CN110747224B

CN110747224B - 一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统及其应用

Info

Publication number: CN110747224B
Application number: CN201911341789.6A
Authority: CN
Inventors: 崔玉琳; 王康; 任家利; 王寅初; 秦松
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN110747224A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统及其应用。该系统的载体包括启动子、终止子，以及SEQ ID NO:1所示碱基序列的上游同源臂和SEQ ID NO:2所示碱基序列的下游同源臂，同源臂之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列。采用本发明的富脂微拟球藻叶绿体稳定表达系统,可实现多个外源基因在叶绿体中稳定表达。

Description

一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统及其应用。

背景技术

在能够进行光合作用的真核生物细胞中，含有三套相对独立的遗传物质，即细胞核染色体，叶绿体基因组和线粒体基因组。其中细胞核染色体DNA为真核性质的遗传物质，其编码细胞生存所必须的遗传信息。叶绿体和线粒体基因组多为原核性质，编码与细胞器功能相关的遗传信息。进化的角度认为叶绿体和线粒体为真核细胞内吞细菌等原核细胞而来的。叶绿体和线粒体大多依赖细胞核内染色体基因组的功能，有部分细胞器功能的关键蛋白是由染色体编码，在细胞质中翻译为蛋白后导入细胞器的。

三套遗传物质均可独立进行基因工程的操作。染色体基因组遗传信息最为丰富，基因工程的研究最早出现，进展也最为迅速。但是由于染色体基因组的真核性质，其存在一些难以克服的困难，如外源基因插入核基因组效率低，且随机插入，导致不同克隆之间有很大的变异性，因此需要进行广泛的筛选；核基因组结构功能复杂，外源基因的插入有时会造成其它性状的变异；外源基因表达效率低，且表达不稳定；安全稳定性不高，外源基因容易扩散。

1988年，Boynton等通过基因枪法建立了莱茵衣藻的叶绿体转化系统，使人们认识到叶绿体可以作为基因工程中新的转化表达受体。与细胞核转化系统相比，叶绿体转化具有如下优势：原核表达系统、叶绿体基因组定点转化、无基因沉默、外源基因表达效率高且变异小等。

富脂微拟球藻是大眼藻纲、微拟球藻属，是近些年新发现的一种富含脂类的微藻。该藻是一类球形或近似球形的单细胞真核生物，其细胞小（通常２~４μｍ），形态简单，具有很高的光合作用效率、生物量和总脂含量；它的脂肪酸组成主要以C16，C18和C20为主，是生产生物柴油的理想原料，被公认为最具潜力进行商业化生产生物柴油的藻种之一。同时，该藻在生长期含有油脂含量和二十碳五烯酸即EPA很高，生长迅速，能作为鱼类幼体和轮虫的饵料，甚至可成为人类的食品。

富脂微拟球藻的叶绿体基因组已经测序，为叶绿体转化技术的提供了数据支持；同时微拟球藻属近源藻种的细胞核转化技术也为富脂微拟球藻的叶绿体转化方法提供了依据，但目前微拟球藻的叶绿体转化同源插入位点选用了光非依赖型原叶绿素酸脂还原酶（chlL）基因，该基因的突变会影响突变株的扩大培养。截止目前，尚没有富脂微拟球藻叶绿体转化技术的研究，尤其是内源性的可实现稳定遗传的同源重组位点以及调控序列，阻碍了该藻的基础研究进展和应用开发进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统，其包括来源于富脂微拟球藻叶绿体基因组的同源臂、启动子和终止子，重组载体含SEQ ID NO:1 所示碱基序列的上游同源臂和SEQID NO:2所示碱基序列的下游同源臂，同源臂之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列。

所述上下游同源臂间插入选择标记基因。

所述上游同源臂与下游同源臂间插入至少一个启动子和终止子。

所述系统依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列、终止子和下游同源臂。

所述启动子为调控外源基因的启动子；

或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。

所述终止子为调控外源基因的终止子；

或，终止子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的终止子；其中，终止子为SEQ ID NO:6所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:7所示的碱基序列。

所述上游同源臂为SEQ ID NO:1所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:1所示的序列3’端开始，向5’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段；

