CN110669787B

CN110669787B - 一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用

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Publication number: CN110669787B
Application number: CN201911224983.6A
Authority: CN
Inventors: 崔玉琳; 王康; 任家利; 秦松
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2039-12-04
Also published as: CN110669787A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用。重组空载体包括上下游同源臂，以及同源臂间设至少一个启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列；其中，上游同源臂含SEQ ID NO:1所示碱基序列，下游同源臂含SEQ ID NO:2所示碱基序列。采用本发明的普通小球藻叶绿体稳定表达系统,可实现多个外源基因在叶绿体中稳定表达。

Description

一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用。

背景技术

小球藻是绿藻门（Chlorphyta）、绿藻纲（Chlorophyceae）、绿球藻目（Chlorococcales）、小球藻科（ChlorellaAceae）、小球藻属（Chlorella ）的一类单细胞微藻。目前世界上已知的小球藻约 10 种，常见的有普通小球藻（Chlorella vulgaris)、小球藻（Chlorella zofingiensis）、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea）和原壳小球藻(Chlorella protothecoides）等。

小球藻是一种单细胞绿藻，其外形呈球形或椭圆形，直径为 3-12 µm，有单个游动细胞，也有聚集成群。小球藻广泛分布于自然界，生长繁殖速度快，是地球上动植物中唯一能20h增长4倍的生物，可以获得较高的细胞密度和生物量；且小球藻易于培养，既能利用光能和 CO₂进行光能自养，又能在利用有机碳源进行异养生长，是作为生物反应器的良好选择。小球藻不同的时期大小和外观颜色变化很大。在显微镜（1000x 油镜）下观察，对数生长期的小球藻个体较小，呈绿色，体内色素主要是叶绿素等进行光合作用的绿色色素；进入稳定期后，细胞个体变大，如果受到外界胁迫，小球藻颜色会变成黄色或者橘红色，细胞内主要色素是玉米黄质、叶黄素和虾青素等类胡萝卜素，保护细胞抵抗外界胁迫。小球藻繁殖为无性生殖，通过原生质体分裂而形成似亲孢子，每数个似亲孢子，母体细胞壁破裂后将孢子释放出来。似亲孢子自由生长形成营养细胞。

小球藻具有重要的商业应用价值，广泛应用在食品、医药、能源，水产养殖等领域。小球藻含有丰富的蛋白质，含量高达 50%-60%，可作为单细胞蛋白的一个重要来源，同时还含人和动物所必需的多种氨基酸、膳食纤维、维生素等营养成分。小球藻还具有低脂肪、低糖、低热量等优点，是一种优质的绿色营养源食品，在食品和保健食品等行业有巨大的经济价值。小球藻还可以作为鱼虾等动物的饲料，广泛应用于水产养殖业。

小球藻又被发现可以积累虾青素，有可能成为继雨生红球藻之后又一种优质的天然虾青素藻源。小球藻中含有小球藻生长因子 COF、多糖和糖蛋白等多种有生物活性的物质，在医药方面对抗肿瘤、增强免疫力抗病毒感染等效果显著。还有报道有些小球藻细胞内油脂和脂溶性化合物含量较高，可用制备生物油。早在 1993 年，美国国家可更新能源实验室(NREL)就制定并已开展了遗传工程改造微藻增加烃产量的计划。

小球藻的基因工程研究起步也较早，在微藻中仅次于莱茵衣藻。目前适用于小球藻的遗传转化方法有电击转化法、基因枪转化法、农杆菌转染法等，都有较高的效率。以新霉素磷酸转移酶基因（NPT Ⅱ）基因为筛选标记基因，利用电击转化法已经建立了小球藻的细胞核稳定转化系统，并且已经得到了广泛的应用。但是小球藻细胞核转化方法存在一些问题，如：核基因组结构功能复杂，难以实现定向重组、定点突变；外源基因表达效率低，且表达不稳定。

