CN111543307A - 一种白菜或青花菜CRISPR-Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法 - Google Patents
一种白菜或青花菜CRISPR-Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种白菜或青花菜CRISPR‑Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法。该方法包含以下步骤:(1)利用聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管介导的叶片瞬时转化法将CRISPR‑Cas9基因编辑载体转化白菜或青花菜叶片；(2)注射后的第三天观察叶片GFP荧光蛋白的表达情况,提取有GFP荧光表达的叶片部位的基因组DNA，扩增编辑位点附近的序列测序验证编辑位点附近是否发生基因编辑,从而鉴定CRISPR‑Cas9基因编辑体系的基因编辑效率。本方法解决了白菜和青花菜难以通过农杆菌侵染实现瞬时转化的问题，本发明简单有效地实现了白菜和青花菜的基因编辑，具有实验周期短，转化效率高的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种白菜或青花菜CRISPR-Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法。
背景技术
白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)作物多为一年生冬性蔬菜，但是由于白菜栽种时间跨度长，本身又容易染病产生病虫害，所以品质上变得良莠不齐，虽然产量巨大，但是产生的经济效益大打折扣。青花菜(Brassica oleracea L.var.italica Planch)又名西兰花，是十字花科芸薹属甘蓝种中以绿色花球为产品的一、二年生草本植物。营养价值较高，含有丰富的维生素，并含抗癌物质，受到消费者的青睐。青花菜栽培历史较短，但发展很快，在我国已成为一些地区出口创汇的重要优质蔬菜种类之一。通过现代育种技术，有目的性的增强白菜和青花菜抗性、提高其品质，是目前研究的当务之急。近年来，CRISPR/Cas9技术已经被用于多种园艺作物重要性状的改良。CRISPR/Cas9系统在植物领域具有广泛的应用范围，但极依赖于植物再生体系或遗传转化体系的建立。近年来多种遗传转化方法被用于白菜的遗传改良，其中包括农杆菌转化法、基因枪法、电击转化法以及花粉管通道法等，这些遗传改良方法对白菜的种质资源创新和新品种培育具有十分重要的意义。但是目前各种转化方法都有其局限性，尤其是白菜的再生体系建立十分困难。植物细胞壁是外源生物分子传递至细胞内的主要障碍，人们也采取了诸多办法来突破植物细胞壁的限制，比如通过农杆菌的侵染突破植物细胞壁的限制，或者是利用纤维素酶和果胶酶溶解植物的细胞壁直接转化植物的原生质体。但当前的递送方法，转化效率低，且费时费力。
在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，sgRNA的编辑效率对试验的结果影响很大，影响sgRNA编辑效率的因素有很多。为了研究基因编辑的载体在白菜上的编辑效率，本发明探索出了一个高效的瞬时转化体系，即利用PEI-SWNT将质粒载体通过叶面注射的方法导入到白菜和青花菜的叶面细胞当中，通过质粒载体上的GFP标签判断载体是否能导入到白菜和青花菜的叶面当中并完成瞬时表达。探索出了一个通过聚乙烯亚胺修饰的纳米碳管介导的白菜和青花菜瞬时转化方法。本方法具有容易操作，周期短，安全高效等优点。在白菜和青花菜的遗传转化方面有广阔的应用前景。
1碳纳米管(SWNT)的特性
SWNT是具有不同直径和手性的人造一维碳晶体。是由石墨烯卷曲形成的直径在纳米级别的管状晶体，由于它有极好的机械和电性能，已经发现碳纳米管许多潜在的应用，进行超声处理的空化效应，可将成束的单壁碳纳米管有效地分散在水中，并且可以与单链DNA分子结合。这一发现将生物学中的中心法则之一与技术上非常重要的纳米材料联系起来，并为生物技术中基于碳纳米管的应用打开了大门。PEI-SWNT有以下几个优点：
(1)SWNT是一种高纵横比的纳米材料(长度一般在0.5-2um，直径3-6nm)以被动地穿过植物的细胞壁和细胞膜，有出色的拉伸强度，不易折断。
(2)高比表面积体积比和生物相容性，PEI带有正电，可以吸附带负电的质粒载体，当与碳纳米管结合时，DNA分子受到保护，免受代谢和降解且对植株不具有毒性。
(3)该方法简单高效，便于操作，不需要组培等复杂的遗传转化方法，特别适合于白菜这种难以通过组织培养再生的作物。
2.碳纳米管在遗传转化上的应用