所述下游同源臂为SEQ ID NO:2所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:2所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段；

所述选择标记基因为草丁膦抗性基因bar基因。

一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统在富脂微拟球藻叶绿体转化中的应用。

具体，利用富脂微拟球藻叶绿体转基因系统将外源基因导入富脂微拟球藻细胞，经培养筛选获得转基因富脂微拟球藻。

所述外源基因为功能蛋白基因、结构性蛋白基因以及营养型蛋白基因等；其中，功能蛋白基因如脂肪酸合成蛋白基因、光合作用相关蛋白基因等，结构性蛋白基因如细胞膜蛋白基因钙调蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等。

本发明所具有的优点：

本发明构建的富脂微拟球藻叶绿体转基因系统，通过本发明能够有效地将多个外源基因重组到富脂微拟球藻的叶绿体基因组中，并通过筛选获得转基因藻株。与现有技术相比，本发明实现了富脂微拟球藻基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：

1.本发明提供了一种不会影响富脂微拟球藻正常生长和功能的叶绿体基因组同源重组位点，实现外源基因的稳定插入、表达和遗传。本发明克服了前期研究以功能基因为重组位点导致的生长限制等弊端，实现了技术上的一大突破。

2.本发明提供高效的富脂微拟球藻内源调控序列，保证外源基因的表达和积累；同时结合富脂微拟球藻叶绿体基因组RBS序列串联多个外源基因构成多顺反子，可实现多个外源基因的共表达。

3. 本发明构建的富脂微拟球藻叶绿体转基因系统可实现外源基因在富脂微拟球藻中的稳定表达，以及多亚基的蛋白复合体的共表达等，提高富脂微拟球藻的蛋白含量，或增加疫苗、渔药等成分。

4. 本发明提供的富脂微拟球藻叶绿体转基因系统可改良微拟球藻的生长、光合性能，进一步提高其光合生长速率，适应规模化培养的需要。

附图说明

图1为本发明实施例提供的富脂微拟球藻叶绿体转基因系统图谱。

图2为本发明实施例提供的富脂微拟球藻叶绿体同源重组表达图谱。

图3为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL2000;泳道wild为野生株；泳道mutants为阳性转基因藻株）。

图4为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL5000;泳道Wild为野生株；泳道mutant为阳性转基因藻株）。

图5为本发明实施例提供的转基因富脂微拟球藻southern杂交图（其中泳道Wild为野生株；泳道mutant为阳性转基因藻株）。

图6为本发明实施例提供的转基因富脂微拟球藻western杂交图（其中泳道Wild为野生株；泳道Mutant为阳性转基因藻株）。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1 富脂微拟球藻叶绿体内源性片段的克隆

设计并合成如下引物：

SEQ1-for：5’-CTAGGAGACTTGAGTATAGTAGG-3’

SEQ1-rev：5’-CTGGGCTATCCTGGACTTGAACCA-3’

SEQ2-for：5’-TGGGGGTATAGCTCAGCTGGTAGAG-3’

SEQ2-rev：5’-TCGGGGAGAACCAGCTAGCTCCGG-3’

SEQ3-for：5’-ATTTTTGTTGTTGACTAAAACAC-3’

SEQ3-rev：5’-AATGAGTACTAGAATAAATAGGG-3’

SEQ4-for：5’-GAACATAAAAGAGGTTTTAAAATTACT-3’

SEQ4-rev：5’-TATAGCAGTAAATTCTCTGGTTCTCG-3’

SEQ5-for：5’-ATAATACATAACAACTAAAACCAA-3’

SEQ5-rev：5’-GTACAATGTGTTAGGTCTTACAAAT-3’

SEQ6-for：5’-GAATATTTAATTACATATGAGTGA-3’

SEQ6-rev：5’-ATTAAATTAACAAAGAAAATCTG-3’

