CN112626108B - 一种菊花转基因方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了一种菊花转基因方法与应用。本发明的菊花转基因方法，通过花粉管通道转化外源DNA，将结合有待转入基因的纳米磁珠与花粉在花粉培养液中进行转染，所述花粉培养液包括：KNO3、KCl和GA3，其中，GA3的质量与KNO3和KCl的质量之和的比例为1:8‑12。本发明的方法可大大提高菊花转基因的成功率，且操作简便利于推广。

Description

一种菊花转基因方法与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种菊花转基因方法与应用。
背景技术
1989年，Lemieux首次利用农杆菌介导法获得了第一个菊花转基因株系，至此，农杆菌介导法成为主要的菊花转基因方法。首先人们要建立菊花的叶片、茎段、胚轴等组织的遗传再生体系，将目标基因的质粒转化农杆菌，再利用携带质粒的农杆菌侵染这些组织，再进行抗生素筛选和组培再生培养，获取转基因阳性苗。农杆菌介导法转化过程中受到菊花组培再生体系的稳定性、植物组织细胞对抗生素的敏感性、农杆菌污染等众多因素的影响，因此转化效率十分低下，操作步骤繁琐且需要大量的植物组织处理和多次重复转化，限制了菊花基因工程育种的应用和发展。
纳米基因载体是指利用生物相容性的纳米材料制备的纳米粒子、纳米球、纳米囊、纳米多孔复合物等。在物理或化学亲和作用下，纳米基因载体与核酸分子相结合，形成纳米载体·核酸复合物。纳米载体体积微小而具有较强的穿透性，能够穿过组织与细胞间隙而进行移动，比表面积大能装载更多数量的基因，并且其化学结构富有活性，有利于进行表面修饰与改性；这些特性使纳米基因载体能够有效地吸附核酸分子并在细胞内实现高效运输，且保持了核酸分子较高的生物活性，因此实现了转染效率的大大提高。因此纳米基因载体受到了越来越多的研究者的关注，也为基因工程和生物技术育种提供了新的手段和研究思路。
现有植物转基因中已有通过花粉管通道转化外源DNA的转基因技术，其中以磁珠作为基因载体的方法也有报道。但目前，主要应用植物为棉花、玉米等植物，尚未有在菊花中应用的报道。而不同植物的生物学特性差异巨大，并不能直接应用其他植物的转基因方法来进行转化，因此，有必要建立一种适用于菊花的转基因方法，以推动菊花基因工程育种的发展。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的是提供一种可大大提高菊花转基因效率的方法。
为了实现本发明的发明目的，本发明的技术方案如下：
一种菊花转基因方法，通过花粉管通道转化外源DNA，将结合有待转入基因的纳米磁珠与花粉在花粉培养液中进行转染，所述花粉培养液包括：KNO3、KCl和GA3，其中，GA3的质量与KNO3和KCl的质量之和的比例为1:8-12，优选为1:10。
本发明针对菊花花粉特性对其外源基因转入方式进行了大量研究，发现当将磁珠与花粉在GA3存在，且含有特定比例钾盐的花粉培养液中进行转染，可既满足常规花粉培养的营养需要，又提升磁珠花粉介导法的成功率，实现高效的外源基因转入，为后续筛选培育新的菊花品种奠定了基础。
本发明中，GA3的浓度为20-30mg/L，优选25mg/L。
本发明中，KNO3的浓度为200-220mg/L、KCl的浓度为35-55mg/L。
本发明中，所述花粉培养液还包括：130-200g/L蔗糖、130-170mg/L MgSO4·7H2O、100-120mg/L H3BO3、200-220mg/L KNO3、35-55mg/L KCl、120-130mg/L Ca(NO3)2·4H2O、360-370mg/L MnSO4·H2O、7.20-7.30mg/L Na2EDTA、0.2-0.25mg/L Na2MoO4·2H2O、20-30mg/L GA3。
本发明对培养液的整体配方进行了组合搭配研究，发现以上述培养液有助于获得较理想的基因转化成功率。
本发明中，优选所述花粉培养液的配方如下：150g/L蔗糖、150mg/L MgSO4·7H2O、110mg/L H3BO3、210mg/L KNO3、40mg/L KCl、125mg/L Ca(NO3)2·4H2O、365mg/L MnSO4·H2O、7.25mg/L Na2EDTA、0.23mg/L Na2MoO4·2H2O、25mg/L GA3。
本发明中，纳米磁珠与待转入基因的质粒的质量比为1:(3.5-4.5)。优选1:4，以实现既使磁珠与待转入基因的质粒稳定结合，并起到保护质粒DNA的作用，又可配合本发明花粉培养液实现更好的转化成功率。
本发明中，所述菊花转基因方法具体包括：
(1)将纳米磁珠和待转入基因的质粒混匀，室温结合半小时；
(2)将结合好的磁珠-DNA混合物重悬于所述花粉培养液中；
(3)收集刚散粉的新鲜花粉，过筛，加入含有磁珠-DNA混合物的花粉培养液中充分浸没，置于磁板上室温静置半小时；
(4)将磁转化后的花粉进行干燥后进行授粉。
优选授粉对象为柱头成分叉状且富含粘液状物质的菊花雌蕊柱头。
本发明还提供一种上述方法在菊属及其近缘种属(亚菊属、太行菊属、向日葵属等)的植物基因工程育种中的应用。
具体可在授粉后，等杂交种子成熟后，收取种子，播种，通过导入质粒DNA的荧光标记或者其他筛选标记基因筛选出阳性株系。
本发明的有益效果至少在于：
