋白基因EGFP(Enhance green fluorescent protein)，可用于荧光观察。pYBA1132图谱如图1所示。
具体的花粉转染过程如图2所示。
1)用碱裂解法提取并纯化质粒DNA(pYBA1132)，并用灭菌双蒸水稀释至1μg/μL。
2)将磁性纳米颗粒和质粒DNA按质量比1:4混匀，室温结合30分钟，形成MNP-DNA复合物。
3)上午十点左右收集新鲜的玉米花粉(图2(a))，过100目筛，筛除花药(图2(b))。称取过筛花粉约5g，转移至直径9cm的塑料培养皿中。
4)用20mL玉米花粉培养液(含蔗糖200g/L、H3BO3 103mg/L、KNO3 53mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 148mg/L、MnSO4·H2O 578.7mg/L、MgSO4·7H2O 103mg/L、GA3 30mg/L)重悬MNP-DNA复合物，并加入玉米花粉中，轻柔搅动混匀，盖上培养皿盖子，置于MagnetoFACTOR-96磁板(货号9008-96，德国Chemicell公司)上室温静置转染30min(图2(c))。
5)转染结束后，小心吸去花粉上层的悬浮液，将转染后的花粉转移至500目尼龙布上铺匀，并用滤纸吸干水分(图2(d))。
6)将尼龙布展开，均匀撒上约2g玉米淀粉，用干净刷子将黏在尼龙布上的花粉和玉米淀粉混匀，并分散成细小的颗粒(图2(e))。
7)将转染花粉与玉米淀粉混合后过100目筛(图2(f))，并转入纸袋中；
8)对正在吐丝的玉米自交系雌穗(提前套袋)25-30穗进行授粉(图2(g))。授粉17天后可见灌浆籽粒(图2(h))。
实施例2
荧光跟踪整个导入过程(以京92为例)
1)EGFP基因在玉米花粉中的表达。蘸取适量转染后的花粉，接种于玉米花粉固体培养基(玉米花粉培养液中加入15g/L琼脂粉)上，25℃黑暗条件下培养24小时。用毛笔蘸取适量培养后的玉米，在玉米花粉培养液轻柔分散开，并在激光共聚焦显微镜下用488nm激发光观察绿色荧光。荧光观察结果如图3所示。图3中，MNP+EGFP：磁转染EGFP基因的玉米花粉；MNP：仅加磁珠处理的玉米花粉；CK：未转染的玉米花粉；Merge：绿色荧光和明场叠加；GFP：绿色荧光；Bright：明场。根据图3可见，92％(491/536)转染了EGFP基因的花粉中可见绿色荧光，而只加了纳米磁珠的花粉和未转染的花粉中均无绿色荧光，说明通过花粉转染可将EGFP基因导入玉米花粉中并实现表达。
2)EGFP基因在转染玉米花丝和幼胚中的瞬时表达。将转染花粉对正在吐丝的玉米自交系雌穗授粉。在授粉后24小时取花丝，48小时取幼胚，在激光共聚焦显微镜下用488nm激发光下观察绿色荧光。荧光观察结果如图4所示。图4中，(a).授粉后24小时的花丝；(b).授粉后48小时的幼胚；MNP+EGFP：磁转染EGFP基因的玉米花丝/幼胚；CK：未转染的玉米花丝/幼胚；Merge：绿色荧光和明场叠加；GFP：绿色荧光；Bright：明场。根据图4可见，在83％(25/30)转染了EGFP基因的花丝和70％(21/30)的幼胚中均可见绿色荧光，而未转染的对照花丝和幼胚中无绿色荧光。说明通过花粉转染可将EGFP基因导入玉米花丝和幼胚中，并表达出有活性的EGFP蛋白。
3)EGFP基因在转染玉米子代(T1代)植株中的表达。收获转染了EGFP基因的玉米自交系种子并在营养土中发芽，在三叶期取幼叶和幼根，在开花期取阳性植株的新鲜花粉，在激光共聚焦显微镜下用488nm激发光下观察绿色荧光。荧光观察结果如图5所示。图5中，(a).三叶期幼叶；(b).三叶期幼根；(c).开花期阳性植株花粉；MNP+EGFP：磁转染EGFP基因的玉米幼叶/幼根/花粉；CK：未转染的玉米幼叶/幼根/花粉；Merge：绿色荧光和明场叠加；GFP：绿色荧光；Bright：明场。根据图5可见，在18％转染了EGFP基因子代植株的幼叶和幼根中以及阳性植株92％的花粉中均可见绿色荧光，而未转染对照的幼叶、幼根和花粉中均无绿色荧光。说明转染的EGFP基因传递到子代玉米植株中，并表达出有活性的EGFP蛋白。
实施例3
转染EGFP京92T1代植株分子检测
在三叶期，取转染EGFP的京92T1代植株的嫩叶，提取基因组DNA、总RNA和总蛋白。用表2中的引物进行PCR检测，然后对PCR阳性植株进行RT-PCR检测。表1中：EGFP-F是用于检测EGFP基因的上游引物(20bp)，序列如SEQ ID No.4所示；EGFP-R是用于检测EGFP基因的下游引物(20bp)，序列如SEQ ID No.5所示；ZmActin1-F是用于检测ZmActin1内参基因的上游引物(22bp)，序列如SEQ ID No.6所示；ZmActin1-R是用于检测ZmActin1内参基因的下游引物(20bp)，序列如SEQ ID No.7所示。随后，对RT-PCR阳性植株进行Western blot分析。