其中引物SEQ1-for和SEQ1-rev的扩增产物是SEQ ID NO:1；引物SEQ2-for和SEQ2-rev的扩增产物是SEQ ID NO:2；引物SEQ3-for和SEQ3-rev的扩增产物是SEQ ID NO:3；引物SEQ4-for和SEQ4-rev的扩增产物是SEQ ID NO:4；引物SEQ5-for和SEQ5-rev的扩增产物是SEQ ID NO:5；引物SEQ6-for和SEQ6-rev的扩增产物是SEQ ID NO:6。

以富脂微拟球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ1-for和SEQ1-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 54℃ 30sec, 72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是富脂微拟球藻叶绿体基因组16S rDNA-trnI序列，约为1030bp，即为片段SEQ ID NO: 1。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化，备用。

以富脂微拟球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ2-for和SEQ2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是富脂微拟球藻叶绿体基因组trnA-23S rDNA序列，约为993bp，即为片段SEQ ID NO: 2。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:2的重组质粒pMD- SEQ2。

以富脂微拟球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ3-for和SEQ3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 52℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是富脂微拟球藻叶绿体基因组psbA promoter序列，为213bp，即为片段SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO: 3的重组质粒pMD-SEQ3。

以富脂微拟球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ4-for和SEQ4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 50℃ 20 sec, 72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是富脂微拟球藻叶绿体基因组rbcL promoter序列，为486bp，即为片段SEQ ID NO: 4。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

以富脂微拟球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ5-for和SEQ5-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 45℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是富脂微拟球藻叶绿体基因组rbcL终止子，为201 bp，即为片段SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:5的重组质粒pMD-SEQ5。

以富脂微拟球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ6-for和SEQ6-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是富脂微拟球藻叶绿体基因组psbA终止子，为194 bp，即为片段SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:6的重组质粒pMD-SEQ6。

实施例2：富脂微拟球藻叶绿体转化空载体的构建

设计并合成如下引物:

bar-for: 5’-ATGAGCCCAGAACGACGCC-3’

bar-rev: 5’-TCATCAAATCTCGGTGACGGG-3’

以载体pSVB为模版，经引物bar-for和bar-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5min预变性;94℃ 1 min, 54℃ 30 sec, 72℃ 40 sec，共35个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为555 bp，即为除草剂抗性基因bar。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有基因bar的重组质粒pMD-bar。

以上述产物为基础，pMD18T为出发载体通过同源重组方法构建富脂微拟球藻叶绿体同源重组载体。其中pMD-SEQ2、pMD-SEQ3、pMD-SEQ5、pMD-SEQ6需要先利用PCR在序列5’端或3’端添加接头和酶切位点，SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、bar无须添加接头或酶切位点。

设计并合成如下引物:

L1-for：5’- TTCAAGTCCAGGATAGCCCAGATTTTTGTTGTTGACTAAAACA-3’

L1-rev：5’- GGCGTCGTTCTGGGCTCATAATGAGTACTAGAATAAATAGGG-3’

L2-for：5’- CCGTCACCGAGATTTGATGAGAATATTTAATTACATATGAGTGA -3’

L2-rev：5’- AGTAATTTTAAAACCTCTTTTAATTAAATTAACAAAGAAAATCTG-3’

L3-for：5’- CGAGCTCGATAATACATAACAACTAAAACCAA-3’

L3-rev：5’- CCAGCTGAGCTATACCCCCAGTACAATGTGTTAGGTCTTACA-3’

L4-for：5’- TGGGGGTATAGCTCAGCTGGTAGAG-3’ (SEQ2-for)

L4-rev：5’- GGAATCCTCGGGGAGAACCAGCTAGCTCCGG-3’

以pMD-SEQ3为模版，经引物L1-for及L1-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min， 52℃ 30 sec， 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为250 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 3-1备用。

以pMD-SEQ6为模版，经引物L2-for及L2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min，55℃ 30 sec，72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为230 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 6-1备用。

以pMD-SEQ5为模版，经引物L3-for及L3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min，45℃ 30 sec，72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为220 bp，即为5’端含SacI酶切位点，3’端含接头的SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 5-1备用。

以pMD-SEQ2为模板，经引物L4-for及L4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min，55℃ 30 sec，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为1000 bp，即为3’端含EcoRI酶切位点的SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 2-1备用。