本发明首次将磁转染成功应用于菊花转基因，建立了纳米磁珠花粉介导菊花转基因技术，操作步骤简单，避免了组织培养再生体系的过程，在田间地头便可操作，磁转染的花粉通过人工授粉直接获得转基因种子，经过筛选可以直接获得菊花转基因株系，且本发明方法转化效率高，创立了一种安全便捷的纳米载体菊花转基因新方法，可以广泛用于菊花基因工程育种，改良菊花的性状，创制菊花新种质，该技术的建立将大力推动菊花基因工程育种的发展。
附图说明
图1为本发明用来取花粉及杂交授粉的菊花照片，其中，A为“粉地毯”，B为“金盏”；
图2为本发明植物表达载体pMDC85的结构图；
图3为本发明转基因阳性株系的PCR凝胶电泳图；
图4为本发明转基因阳性株系根尖的GFP荧光图像。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种菊花转基因方法，具体包括以下步骤：
(1)质粒DNA的获得
对金鱼草，拟南芥和菊科植物等物种中已经克隆出来的TCP家族的基因进行比对，根据其保守结构域设计简并引物(表1)。以菊花品种‘粉地毯’花蕾总RNA反转录的cDNA为模版，克隆菊花TCP基因的中间片段。利用RACE基因全长克隆技术，克隆菊花TCP基因的全长，命名为TCPCm2-1。
表1TCP类基因的简并引物
Figure BDA0002866452230000041
利用质粒为模版、采用PCR的方法克隆构建植物表达载体所用基因；根据带有GFP筛选标记的pMDC85表达载体(植物表达载体pMDC85的结构参见图2)提供的多克隆位点(MCS)，选择TCPCm2-1的基因序列中不含有的两个限制性酶切位点Pac1、Asc1，将酶切位点序列引入目的片段PCR扩增的引物中：将TCPCm2-1连接到植物表达载体pMDC85获得质粒DNA待用。TCPCm2-1加酶切位点后的引物见表2。
表2
Figure BDA0002866452230000051
TCPCm2-1的序列如SEQ ID NO.5所示。
(2)磁珠与质粒DNA的复合
将纳米磁珠(德国Chemicell，平均粒径100纳米，1μg/μL)和上述构建的质粒DNA按质量比1:4混匀，室温结合30min。
将结合好的磁珠-DNA混合物重悬于2mL花粉培养液中。花粉培养液含：150g/L蔗糖、150mg/L MgSO4·7H2O、110mg/L H3BO3、210mg/L KNO3、40mg/L KCl、125mg/L Ca(NO3)2·4H2O、365mg/L MnSO4·H2O、7.25mg/L Na2EDTA、0.23mg/L Na2MoO4·2H2O、25mg/L GA3。
(3)转染
在晴朗的上午9—12点之间收集‘粉地毯’(Chrysanthemummorifolium‘Fenditan’，参见图1中的A)刚散开的新鲜花粉，称取过筛花粉约0.25g，小心转移至培养皿中，然后再加入2mL上述含有磁珠-DNA混合物的花粉培养液充分浸没，盖好培养皿盖子，将其置于磁板上室温静置半小时。
(4)授粉
用塑料刮板将磁转化后的花粉转移至500目尼龙布均匀平铺，用滤纸吸干水分。取干燥后的花粉，选择菊花品种‘金盏’(Chrysanthemum morifolium‘Jinzhan’，参见图1中的B)的花序上正在盛开的、最适合的雌蕊柱头(雌蕊柱头顶端开叉成“V”形，在中午前后的太阳光下可见亮晶晶的粘液状物质)进行授粉。
(5)阳性苗筛选
收获种子后随机选取150粒种子播种，2周后种子发芽，经过苗期生长，最终成活株系有85株。
对成活株系进行GFP荧光验证，具体为：取小苗的根尖部分，切成约0.5-1厘米根段，置于载玻片上，压片，置于荧光显微镜下观察，拍照。以野生型‘金盏’菊花的根系为对照。最终在实生苗的根系中检测到GFP表达的有24株，阳性株系的验证结果参见图4。图中CK为阴性对照株系；各数字编号为经验证为阳性的株系的编号。
进一步对在实生苗的根系中检测到GFP表达的24株植株的TCPCm2-1基因表达进行PCR检测。具体地，同时在TCPCm2-1和GFP的基因序列上分别设计上游和下游引物(表3)，利用PCR进行了验证，结果参见图3，其中，M：Marker；CK：阴性对照株系；各数字编号为经验证为阳性的株系的编号；从验证结果可知，成活苗的阳性株系比率达到28％。该实验表明纳米磁珠花粉介导法大大提高了菊花转基因成功率，是一种操作简便、十分有效的转基因技术。
表3验证阳性转化株系的PCR引物
Figure BDA0002866452230000061
实验例1
本实验例比较两种花粉培养液在纳米磁珠介导花粉转化中的效果。具体未详述部分参见实施例1。
收集‘粉地毯’的花粉充分混合后平均分为3组，在相同的转化处理条件下，处理1采用实施例1中GA3的质量与KNO3和KCl的质量之和的比例为1:10的花粉培养液，处理2采用的花粉培养液与实施例1的区别在于GA3的质量与KNO3和KCl的质量之和的比例为1:5，具体GA3的浓度为25mg/L，KNO3的浓度为105mg/L，KCl的浓度为20mg/L；处理3采用的花粉培养液与实施例1的区别在于GA3的质量与KNO3和KCl的质量之和的比例为1:15，具体GA3的浓度为15mg/L，KNO3的浓度为200mg/L，KCl的浓度为25mg/L。经实施例1的方法进行转化后，两组授粉结实率结果见表4。
表4
Figure BDA0002866452230000071
从上述结果可知，处理1的结实率更加理想。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京农业生物技术研究中心
<120> 一种菊花转基因方法与应用
<130> KHP201118448.9