叶绿体是小球藻中一个带有相对独立遗传物质的细胞器，小球藻中有且仅有一个大的杯型叶绿体。1988年，Boynton等通过基因枪法建立了莱茵衣藻的叶绿体转化系统，使人们认识到叶绿体可以作为基因工程中新的转化表达受体。与细胞核转化系统相比，叶绿体转化具有如下优势：原核表达系统、叶绿体基因组定点转化、无基因沉默、外源基因表达效率高且变异小等。因此开发小球藻的叶绿体遗传转化系统，对于小球藻的基础研究和应用开发具有重要价值。

目前针对小球藻叶绿体转化体系的研究已有一定的进展。其中一种是以细胞核转化载体将外源基因导入细胞核基因组中，在外源基因的N段添加叶绿体定位的导肽，将外源基因导入叶绿体中行使功能，这是一种间接的叶绿体表达。另外一种是借鉴了莱茵衣藻叶绿体转化的经验，以不影响细胞光合生长的基因（如chlL）为插入位点，以莱茵衣藻的启动子、终止子等为调控元件，建立了小球藻的叶绿体遗传转化载体。但是这种载体以突变一个功能基因为基础，光合作用不受影响，但暗反应受到了影响，转化后获得的小球藻突变株，不能应用于大规划培养；同时，在这种突变株中，外源基因由莱茵衣藻来源的调控元件调控，表达的效率比较低。虽然叶绿体基因组已被测序、并有一些藻株的叶绿体载体构建，但由于藻种间的差异性以及普通小球藻自身的特殊性，其叶绿体表达载体的难点在于内源性元件及其上下游节点的选择，其中同源臂和插入位点，启动子的上游节点是关键，并非显而易见。

发明内容

本发明的目的是提供一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体，重组空载体包括上下游同源臂，以及同源臂间设至少一个启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列；其中，上游同源臂含SEQ ID NO:1 所示碱基序列，下游同源臂含SEQ ID NO:2所示碱基序列。

所述同源臂间插入选择标记基因。

所述重组空载体依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列、终止子和下游同源臂。

所述启动子为调控外源基因的启动子；或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。

所述终止子为调控外源基因的终止子；或，终止子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的终止子；其中，终止子为SEQ ID NO:5所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:6所示的碱基序列。

所述上游同源臂为SEQ ID NO:1所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:1所示的序列3’端开始，向5’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段；

所述下游同源臂为SEQ ID NO:2所示的序列所示碱基序列；或，SEQ ID NO:2所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段。

一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体在普通小球藻叶绿体转化中的应用。

具体，将外源基因导入至所述构建的同源重组空载体再导入普通小球藻细胞，经培养筛选获得转基因普通小球藻。

所述外源基因为功能蛋白基因、结构性蛋白基因以及营养型蛋白基因等；其中，功能蛋白基因如脂肪酸合成蛋白基因、光合作用相关蛋白基因等，结构性蛋白基因如细胞膜蛋白基因钙调蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等。

本发明所具有的优点：

本发明利用了小球藻叶绿体内源的序列构建了能将多个外源基因重组到普通小球藻叶绿体基因组的载体，并获得了表达外源基因的小球藻突变株。与现有技术相比，本发明实现了普通小球藻基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：

1. 本发明提供了普通小球藻叶绿体基因组上的两段序列用作构建普通小球藻叶绿体同源重组载体的同源臂。这两段序列在小球藻叶绿体基因组上是相邻的，该区域没有组装表达其他基因，插入位点位于上下游两个基因之间的非编码区。外源基因插入该位点不影响基因组上任何基因的表达和功能，从而不影响藻细胞的生长。

2. 本发明提供普通小球藻叶绿体基因组上核糖体结合位点，用于在叶绿体表达载体上串联多个外源基因构成多顺反子，可以同时实现多个基因串联表达，有利于获得复合功能的普通小球藻突变株。

3. 本发明提供普通小球藻叶绿体基因组上高效表达基因的启动子和终止子，用于构建小球藻叶绿体表达载体。小球藻内源性的高效调控序列可以提高外源基因的表达，并且在叶绿体内实现大量的积累。