将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3-1、bar基因片段、SEQID NO: 6-1和SEQ ID NO: 4混合为模板，利用融合PCR试剂盒依次连接并通过TA克隆方法插入pMD18T载体上，命名为pMD18T-1。

将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 2-1、SEQ ID NO: 5-1混合为模板，利用融合PCR试剂盒连接，命名为fragment-2. fragment-2和pMD18T-1经过SacI和EcoRI两个酶酶切后，利用T4连接酶连接，构成富脂微拟球藻叶绿体同源重组空载体，命名为pNg/ch/bar。载体结构见附图1。

1个外源基因或两个以上外源基因通过SEQ ID NO: 7连接后可以通过酶切连接的方式插入pTl/ch/bar载体，从而构建富脂微拟球藻叶绿体表达载体，导入富脂微拟球藻后可实现外源基因在叶绿体中的表达。外源基因可以是功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白如神经肽、抗菌肽基因等。

实施例3 按照上述实施例获得的载体在富脂微拟球藻叶绿体转化中的应用

下面将具有抗菌活性的两个抗菌肽（GenBank No.6K50_A；GenBank No.AKA60777.2）基因插入该载体而后导入富脂微拟球藻中, 通过检测这两个外源基因的表达来检测该载体的性能。

1．表达载体的构建

设计并合成如下引物：

F1-for: 5’-CCTCTAGAATGCATCATCACCATCACCATGGTTTCGGTTGCAACGGTCCCTGG-3’

F1-rev:

TGGTGATGGTGATGGTGCAT AAAATATCTACTCTTAGTAGCACTTGCAGACGAA

F2-for: 5’-ATGCACCATCACCATCACCATTTCTTCTTCCACATCATCAAGGG-3’

F2-rev: 5’-GGGATCCTTACTTCCAGACGAGACCGTGGAT-3’

其中，F1-for携带XbaI酶切位点及6×His标签，F1-rev的下划线序列片段为SEQID NO:7，F2-for中的下划线序列为6×His标签，F2-rev携带BamHI酶切位点。

以人工合成的抗菌肽基因1为模板，经引物F1-for及F1-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃5min延伸。PCR扩增产物约为220 bp，即为5’端含XbaI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F1。

以人工合成的抗菌肽基因2为模板，经引物F2-for及F2-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 52℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃5min延伸。PCR扩增产物约为240 bp，即为3’端含BamHI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F2。

将相同浓度（20-100ng/mL）的F1和F2混合，利用融合PCR试剂盒连接，而后通过XbaI和BamHI酶切连接的方式，将融合片段连接到空载体pNg/ch/bar上。获得的载体经测序验证序列准确，命名为pNg/ch/bar-anti2其载体结构如附图2所示。

2. 富脂微拟球藻的转化

在转化前1h，取对数生长期的富脂微拟球藻藻液，离心力8000 g离心5min，弃上清，用培养液调整浓度到1×10⁹cell ml^-1。然后取0.2 m1藻液涂在固体培养平板的中央，呈直径约2cm的圆形。涂好的平板置于超净工作台中备用。

微粒子弹的制备:取50 ul金粉悬浮液(约含3mg金粉)边涡旋边加入5uL质粒pTl/ch/bar-anti2 (质粒浓度≥1ug ul^-1) , 50ul 2.5M CaCl₂, 20ul 0.1M亚精胺。然后继续涡旋3min。离心5~6 sec，弃上清。然后用250 μL无水乙醇洗两次，最后用60 μL无水乙醇重悬。这样一管包被了质粒的微粒子弹可用于5~6次轰击。

在无菌条件下(超净工作台中)，用高压氦气式基因枪进行轰击。轰击参数压力为450psi，轰击距离为6 cm。

轰击后，藻细胞先在固体培养平板上黑暗条件下培养8h，然后再转到培养液中继续培养40 h，使细胞生长状态得以恢复。

3. 转化后富脂微拟球藻的筛选和鉴定

经过恢复培养的富脂微拟球藻细胞，转到选择性培养液中，以杀死未转化的藻细胞。选择性培养液即为含有15ug ml^-1草丁膦的f/2培养液。15d后将培养液以7000g离心5min，弃上清。收集到的藻体涂布到含有15 ug ml^-1草丁膦固体培养平板上，使抗性的藻细胞分散生长，得到抗性单藻落。约培养10 d后，平板上长出单藻落。再将单藻落挑出，并划线到含有5 ug ml^-1草丁嶙的固体培养平板上，使抗性藻落进一步纯化并增强抗性。10d后，挑取单藻落至培养液中继续培养约20d，8000g离心5min，收集藻体，然后置于液氮中冷冻备用。