基于以上优点，碳纳米管在遗传转化方面已经有诸多应用和研究。Serag研究了多壁碳纳米管(MWCNTs)穿透植物原生质体细胞膜的能力，并通过共聚焦成像技术确定了植物原生质体的内吞MWCNTs摄取模式，同时观察到短的MWCNT(<100nm)可以靶向特定的细胞亚结构，包括细胞核，质体和液泡。Liu,Q研究了单壁碳纳米管(SWNT)穿透完整植物细胞的细胞壁和细胞膜的能力，共聚焦荧光图像显示SWNT/异硫氰酸荧光素和SWNT/DNA共轭物可以被细胞摄取，研究结果还表明单壁碳纳米管可以将不同的载体运送到不同的植物细胞器中。Wu,Y.等人的研究发现：当与单壁碳纳米管结合时可以保护DNA分子免受酶切和核酸结合蛋白的干扰，与其他直接递送DNA分子的方法具有更高的自传递能力和细胞内生物稳定性。Demirer利用PEI-SWNT作为传递材料，在本氏烟草，小麦和棉花叶片以及芝麻菜原生质体中都可以实现高效的DNA传递和蛋白的强表达，GFP最强的表达时间是转化后的第3天，最长可以持续到第10天，且无需转基因整合，其中在芝麻菜原生质体上具有85％的转化效率，该试验证明了PEI-SWNT可将物种的遗传物质被动传递到植物细胞中。但是他们的试验都没有在白菜和青花菜上的瞬时转化。农杆菌侵染瞬时表达的转化方法在烟草等模式物种上应用较多但是难以扩展到其他植物，尤其是在白菜上应用十分有限；原因是白菜的叶片和烟草的叶片有很大的不同，不结球白菜和青花菜叶片有较厚的细胞壁，外源载体难以穿过植物的细胞壁到达细胞内,烟草的细胞壁较薄，细胞间隙大，叶背面有含有丰富的气孔，这些有利的条件是在白菜叶片上都是不具备的，所以说农杆菌只能侵染细胞壁较薄的白菜的愈伤组织，但是无法侵染不结球白菜的叶片，利用PEI-SWNT作为传递载体将外源基因导入到白菜的叶面细胞中还未曾有人尝试过，本领域研究人员无法预料PEI-SWNT作为传递载体是否跟农杆菌侵染法一样也无法实现对白菜或青花菜的叶片的瞬时转染。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种白菜或青花菜的瞬时转化方法。
本发明的另一目的是提供一种白菜或青花菜CRISPR-Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种白菜或青花菜CRISPR-Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法，包含以下步骤:
(1)利用聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管介导的叶片瞬时转化法将CRISPR-Cas9基因编辑载体转化白菜或青花菜叶片；
(2)注射后的第三天观察叶片GFP荧光蛋白的表达情况,提取有GFP荧光表达的叶片部位的基因组DNA，扩增编辑位点附近的序列测序验证编辑位点附近是否发生基因编辑,从而鉴定CRISPR-Cas9基因编辑体系的基因编辑效率；
其中，所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管介导的叶片瞬时转化法是将聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与带有GFP荧光标签的CRISPR-Cas9基因编辑载体混合，室温孵育形成复合体；当白菜或青花菜幼苗第3片叶片长出时，选择生长健壮的植株作为备选的注射植株,用1ml注射器将所述的复合体注射到白菜或青花菜的叶片细胞中。
作为本发明方法的一种优选，所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒的质量比为2～5:1，孵育时间为30～40min。
作为本发明方法的进一步优选，所述的所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒的质量比为3:1，孵育时间为30min。
作为本发明方法的一种优选，选择白菜或青花菜的子叶和真叶进行注射。
一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管介导的白菜或青花菜叶片瞬时转化的方法，包括以下步骤：
(1)制备聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管：将干燥的COOH-SWNTs加入蒸馏水，超声波浴处理获得COOH-SWNT悬浊液，PEI与COOH-SWNTs共反应获得聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管PEI-SWNT；
(2)将PEI-SWNT与带有GFP荧光标签的CRISPR-Cas9基因编辑载体结合，室温孵育；
(3)当幼苗第3片叶片长出时，选择生长健壮的白菜或青花菜植株作为备选的注射植株；
(4)用1ml注射器将步骤(2)中的复合体注射到白菜和西兰花的叶片细胞中，注射后的第三天观察叶片GFP荧光蛋白的表达情况。