4. 普通小球藻是一种可以进行光合自养、异养的藻种，生长迅速营养价值高，利用本发明在该藻叶绿体中大量积累营养性蛋白质的同时生产虾青素等高附加值产品，可以获得高营养型藻细胞或者高效的生物反应器。

5. 利用本发明可以将多不饱和脂肪酸、虾青素、甾醇、长链烃等合成元件模块化，分别或者同时在小球藻叶绿体中表达，发展小球藻叶绿体合成生物学，促进小球藻的全面开发。

附图说明

图1为本发明实施例提供的普通小球藻叶绿体同源重组空载体图谱。

图2为本发明实施例提供的普通小球藻叶绿体同源重组表达图谱。

图3为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL2000;泳道wild为野生株；泳道mutants为阳性转基因藻株）。

图4为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL5000;泳道wild为野生株；泳道Mutants为阳性转基因藻株）。

图5为本发明实施例提供的转基因普通小球藻southern杂交图（其中泳道W为野生株；泳道M为阳性转基因藻株）。

图6为本发明实施例提供的转基因普通小球藻western杂交图（其中泳道wild为野生株；泳道Mutant为阳性转基因藻株）。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步描述。

实施例1 普通小球藻叶绿体内源性片段的克隆

设计并合成如下引物：

SEQ1-for：5’- caaacattga acctagaat-3’

SEQ1-rev：5’-CACCATGGTGGGCTATGCTGG-3’

SEQ2-for：5’-TTCCATTTTTGGGGAGAAAAGG-3’

SEQ2-rev：5’-TCACCCAAGTTTCATCCTGGT-3’

SEQ3-for：5’-CCGGAAATTGATACAATAGATTTCA-3’

SEQ3-rev：5’-TCCGTGAAAACTTTTGTTTTTCACA-3’

SEQ4-for：5’-ATGAATCTCTTGGAACTATGGTATCA-3’

SEQ4-rev：5’- TCTAATAAAAAGTGTATGGTTTACGAT-3’

SEQ5-for：5’-TTTTTTTTCCTCTCTTAAGCTTCTTAGC-3’

SEQ5-rev：5’-CAGGTCTCTTCCCAAAATTGCG-3’

SEQ6-for：5’-TTCATGTATTCTGTCTATAAAGCTCTC-3’

SEQ6-rev：5’-GAGTACTTGAGAAATAAAGAGG-3’

其中引物SEQ1-for和SEQ1-rev的扩增产物是SEQ ID NO:1；引物SEQ2-for和SEQ2-rev的扩增产物是SEQ ID NO:2；引物SEQ3-for和SEQ3-rev的扩增产物是SEQ ID NO:3；引物SEQ4-for和SEQ4-rev的扩增产物是SEQ ID NO:4；引物SEQ5-for和SEQ5-rev的扩增产物是SEQ ID NO:5；引物SEQ6-for和SEQ6-rev的扩增产物是SEQ ID NO:6。

以普通小球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ1-for和SEQ1-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 56℃ 30sec, 72℃ 1 min，共35个循环；72℃5min延伸。PCR扩增产物是普通小球藻叶绿体基因组16S rDNA-trnI序列，为1092bp，即为片段SEQ ID NO: 1。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

以普通小球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ2-for和SEQ2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 1 min，共35个循环；72℃5min延伸。PCR扩增产物是普通小球藻叶绿体基因组trnA-23S rDNA序列，约为1068 bp，即为片段SEQ ID NO: 2。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:2的重组质粒pMD- SEQ2。

以普通小球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ3-for和SEQ3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 50℃ 30 sec, 72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是普通小球藻叶绿体基因组16S rRNA启动子，为599 bp，即为片段SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO: 3的重组质粒pMD-SEQ3。

以普通小球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ4-for和SEQ4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 50℃ 20 sec, 72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是普通小球藻叶绿体基因组rbcL启动子，为372 bp，即为片段SEQ ID NO: 4。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。