提取转基因富脂微拟球藻的基因组总DNA，用以进行分子鉴定。首先用PCR方法来鉴定质粒的整合情况。PCR中使用的上游引物为bar for，下游引物为bar rev，产物为bar基因，反应程序如前所述。在一部分抗性等鞭金藻基因组中扩增到了这个片段，在未转化的等鞭金藻中均未发现该片段，参见附图3。

然后在SEQ ID NO:1 5’端上游和SEQ ID NO:2 3’端下游分别设计并合成引物，引物序列如下：

con-F for: 5’-GGGATGCAAGTGTTATCCGGATTTACTG-3’

con-F rev: 5’-CACTCAGTATTCAGAGTTTGCCTCGA-3’

这对引物con-F for和con-F rev在野生型富脂微拟球藻基因组总DNA中扩增到包括同源臂的片段，长度约为2100 bp；在实现同质化的转基因富脂微拟球藻基因组总DNA中，扩增到同源臂及全部基因表达框的片段，长度约为3700bp.

以阳性转基因藻的全基因组DNA为模板，以引物con-F for和con-F rev进行PCR扩增。PCR反应程序为: 94℃ 1min, 56℃ 30 sec, 72℃ 50 sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR产物经电泳分离有两条带，2100 bp和3700 bp (参见附图4)。经测序，序列与载体序列一致，说明外源基因已插入富脂微拟球藻叶绿体基因组中，但并未实现全质化。

PCR有阳性结果的转基因富脂微拟球藻样品，要继续进行Southern杂交鉴定。以bar、抗菌肽1、抗菌肽2基因PCR产物为模板制备地高辛标记的探针，每个样品的基因组总DNA不少于4ug。利用罗氏的地高辛标记Southern杂交试剂盒进行杂交等过程，结果如附图5所示。这表明在阳性突变株中，外源片段已经稳定插入叶绿体基因组。

Southern杂交有阳性结果的转基因富脂微拟球藻样品，要继续进行western杂交鉴定。Western杂交使用小鼠抗His IgG和羊抗鼠IgG与辣根过氧化物酶(HRP)结合的方法对表达蛋白进行鉴定。杂交结果显示，杂交后出现了一条约18 kDa的条带和11 kDa的条带，与外源基因蛋白大小一致，而未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见图6)，这表明在阳性藻株中，外源蛋白已经表达。

上述实施例表明利用本发明的载体成功实验了两个抗菌肽基因在富脂微拟球藻叶绿体中实现共表达，证明了本发明载体调控外源基因在富脂微拟球藻叶绿体中表达外源基因的能力，可以实现各种蛋白基因的表达，包含功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白如神经肽、抗菌肽基因等。

序列表

SEQ ID NO:1

5’-CTAGGAGACTTGAGTATAGTAGGGGTAGAGGGAATTTCCAGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGAAAGAACACCGATGGCGAAGGCACTCTACTGGGCTATTACTGACACTCAGAGACGAAAGCTAGGGGAGCAAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTCGATGTTGGACGTATCGACCCGTTCAGTATCTTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGTTTGCTAGAAGTGTTGGTTTTCTGAAAAGGATTCCTTATTCCGCTTCTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTTTTAGTTCTATTGTCTAAAAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGAGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACACCCTGGGCTACACACGTCCTACAATGGGTAAGACAATAAGTTGCAAATTCGCGAGGATAAGCTAATCTTTGAAACTTACTCCAAGTACAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGCTGGTCAGCTACACAGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGTTGTACCCGAAGTCGTTATCCTAACCGTGAGGAAGGAGATGCCGAAGGTAAAATTAGTGACCGAGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATGACCTCCTTTAACAAGAATAAGATTAAAAACTTATCTGTAGGTCGATTTGGACCTTTATCGGATTTTACTCCGATTTTAATTAAATAAGGTAGGGCTATTAGCTCAGTTGGTTAGAGCACACCCCTGATAAGGGTGAGGTCCCTGGTTCAAGTCCAGGATAGCCCAG-3’