作为本发明方法的一种优选，所用到的碳纳米管COOH-SWNTs的直径为4-5nm，长度为0.5-1.5um。
作为本发明方法的一种优选，COOH-SWNTs与蒸馏水的质量体积比为(20～25)mg：1mL。
作为本发明方法的一种优选，所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒的质量比为2～5：1，孵育时间为30～40min；优选聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒的质量比为3：1，孵育时间为30min。
作为本发明方法的一种优选，选择白菜或青花菜的子叶和真叶进行注射。
以下为本发明方法的详述：
1.sgRNA的设计与基因编辑载体的构建
用在线软件对目标基因序列进行靶位点分析，选择位于外显子上、GC含量不低于50％、靠近基因编码区5'端的序列作为靶位点；将候选的sgRNA与白菜和青花菜的基因组序列进行比对，淘汰脱靶较高的sgRNA，并将人工合成的sgRNA序列按照说明书的方法连接到VK005-12质粒载体上并测序验证。将测序结果正确的质粒进行摇菌扩繁，质粒提取步骤按照天根生化科技(北京)有限公司质粒提取试剂盒说明书进行，提取后的质粒浓度需要达到1000ng/ul，若浓度不够则利用浓缩仪进行浓缩。
2.PEI-SWNT的制备
按照文献(Carbon nanotube–mediated DNA delivery without transgeneintegration in intact plants)的方法制备(PEI-SWNT)。将1.3mg干燥的COOH-SWNTs加入50ml锥形底离心管中，加入30ml蒸馏水，超声波浴处理获得COOH-SWNT悬浊液，PEI与COOH-SWNTs共反应获得PEI-SWNT复合体。PEI与COOH-SWNTs按照1：20的比例共反应获得PEI-SWNT复合体，将PEI-SWNT复合体转移到100000-MWCO过滤器中。用无核酸酶的水洗涤PEI-SWNT溶液六次，将过量的PEI洗去。
3.DNA加载到PEI-SWNT上并注射到白菜叶片当中
准备MES输送缓冲液(pH＝4.5-5.0)用于稀释PEI-SWNT，以PEI-SWNT：DNA(3:1)的质量比将500ngPEI-SWNTs与167ng质粒DNA复合在一起，在室温下孵育30分钟以形成DNA-PEI-SWNT复合物。将DNA-PEI-SWNT溶液吸入1毫升的无针注射器。在白菜和青花菜叶子背面用针尖刺穿；将注射器缓慢注射到白菜和青花菜的叶片中。在叶片上轻轻地标记入渗区域。待1天后质粒DNA转录为mRNA，2～3d将mRNA翻译为蛋白。
4.观察白菜和青花菜叶片注射部位GFP荧光蛋白的表达情况
注射后的植株转移到光培箱(光周期为白天16h，27℃；夜晚8h，22℃)进行培养。在注射后第三天在激光共聚焦显微镜下观察叶片是否有GFP荧光蛋白的表达(见图3、图4)。
5白菜和青花菜CRISPR/Cas9系统候选sgRNA基因编辑效率
取白菜叶片有GFP荧光表达部位的叶片，用CTAB法提取叶片的基因组DNA根据编辑的基因序列，设计包含编辑位点的引物进行PCR扩增，引物的序列用NCBI网站设计，引物由擎科生物公司合成。扩增后的PCR片段用胶回收试剂盒纯化回收，连接T载体后，进行大肠杆菌的转化，每个样品挑取6个单克隆摇菌后进行菌液PCR然后送公司测序。将测序结果与白菜的基因序列进行比较(见图5、图6)，并计算编辑效率。
有益效果：本发明以PEI-SWNT为转运载体，通过叶面注射的方法将基因编辑载体分别导入到白菜或青花菜的叶片细胞内成功实现其瞬时转化，解决了白菜和青花菜难以通过农杆菌侵染实现瞬时转化的问题，本发明简单有效地实现了白菜和青花菜的基因编辑和转化，具有实验周期短，转化效率高的优点。
附图说明
图1：聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管(PEI-SWNT)的制备及瞬时转化示意图
图2：VK005-12载体结构示意图
图3：白菜叶片GFP荧光蛋白表达图
A：阴性对照；B：PEI-SWNT与质粒复合体注射的植株叶片
图4：青花菜叶片GFP荧光蛋白表达图
A：阴性对照；B：PEI-SWNT与质粒复合体注射的植株叶片
图5：不结球白菜bee1基因编辑位点序列比对图
图6：青花菜bee1基因编辑位点序列比对图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的VK005-12载体购自于北京唯尚立德公司
实施例1
1.sgRNA的设计与基因编辑载体的构建
1.1sgRNA的设计与筛选