以普通小球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ5-for和SEQ5-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 50℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是普通小球藻叶绿体基因组rbcL终止子，为201 bp，即为片段SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:5的重组质粒pMD-SEQ5。

以普通小球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ6-for和SEQ6-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 50℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是普通小球藻叶绿体基因组psbA终止子，为287 bp，即为片段SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:6的重组质粒pMD-SEQ6。

实施例2：普通小球藻叶绿体转化空载体的构建

设计并合成如下引物:

aadA-for: 5’-ATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCA-3’

aadA-rev: 5’-TTATTTGCCGACTACCTTGGTGATC-3’

以载体pAPEC为模板，经引物aadA-for和aadA-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃5 min预变性;94℃ 1 min, 56℃ 30 sec, 72℃ 1 min，共35个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为906 bp，即为壮观霉素抗性基因。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有基因bar的重组质粒pMD-aadA。

以上述产物为基础，pMD18T为出发载体通过同源重组方法构建普通小球藻叶绿体同源重组载体。其中pMD-SEQ2、pMD-SEQ3、pMD-SEQ5、pMD-SEQ6需要先利用PCR在序列5’端或3’端添加接头和酶切位点，SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、bar无须添加接头或酶切位点。

设计并合成如下引物:

L1-for：5’- CCAGCATAGCCCACCATGGTGCCGGAAATTGATACAATAGAT-3’

L1-rev：5’- CTGCTTGGATGCCCGAGGCAT AAAACATTTTAATTTTCCGGAAATTGATACAATAGATT-3’

L2-for：

5’- CCAAGGTAGTCGGCAAATAATTTTTTTTCCTCTCTTAAGCTTCTTAG -3’

L2-rev：5’- CATAGTTCCAAGAGATTCATCAGGTCTCTTCCCAAAATTGCG -3’

L3-for：5’- CGAGCTCTTCATGTATTCTGTCTATAAAGCTCTC-3’

L3-rev：5’- CCTTTTCTCCCCAAAAATGGAATTCATGTATTCTGTCTATAAAG-3’

L4-for：5’- TTCCATTTTTGGGGAGAAAAGG-3’

L4-rev：5’- GGAATCCTCACCCAAGTTTCATCCTGGT -3’

以pMD-SEQ3为模版，经引物L1-for及L1-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min, 50℃ 30 sec, 72℃ 50 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为640 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 3-1备用。

以pMD-SEQ6为模版，经引物L2-for及L2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min，55℃ 30 sec，72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为270 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 6-1备用。

以pMD-SEQ5为模版，经引物L3-for及L3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min, 40℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为220 bp，即为5’端含SacI酶切位点，3’端含接头的SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 5-1备用。

以pMD-SEQ2为模板，经引物L4-for及L4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min， 55℃ 30 sec，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为1080 bp，即为3’端含EcoRI酶切位点的SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 2-1备用。

将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3-1、aadA基因片段、SEQID NO: 6-1和SEQ ID NO: 4混合为模板，利用融合PCR试剂盒依次连接并通过TA克隆方法插入pMD18T载体上，命名为pMD18T-1。

将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 2-1、SEQ ID NO: 5-1混合为模板，利用融合PCR试剂盒连接，命名为fragment-2. fragment-2和pMD18T-1经过SacI和EcoRI两个酶酶切后，利用T4连接酶连接，构成普通小球藻叶绿体同源重组空载体，命名为pCh/ch/aadA。载体结构见附图1。

1个外源基因或两个以上外源基因通过SEQ ID NO: 7连接后可以通过酶切连接的方式插入pCh/ch/bar载体，从而构建普通小球藻叶绿体表达载体，导入普通小球藻后可实现外源基因在叶绿体中的表达。外源基因可以是功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白基因如神经肽、抗菌肽基因等。

实施例3 按照上述实施例获得的载体在普通小球藻叶绿体转化中的应用

下面将具有抗菌活性的两个抗菌肽基因（GenBank No.6K50_A；GenBank No.AKA60777.2）插入该载体而后导入普通小球藻中, 通过检测这两个外源基因的表达来检测该载体的性能。