图6是转染EGFP京92T1代植株的分子检测结果图。图6中，(a).EGFP基因的PCR检测；(b).EGFP和ZmActin1的RT-PCR检测；(c).EGFP蛋白的Western blot检测；M：DL2000DNA分子量标记；图片上方的数字代表对应的T1代植株编号；CK：未转染对照；B：空白对照；P：pYBA1132质粒；L：生物素标记的蛋白marker；EGFP：重组EGFP蛋白。根据图6(a)可见，46％(36/79)的T1代植株中可检测到EGFP基因的特异性扩增产物，而未转染对照及空白中检测不到，说明通过花粉转染可将目的基因导入子代植株中；在图6(b)中，32％(25/79)的T1代植株中可检测到EGFP基因的特异性转录产物，而未转染对照及空白中检测不到，说明通过花粉转染导入子代植株中的目的基因能正常转录；最终，在6(c)中，17％(13/79)的T1代植株中可检测到具有免疫活性的EGFP蛋白，而未转染对照中检测不到，说明通过花粉转染导入子代植株中的目的基因能正常翻译并表达出有功能的蛋白。
表1
实施例4
EGFP基因在不同自交系中的导入和表达情况
进一步分析了花粉转染在5种不同的玉米自交系中的效率。将CaMV 35S启动子驱动的EGFP基因转染178、B73、HZ178、京92和郑58，收获种子并发芽。在三叶期，取T1代植株的嫩叶，提取基因组DNA、总RNA和总蛋白，进行PCR、RT-PCR和Western检测，方法实施例3。EGFP基因在不同自交系T1代植株中的导入和表达情况结果见表2：按EGFP基因的PCR阳性率计算的导入效率较高，在29-68％之间；按RT-PCR阳性率计算的转染效率为18-32％；按Westernblot阳性率或GFP荧光检出率计算的表达效率达到7-18％。这些结果证实，通过花粉转染可高效的将目的基因导入子代植株中并表达出有功能的蛋白，该方法不受基因型限制，可实现对所有优良自交系进行直接且精确的分子改良。
表2
上述的实施例仅是本发明的部分体现，并不能涵盖本发明的全部，在上述实施例以及附图的基础上，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下可获得更多的实施方式，因此这些不付出创造性劳动的前提下获得的实施方式均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种不依赖于玉米基因型的DNA导入方法，其特征在于：采用带正电荷的磁性纳米颗粒作为基因载体与带负电荷的DNA结合，在磁场作用下，结合了DNA的磁性纳米颗粒通过花粉孔将DNA转运至玉米花粉中，并通过授粉和结实的自然生殖过程，实现目的基因的导入，所述磁性纳米颗粒的直径为50-200nm，所述磁性纳米颗粒为采用聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米颗粒，其内核为Fe3O4；具体操作步骤为：
1)质粒DNA的提取及纯化；
2)将磁性纳米颗粒和质粒DNA按质量比1:4混合并在室温下结合25～35min得到磁性纳米颗粒与DNA的复合物：MNP-DNA；质粒DNA的载体为pYBA1132；
3)上午收集玉米花粉并过100目筛除去花药；
4)配制玉米花粉培养液，使用玉米花粉培养液重悬步骤2)获得的MNP-DNA得到MNP-DNA悬浮液，并将MNP-DNA悬浮液加入到步骤3)获得的过筛玉米花粉中，搅匀，置于磁板上室温静置转染15～30min；所述玉米花粉培养液中各成分含量为：蔗糖200g/L、H3BO3 103mg/L、KNO3 53mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 148mg/L、MnSO4·H2O 578.7mg/L、MgSO4·7H2O 103mg/L、GA330mg/L；
5)转染结束后，吸去花粉上层的悬浮液，将转染后的花粉转移至500目尼龙布上铺匀，并用滤纸吸干水分；
6)将尼龙布展开，撒上玉米淀粉，用刷子将黏在尼龙布上的花粉和玉米淀粉混匀并分散得花粉玉米淀粉混合物；
7)将步骤6)获得的花粉玉米淀粉混合物过100目筛并收集；
8)对正在吐丝的雌蕊进行授粉。
2.根据权利要求1所述的不依赖于玉米基因型的DNA导入方法，其特征在于：具体操作步骤为：
1)用碱裂解法提取及纯化质粒DNA，并用灭菌双蒸水稀释至1μg/μL；
2)磁性纳米颗粒与质粒DNA按质量比1:4混合并在室温下结合30min得到磁性纳米颗粒与DNA的复合物：MNP-DNA；质粒DNA的载体为pYBA1132；
3)上午收集玉米花粉并过100目筛除去花药，将过筛玉米花粉转移至培养皿中；
4)配制玉米花粉培养液，使用玉米花粉培养液重悬步骤2)获得的MNP-DNA得到MNP-DNA悬浮液，并将MNP-DNA悬浮液加入到步骤3)获得的过筛玉米花粉中，搅拌，盖上培养皿的盖子，置于磁板上室温静置转染15～30min；所述玉米花粉培养液中各成分含量为：蔗糖200g/L、H3BO3 103mg/L、KNO3 53mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 148mg/L、MnSO4·H2O 578.7mg/L、MgSO4·7H2O103mg/L、GA3 30mg/L；过筛玉米花粉与玉米花粉培养液的比值为1g/4mL；
5)转染结束后，吸去花粉上层的悬浮液，将转染后的花粉转移至500目尼龙布上铺匀，并用滤纸吸干水分；
6)将尼龙布展开，撒上玉米淀粉，用刷子将黏在尼龙布上的花粉和玉米淀粉混匀并分散得花粉玉米淀粉混合物；玉米淀粉与过筛玉米花粉的质量比为2：5；
7)将步骤6)获得的花粉玉米淀粉混合物过100目筛并收集；
8)对正在吐丝的雌蕊进行授粉。
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