用CRISPR-p2.0(http://crispr.hzau.edu.cn)在线软件对BEE1(Bra025910)基因序列进行靶位点分析，选择位于外显子上、GC含量不低于50％、靠近基因编码区5'端的序列作为靶位点；将候选的sgRNA与白菜的基因组序列进行比对，淘汰脱靶较高的sgRNA，设计的引物序列如表1所示，并将人工合成的sgRNA序列连接到VK005-12质粒载体上。
表1白菜和青花菜BEE1基因编辑位点sgRNA序列
注：下划线标记的是PAM
1.2oligo二聚体的形成
将人工合成的oligo稀释成10uM，按照以下体系混匀，
混匀后放入PCR仪按照以下条件反应，
(1)95℃3min。
(2)95℃到25℃缓慢冷却(每20s降低1℃)，冷却至室温。
(3)16℃5min。
1.3oligo二聚体连接到载体中
按照以下体系，16℃反应2h，分别命名为VK005-12-b1、VK005-12-b2、VK005-12-b3
1.4构建vk005-12-b1b2b3编辑载体
将VK005-12-b1载体用Ascl+Spel酶切，凝胶电泳回收短条带(510bp)，插入到用Ascl+Spe酶切的VK005-012-b2载体中，命名为VK005-012-b1b2，用同样的方法连接b3，命名为VK005-012-b1b2b3
1.5连接产物的转化
将上一步骤中的产物加入到刚复苏的50ulDH5α感受态细胞中，小心混匀，冰浴30min，在42℃的水浴锅中热处理90s，然后冰浴静置2min，加入500ul不含抗生素的液体培养基，在37℃、200rpm的恒温摇床中复苏一小时，然后室温离心6000rpm收集菌体，去除上清，重悬剩余菌体，将菌液涂布于含卡纳抗性的LB琼脂平板上，然后倒置平板于37℃培养过夜(12～16h)。挑取10个单菌落，于相应卡纳抗性液体培养基摇菌进行菌液PCR检测并送测序。
1.6质粒的提取
将测序结果正确的质粒进行摇菌扩繁，质粒提取步骤按照天根生化科技(北京)有限公司质粒提取试剂盒说明书进行，提取后的质粒浓度需要达到1000ng/ul，若浓度不够则利用浓缩仪进行浓缩。
2.聚乙烯亚胺修饰的单壁碳纳米管的制备
按照文献(Carbon nanotube–mediated DNA delivery without transgeneintegration in intact plants)的方法制备(PEI-SWNT)。将1.3mg干燥的COOH-SWNTs加入50ml锥形底离心管中，加入30ml蒸馏水，超声波浴处理获得COOH-SWNT悬浊液，PEI与COOH-SWNTs按照1：20的比例共反应获得PEI-SWNT复合体，将PEI-SWNT复合体转移到100000-MWCO过滤器中。用无核酸酶的水洗涤PEI-SWNT溶液六次，将过量的PEI洗去。
3.DNA加载到PEI-SWNT上并注射到白菜和青花菜叶片当中
准备MES输送缓冲液，以PEI-SWNT：DNA(3:1)的质量比将500ng PEI-SWNTs与167ng质粒DNA复合在一起，首先在100μLMES递送缓冲液中稀释500ng PEI-SWNTs。将稀释的PEI-SWNT添加至167ng质粒溶液中。充分混匀。在室温下孵育30分钟以形成DNA-PEI-SWNT复合物。培养30分钟后，将DNA-PEI-SWNT溶液缓慢吸入1毫升的无针注射器。在白菜叶子背面用吸管针尖刺穿；将DNA-PEI-SWNT复合物缓慢注射进白菜和青花菜的叶片之中。轻拍叶片表面。在叶片上标记入渗区域。待1d后质粒DNA转录为mRNA，2～3d将mRNA翻译为蛋白。
4.观察白菜和青花菜叶片注射部位GFP荧光蛋白的表达情况
注射后的植株转移到光培箱(光周期为白天16h，27℃；夜晚8h，22℃)进行培养。在注射后第三天(约72小时)在激光共聚焦显微镜下观察叶片是否有GFP荧光蛋白的表达。
5.检测白菜和青花菜CRISPR/Cas9系统候选sgRNA基因编辑效率
取不结球白菜和青花菜叶片有GFP荧光表达部位的叶片，用CTAB法提取叶片的基因组DNA，根据编辑位点的基因序列，设计包含编辑位点的引物进行PCR扩增(表2)，引物的序列用NCBI网站设计，引物由擎科生物公司合成。扩增后的PCR片段用胶回收试剂盒纯化回收，连接T载体后，进行大肠杆菌的转化，每个样品挑取6单克隆摇菌后进行菌液PCR然后送公司测序。将测序结果与不结球白菜的基因序列进行比较，检测基因位点是否被编辑，并计算编辑效率。
表2白菜和青花菜编辑位点鉴定引物序列
6.结果与分析
6.1白菜和青花菜叶片GFP荧光表达分析
利用用荧光共聚焦显微镜观察荧光标签的表达情况，白菜和青花菜注射碳纳米管和质粒的复合体后，可以在共聚焦显微镜下观察到绿色的荧光说明GFP蛋白在叶片注射后的第三天已经表达，说明通过此方法可以将外源基因导入到白菜的叶面细胞中并且可以完成外源基因的表达，本次试验共成功注射32个叶片，其中可以观察到荧光的叶片数为7个，占成功注射总数的21.9％。青花成功注射33个叶片中有6个可以观察到荧光，占成功注射总数的18.2％。(见图、图4)