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttttcyt caaacccytt tc 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttttgcttg ctttgtcraa mccta 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttaattaa atgttttctt caaacccc 28
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttggcgcgcc agatataggc ggaatagcat aca 33
<210> 5
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgttttctt caaacccctt tccagagttt ctcccatccc ctaatgtccc ccttccttcc 60
aatttatact ttgatcttga aaaagactat attaacactg gcccgtttat ctccaccgac 120
ggctatgttc atggctacaa cgctcttact cgtctaccat tcatggagga tcttaataca 180
attagtcaag attttcttag tcaacagcat cagttttctg atgttcaaag gtttcagtct 240
cctgaagatg ttgatgatct tctagggtta gtaatttcta gctcgaagtc aaagaagaaa 300
actgacacat ccaagaaaga tggacacagt aagattaaca cagctcaagg ccctcgggat 360
cgaagggtga gattgtccat tgagatctca agaaagttct tttgtcttca agacttgcta 420
ggttttgaca aagcaagcaa aacccttgat tggttattta gtaaatcgaa gaacgcgatt 480
aaggagctgg ttgaagacat aaaccacagc tcatcttcca ctgtgactga tcaatctaag 540
cttaattttc ttgaagccat taaaggagga tcagatgaag ataaagagaa aaagaagtca 600
gcaatcaagt atggtgatgt caaaaggaag aaaatgacac caaaatcaaa agctgtcgtt 660
caagagaatc tagcaagaga ccagtctagg gccatggcaa gagcgagagc acgagaaagg 720
actagagaaa agatgaatac caaaacagct gatgatgatt tgaagacatt acttcatgat 780
gattttgatt accatgtatg ctattccgcc tatatctag 819
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccatgtatgc tattccgcct a 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttcatccat gccatgtgta atc 23

Claims (6)

1.一种菊花转基因方法，通过花粉管通道转化外源DNA，其特征在于，将结合有待转入基因的纳米磁珠与花粉在花粉培养液中进行转染，所述花粉培养液包括：130-200g/L蔗糖、130-170mg/L MgSO4· 7H2O、100-120mg/L H3BO3、200-220mg/L KNO3、35-55mg/L KCl、120-130mg/L Ca(NO3)2· 4H2O、360-370mg/L MnSO4· H2O、7.20-7.30mg/L Na2EDTA、0.2-0.25mg/L Na2MoO4· 2H2O、20-30mg/L GA3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述花粉培养液的配方如下：150g/L蔗糖、150mg/L MgSO4· 7H2O、110mg/L H3BO3、210mg/L KNO3、40mg/L KCl、125mg/L Ca(NO3)2·4H2O、365mg/L MnSO4· H2O、7.25mg/L Na2EDTA、0.23mg/L Na2MoO4· 2H2O、25mg/L GA3。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，纳米磁珠与待转入基因的质粒的质量比为1:(3.5-4.5)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菊花转基因方法具体包括：
(1)将纳米磁珠和待转入基因的质粒混匀，室温结合半小时；
(2)将结合好的磁珠-DNA混合物重悬于所述花粉培养液中；
(3)收集刚散粉的新鲜花粉，过筛，加入含有磁珠-DNA混合物的花粉培养液中充分浸没，置于磁板上室温静置半小时；
(4)将磁转化后的花粉进行干燥后进行授粉。
5.权利要求1-4任一项所述的方法在菊属及其近缘种属的植物基因工程育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菊属的近缘种属为亚菊属、太行菊属或向日葵属。
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