1. 表达载体的构建

设计并合成如下引物：

F1-for: 5’-CCTCTAGAATGCATCATCACCATCACCATGGTTTCGGTTGCAACGGTCCCTGG-3’

F1-rev:5’-TGGTGATGGTGATGGTGCAT ATTCTAGGTTCAATGTTTGTTAGTAGCACTTGCAGACGAA-3’

F2-for:

5’-ATGCACCATCACCATCACCATTTCTTCTTCCACATCATCAAGGG-3’

F2-rev: 5’-GGGATCCTTACTTCCAGACGAGACCGTGGAT-3’

其中，F1-for携带XbaI酶切位点及6×His标签，F1-rev的下划线序列片段为SEQID NO:7，F2-for中的下划线序列为6×His标签，F2-rev携带BamHI酶切位点。

以人工合成的抗菌肽基因1为模板，经引物F1-for及F1-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃5min延伸。PCR扩增产物约为220 bp，即为5’端含XbaI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F1。

以人工合成的抗菌肽基因2为模板，经引物F2-for及F2-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 52℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃5min延伸。PCR扩增产物约为240 bp，即为3’端含BamHI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F2。

将相同浓度（20-100ng/mL）的F1和F2混合，利用融合PCR试剂盒连接，而后通过XbaI和BamHI酶切连接的方式，将融合片段连接到空载体pCh/ch/aadA上。获得的载体经测序验证序列准确，命名为pCh/ch/aadA-anti2其载体结构如附图2所示。

2. 普通小球藻的转化

在转化前1h，取对数生长期的普通小球藻藻液，离心力8000 g离心5min，弃上清，用培养液调整浓度到1×10⁹cell ml^-1。然后取0.2 m1藻液涂在固体培养平板的中央，呈直径约2cm的圆形。涂好的平板置于超净工作台中备用。

微粒子弹的制备:取50 ul金粉悬浮液(约含3mg金粉)边涡旋边加入5uL质粒pCh/ch/aadA-anti2 (质粒浓度>=1ug ul^-1) , 50ul 2.5M CaCl₂, 20ul 0.1M亚精胺。然后继续涡旋3min。离心5~6 sec，弃上清。然后用250 μL无水乙醇洗两次，最后用60 μL无水乙醇重悬。这样一管包被了质粒的微粒子弹可用于5~6次轰击。

在无菌条件下(超净工作台中)，用高压氦气式基因枪进行轰击。轰击参数压力为450psi，轰击距离为6 cm。

轰击后，藻细胞先在固体培养平板上黑暗条件下培养8h，然后再转到培养液中继续培养40 h，使细胞生长状态得以恢复。

3. 转化后普通小球藻的筛选和鉴定

经过恢复培养的普通小球藻细胞，转到选择性培养液中，以杀死未转化的藻细胞。选择性培养液即为含有200 ug ml^-1壮观霉素的BG11培养液。15d后将培养液以7000g离心5min，弃上清。收集到的藻体涂布到含有100 ug ml^-1壮观霉素的固体培养平板上，使抗性的藻细胞分散生长，得到抗性单藻落。约培养20 d后，平板上长出单藻落。再将单藻落挑出，并划线到含有100 ug ml^-1壮观霉素的的固体培养平板上，使抗性藻落进一步纯化并增强抗性。20d后，挑取单藻落至培养液中继续培养约20d，8000g离心5min，收集藻体，然后置于液氮中冷冻备用。

提取转基因普通小球藻的基因组总DNA，用以进行分子鉴定。首先用PCR方法来鉴定质粒的整合情况。PCR中使用的上游引物为aadA for，下游引物为aadA rev，产物为aadA基因，反应程序如前所述。在一部分抗性普通小球藻基因组中扩增到了这个片段，在未转化的普通小球藻中均未发现该片段，参见附图3。

然后在SEQ ID NO:1 5’端上游和SEQ ID NO:2 3’端下游分别设计并合成引物，引物序列如下:

con-F for: 5’-CCGGTGGAGCGGTGAAATGC-3’

con-F rev: 5’-GCTAACCACAACTCATCCGCCG-3’

这对引物con-F for和con-F rev在野生型普通小球藻基因组总DNA中扩增到包括同源臂的片段，长度约为2280 bp；在实现同质化的转基因普通小球藻基因组总DNA中，扩增到同源臂及全部基因表达框的片段，长度约为4800bp.