6.2白菜和青花菜CRISPR/Cas9系统候选sgRNA基因编辑结果
提取有GFP荧光蛋白表达的叶片DNA，用表2的引物分别扩增编辑位点附近白菜和青花菜基因组的序列，胶回收PCR产物，然后连接到T载体上，转化到大肠杆菌，挑取单克隆，各挑取24个样，摇菌后送擎科生物有限公司进行测序。不结球白菜24个样品的测序的结果中有3个编号的样品的序列在基因编辑位点附近发生了基因突变，其中第7号和第15号样品是在第1个编辑位点检测到突变，7号样品检测到在PAM位点发生了单碱基的突变，15号样品检测到两个碱基的缺失。第13号样品检测达到在第二个编辑位点检测到单碱基的突变。第三个编辑位点没有检测到基因突变。sgRNA在不结球白菜中的编辑效率为12.5％。青花菜24个样品中有2个样品检测到基因突变，第5号样品在PAM位点检测到三个碱基的缺失，第10号样品检测到单碱基的突变，sgRNA在青花菜中的编辑效率为8.3％。(见图5、图6)
Claims (10)
1.一种白菜或青花菜CRISPR-Cas9基因编辑体系基因编辑效率的鉴定方法，其特征在于包含以下步骤:
(1)利用聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管介导的叶片瞬时转化法将CRISPR-Cas9基因编辑载体转化白菜或青花菜叶片；
(2)注射后的第三天观察叶片GFP荧光蛋白的表达情况,提取有GFP荧光表达的叶片部位的基因组DNA，扩增编辑位点附近的序列测序验证编辑位点附近是否发生基因编辑,从而鉴定CRISPR-Cas9基因编辑体系的基因编辑效率；
其中，所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管介导的叶片瞬时转化法是将聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与带有GFP荧光标签的CRISPR-Cas9基因编辑载体混合，室温孵育形成复合体；当白菜或青花菜幼苗第3片叶片长出时，选择生长健壮的植株作为备选的注射植株,用1ml注射器将所述的复合体注射到白菜或青花菜的叶片细胞中。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒的质量比为2～5：1，孵育时间为30～40min。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于所述的所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒的质量比为3：1，孵育时间为30min。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于选择白菜或青花菜的子叶和真叶进行注射。
5.一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管介导的白菜或青花菜叶片瞬时转化的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管：将干燥的COOH-SWNTs加入蒸馏水，超声波浴处理获得COOH-SWNT悬浊液，PEI与COOH-SWNTs共反应获得聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管PEI-SWNT；
(2)将PEI-SWNT与带有GFP荧光标签的CRISPR-Cas9基因编辑载体结合，室温孵育；
(3)当幼苗第3片叶片长出时，选择生长健壮的白菜或青花菜植株作为备选的注射植株；
(4)用1ml注射器将步骤(2)中的复合体注射到白菜和西兰花的叶片细胞中，注射后的第三天观察叶片GFP荧光蛋白的表达情况。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所用到的碳纳米管COOH-SWNTs的直径为4-5nm，长度为0.5-1.5um。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于COOH-SWNTs与蒸馏水的质量体积比为(20～25)mg：1mL。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒的质量比为2～5：1，孵育时间为30～40min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒的质量比为3：1，孵育时间为30min。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于选择白菜或青花菜的子叶和真叶进行注射。
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