（a）序列特征：16S rDNA-trnI

●长度：1038 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：富脂微拟球藻叶绿体基因组

SEQ ID NO:2

5’-TGGGGGTATAGCTCAGCTGGTAGAGCGCTGCCCTTGCACGGCAGATGTCAGCGGTTCGAGTCCGCTTACCTCCACACTTATAATCTGGCTACATAATTTTTGTCTTTCGATTCAAGAAAGAAAGGGCTTTTGGGGGATACCTTGGCATTCAGAAGCGATGAAGGACGCGATGACCGGCGATACGCTCCGGGGAGCGGGCAAAAAGCTTTGATCCGGAGGTTTCCGAATGAGGCAACTCCATAGAACTTCTTCCCGAATACATAAGGAAGAAAGAGCGAACCTGGGGAACTGAAACATCTTAGTACCCAGAGGAAAAAAAAGTAAAAACGATTCCCTTAGTAGCGGCGAGCGAACTGGGACCTGGCCTAAACTAACCTCTTGGTTAGGGTTGTGGGACCGATTAGGGGTTAGCCTGTTAGATAGAGAAATATTTACCATGACGAAATAGTTGAATCCTATACCTAAGAAAGTGATAGTCTTGTAGTCAAAGTTAATTCCCTGTCAATAGTGCTAAGCTTGTTTAAGCACTCCTTCGGCTTCCCGAGTAGCATGGAGCACGTGAAATTCCGTGTGAATCCGCAAGGACCACCTTGCAAGGCTAAATATTACTGAATGACCGATAGTGAACCAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGAACCCCGGGAGGGGAGTGAAAAGAACATGAAACCAGAAGCCTACAAGCAGCAGAAGGGCTACGAGTTGTCAAGCCTGACTGCGTGCCTGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTGTATCTAATGGCGGGGTTAAGAATACGAAGCCATAGTGAAAGCGAGCTTGATAACGAGCGCAATGTCATTAGGTACAGACCCGAACCCGGATGATCTAACCATGACCAGGATGAAGCTTAGGTAAAACTAAGTGGAGGTCCGAACTGACTGATGTTGAAAAATCAGCGGATGAGTTGTGGTTAGGGGTGAAATGCCAATCGAATCCGGAGCTAGCTGGTTCTCCCCGA-3’

（a）序列特征：trnA-23S rDNA

●长度：993 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：富脂微拟球藻叶绿体

SEQ ID NO:3

5’-ATTTTTGTTGTTGACTAAAACACTAAAGTATTTAACCCGTAAGATTTATAAAATTATTGTACAATTAATTTAAATAAGACAGCTTTGTAGAAATTCCTGTTATCCCCCCTCATCATACACGAAATATTCATCCTTTGCAAAATAGACTCTTGCAATTAATGCCAGACCTATGATCCTAGGAAGTTTATTTCCCTATTTATTCTAGTACTCATT-3’

（a）序列特征：psbA启动子

●长度：213 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：富脂微拟球藻叶绿体

SEQ ID NO:4

5’-TTTGAACATAAAAGAGGTTTTAAAATTACTTGATTATATTCAGTAATTAAAAGACTTTTATTTATATTGAAAAATTCAAAAAGTTGGTCCAAATTAATTGTATAATTAGTAATATAAACCTCACCATTAATTAAAATCCAAGTTCCCGAATTTGTATAAATTTTTTTTTTCATAAAAGTTCTTTTATTTATATATATAAAAACAAAAAATAATCAATATTTGAAATAATATTTTGACTCAATTAGATTTTTATTTTACTTCATAAATTAATATAAAAATATTAAAATAAATAAAATTGTTGTATATTAAAGAAATCACTCATATAATACTTATATATCTAGAAGAGTTCAAATCAGGGATTTACAGATTAAATATTAATTAATTTTTAATAAAATCTCAAGTTAAATGGGTTTTGCTTTTCAAGTTCGGTTAAATTGCCGAAGGGACCATTTAAAATTTCCGAGAACCAGAGAATTTACTGCTATA-3’