以阳性转基因藻的全基因组DNA为模板，以引物con-F for和con-F rev进行PCR扩增。PCR反应程序为: 94℃ 1min, 56℃ 30 sec, 72℃ 50 sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR产物经电泳分离有两条带，2100 bp和4800 bp (参见附图4)。经测序，序列与载体序列一致，说明外源基因已插入普通小球藻叶绿体基因组中，但并未实现全质化。

PCR有阳性结果的转基因普通小球藻样品，要继续进行Southern杂交鉴定。以aadA、抗菌肽1、抗菌肽2基因PCR产物为模板制备地高辛标记的探针，每个样品的基因组总DNA不少于4ug。利用罗氏的地高辛标记Southern杂交试剂盒进行杂交等过程，结果如附图5所示。这表明在阳性突变株中，外源片段已经稳定插入叶绿体基因组。

Southern杂交有阳性结果的转基因普通小球藻样品，要继续进行western杂交鉴定。Western杂交使用小鼠抗His IgG和羊抗鼠IgG与辣根过氧化物酶(HRP)结合的方法对表达蛋白进行鉴定。杂交结果显示，杂交后出现了一条约28 kDa的条带和16 kDa的条带，与外源基因蛋白大小一致，而未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见图6)，这表明在阳性藻株中，外源蛋白已经表达。

上述实施例表明利用本发明的载体成功实验了两个抗菌肽基因在普通小球藻叶绿体中实现共表达，证明了本发明载体调控外源基因在普通小球藻叶绿体中表达外源基因的能力，可以实现各种蛋白基因的表达，包含功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白如神经肽、抗菌肽基因等。

序列表

SEQ ID NO.1

5’-GCTGGGCCATAACTGACACTGAGAGACGAAAGCGAGGGGAGCAAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTCGCCGTAAACGATGGATACTAGATGTTGGATAGGTTAAATCATTCAGTATCGTAGCTAACGCGTGAAGTATCCCGCCTGGGGAGTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGACTTGACATGCCACTTTTTCCCTGAAAAGGGAAGTTACAGAGTGGACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCTTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTTTGAATTGCCATTCATGGGAAATTCAAAAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCCTGGGCGACACACGTGCTACAATGGCCGGGACAAAGAGATGCAAACCCGCGAGGGCTAGCCAACCTCAAAAACCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCTGGCTATGCCCAAAGTCGTTACCCCAACCGTTTGGAGGGGGACGCCTAAGGCAGGGCTAGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACTGGAAGGTGCGGCTGGAACACCTCCTTTAAAAGGATAAAATCAACTGTGTTTTCAATCTTTTGGTTGCGAAAGGAATCAAAAGACTGCAAACATAGAAAACAAAAATGATCGTTTTTTTCGTTCCAAAAGTACACTTTTGGAACGTGCATTAGTCACTAGCTTACTTTTAATATCAAAGCTTCTAGTTCTTTTCTTTCCAAAAGCACGCTTTTGGAACACAAAGTGTTAGTGTTAGGAAAAGCAACGGGCTATTAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGCTGGTTCAAATCCAGCATAGCCCACCATGGTG-3‘