（a）序列特征：rbcL启动子

●长度：486 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：富脂微拟球藻叶绿体

SEQ ID NO:5

5’-TCTATAATACATAACAACTAAAACCAAACAAAACCCACTATTCCATCCTTTACTTGATGAAATAGTGGGTTTAATTTTTTAAATTAATATTAAATTAACAAAGAAAATCTGAATATATAAATTATACAAATGCTACTTTACTTGGAGACTTTAGATTTTTAATGTTTTTTTACAGGATTTGTAAGACCTAACACATTGTAC-3’

（a）序列特征：rbcL 终止子

●长度：201 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：富脂微拟球藻叶绿体

SEQ ID NO:6

5’-GAATATTTAATTACATATGAGTGATTTTTAATCACTCGTATGTAATATTTTTTTAGATTGACTGATAAAAAATATTATGTCGTACAATGTGTTAGGTCTTACAAATCCTGTAAAAAAACATTAAAAATCTAAAGTCTCCAAGTAAAGTAGCATTTGTATAATTTATATATTCAGATTTTCTTTGTTAATTTAAT-3’

（a）序列特征：psbA 终止子

●长度：194 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：富脂微拟球藻叶绿体

SEQ ID NO:7

5’-GAGTAGATATTTT-3’

（a）序列特征：rbs，核糖体结合位点

●长度：13 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：富脂微拟球藻叶绿体。

序列表

<110> 中国科学院烟台海岸带研究所

<120> 一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaggagact tgagtatagt aggggtagag ggaatttcca gtggagcggt gaaatgcgta 60

gatattggaa agaacaccga tggcgaaggc actctactgg gctattactg acactcagag 120

acgaaagcta ggggagcaaa tgggattaga taccccagta gtcctagccg taaacgatgg 180

atactcgatg ttggacgtat cgacccgttc agtatcttag ctaacgcgtt aagtatcccg 240

cctggggagt acgctcgcaa gagtgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 300

gtggaggatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct taccagggtt tgctagaagt 360

gttggttttc tgaaaaggat tccttattcc gcttctacag gtggtgcatg gctgtcgtca 420

gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tttttagttc 480

tattgtctaa aaagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tgaggacgac gtcaagtcat 540

catgcccctt acaccctggg ctacacacgt cctacaatgg gtaagacaat aagttgcaaa 600

ttcgcgagga taagctaatc tttgaaactt actccaagta cagattgcag gctgcaactc 660

gcctgcatga aggtggaatc gctagtaatc gctggtcagc tacacagcgg tgaatccgtt 720

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catggaagct ggttgtaccc gaagtcgtta 780

tcctaaccgt gaggaaggag atgccgaagg taaaattagt gaccgaggtg aagtcgtaac 840

aaggtagccg taccggaagg tgcggctgga tgacctcctt taacaagaat aagattaaaa 900

acttatctgt aggtcgattt ggacctttat cggattttac tccgatttta attaaataag 960

gtagggctat tagctcagtt ggttagagca cacccctgat aagggtgagg tccctggttc 1020

aagtccagga tagcccag 1038

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgggggtata gctcagctgg tagagcgctg cccttgcacg gcagatgtca gcggttcgag 60

tccgcttacc tccacactta taatctggct acataatttt tgtctttcga ttcaagaaag 120

aaagggcttt tgggggatac cttggcattc agaagcgatg aaggacgcga tgaccggcga 180

tacgctccgg ggagcgggca aaaagctttg atccggaggt ttccgaatga ggcaactcca 240

tagaacttct tcccgaatac ataaggaaga aagagcgaac ctggggaact gaaacatctt 300

agtacccaga ggaaaaaaaa gtaaaaacga ttcccttagt agcggcgagc gaactgggac 360

ctggcctaaa ctaacctctt ggttagggtt gtgggaccga ttaggggtta gcctgttaga 420

tagagaaata tttaccatga cgaaatagtt gaatcctata cctaagaaag tgatagtctt 480

gtagtcaaag ttaattccct gtcaatagtg ctaagcttgt ttaagcactc cttcggcttc 540

ccgagtagca tggagcacgt gaaattccgt gtgaatccgc aaggaccacc ttgcaaggct 600

aaatattact gaatgaccga tagtgaacca gtaccgtgag ggaaaggtga aaagaacccc 660

gggaggggag tgaaaagaac atgaaaccag aagcctacaa gcagcagaag ggctacgagt 720

tgtcaagcct gactgcgtgc ctgttgaaga atgagccggc gacttgtatc taatggcggg 780

gttaagaata cgaagccata gtgaaagcga gcttgataac gagcgcaatg tcattaggta 840

cagacccgaa cccggatgat ctaaccatga ccaggatgaa gcttaggtaa aactaagtgg 900

aggtccgaac tgactgatgt tgaaaaatca gcggatgagt tgtggttagg ggtgaaatgc 960

caatcgaatc cggagctagc tggttctccc cga 993

<210> 3

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atttttgttg ttgactaaaa cactaaagta tttaacccgt aagatttata aaattattgt 60

acaattaatt taaataagac agctttgtag aaattcctgt tatcccccct catcatacac 120

gaaatattca tcctttgcaa aatagactct tgcaattaat gccagaccta tgatcctagg 180

aagtttattt ccctatttat tctagtactc att 213

<210> 4

<211> 486

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttgaacata aaagaggttt taaaattact tgattatatt cagtaattaa aagactttta 60

tttatattga aaaattcaaa aagttggtcc aaattaattg tataattagt aatataaacc 120

tcaccattaa ttaaaatcca agttcccgaa tttgtataaa tttttttttt cataaaagtt 180

cttttattta tatatataaa aacaaaaaat aatcaatatt tgaaataata ttttgactca 240

attagatttt tattttactt cataaattaa tataaaaata ttaaaataaa taaaattgtt 300

gtatattaaa gaaatcactc atataatact tatatatcta gaagagttca aatcagggat 360

ttacagatta aatattaatt aatttttaat aaaatctcaa gttaaatggg ttttgctttt 420

caagttcggt taaattgccg aagggaccat ttaaaatttc cgagaaccag agaatttact 480

gctata 486

<210> 5

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctataatac ataacaacta aaaccaaaca aaacccacta ttccatcctt tacttgatga 60

aatagtgggt ttaatttttt aaattaatat taaattaaca aagaaaatct gaatatataa 120

attatacaaa tgctacttta cttggagact ttagattttt aatgtttttt tacaggattt 180

gtaagaccta acacattgta c 201

<210> 6

<211> 194

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaatatttaa ttacatatga gtgattttta atcactcgta tgtaatattt ttttagattg 60

actgataaaa aatattatgt cgtacaatgt gttaggtctt acaaatcctg taaaaaaaca 120

ttaaaaatct aaagtctcca agtaaagtag catttgtata atttatatat tcagattttc 180

tttgttaatt taat 194

<210> 7

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagtagatat ttt 13

Claims

1.一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统，其包括来源于富脂微拟球藻叶绿体基因组的同源臂、启动子和终止子，其特征在于：系统依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列、终止子和下游同源臂；

所述上游同源臂为SEQ ID NO:1所示的碱基序列；

所述下游同源臂为SEQ ID NO:2所示的碱基序列；

所述启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列或SEQ ID NO:4所示的碱基序列；

所述终止子为SEQ ID NO:5所示的碱基序列或SEQ ID NO:6所示的碱基序列；

所述选择标记基因为草丁膦抗性基因bar基因。

2.一种权利要求1所述的富脂微拟球藻叶绿体转基因系统在富脂微拟球藻叶绿体转化中的应用。

3.按权利要求2所述的应用，其特征在于：利用富脂微拟球藻叶绿体转基因系统将外源基因导入富脂微拟球藻细胞，经培养筛选获得转基因富脂微拟球藻。