（a）序列特征：16S rDNA-trnI

●长度：1092 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：小球藻叶绿体基因组

SEQ ID NO.2

5’-TTCCATTTTTGGGGAGAAAAGGGGGTATAGCTCAGTTGGTAGAGCGCTGCCCTTGCAAGGCAGATGTCAGCGGTTCGAGTCCGCTTATCTCCACCAGTGATTGAACATCTGGTAAAAAAAAGTAAGGTAGTGGCTCATGCACGAGTCCTCATTTTTGAGTTAATCCGAAAAAAATGATCTCGTCCCTGATTCGAAACGTTAGTTTTGAAAAAGGAATGAACCATTCTCCAAAAAATTGTATTTTTTGGACAAGTTTCACTTAATTACCAAAAAAACTTTTTGGTACGAAACTGAAACAACAAGGTCAAATGACTTAAGGCGTAGGGTGGATACCTAGGCACCTAGAGACGATGAAGGGCGTGGAACCGACGAAACGCTTCGGGGAGCTGGAAACAAGCAATGATCCGGAGATTCCCGAATAGGGCAACCTCTTGTACTTCTAACTGAATTCATAAGTTAGAAAGAGGCAACTCAGTGAACTGAAACATCTTAGTAGCTGAAGGAAAAGAAAGCAAAAGCGATTCCCTGAGTAGTGGCGAGCGAAATGGGAACAGCCTAAACCAAGTTTTAAACTTGGGGTCGTGGGAAAACATCTGCGTCAAAATTTGCATTTTGACGATAAAACTATTCATAAAAAATTTAGACGAAGCAGCTGAAACCTGCACCATAGATGGTGAAAGTCCAGTAGTTAAAAAATTAAAATGAGTAGCTGTTTATCCCGAGTAGCATGGGACACGTGAAATCCCGTGTGAATCAGCGAGGACCACCTCGTAAGGCTAAATACTCCTAGGTGACCGATAGCGAAATAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGAACCCCTGTAGGGGAGTGAAATAGAACATGAAACCCTATGCTGACAATCAGTGGGAGACACTTGAGTGTTGACCGCGTGCCTGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTAGAAAACGTGGCAAGGTTAAGGACATGTATCCGGAGCCGAAGCAAAAGCAAGTCTGAATAGGGCGATGAAGTCATTTTTTCTAGACCCGAACCCGGGTGATCTAACCATGACCAGGATGAAACTTGGGTGA-3‘

（a）序列特征：trnA-23S rDNA

●长度：1068 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：小球藻叶绿体基因组

SEQ ID NO.3

5’-CCGGAAATTGATACAATAGATTTCATTGATTTCTACTCTGAAAAGAAGTTTCTCTTCACCTCTCTTATAGAGAGAGGCTACTGTACTGCTTTAATTCAACATTTTGCAATAGCAGAACAACATTCCTCTCACTTTAAAGATCCGGAGTTTCAATAACCCCTTTTAGTTCGTACCTGTTATGGTTCAAAAGATGAGGCAGTAATGGCGCCAATTTATCGGTATTATACGAAAGGTGGTGCTTTACTCTTTCATAGAATCATGGAATTAGATGGGTCTTTTTGGTCAACTTTAATTGCAGCAGCAAAATCAACAAATTTGCTAATGTTTAAAGAGGTTCACTTAGCTGCTGATTGTGACAATGACCTTATGAAATATGTGTCACATGCAGTTCAGAAACGTCATTATGAGGCAGGTGGTTTAAAACCGTATGGATAGTATTCTGTGAATGGAAGTAAAAAGGCAGGGACTCTGGGAAAACATTCTTCGAACTTTAAGTCATTTAAAAGCAAGCGATTTGAGGAAGAGAGAGGAAGACTGGTTTGACTTTTTTTTTCTTTCAGGATACATTAGTAAATGTGAAAAACAAAAGTTTTCACGGA-3‘

（a）序列特征：16S rRNA启动子

●长度：599 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：小球藻叶绿体基因组

SEQ ID NO.4

5’-ATGAATCTCTTGGAACTATGGTATCATACATATACATTATGTGTCGATTAGTTAGCGAATTAGGTTTTCATCTGAATCAGTAAAAAACTCTTTTTTTTTCAAAACAACACCGTAGTATTTCAGAATTAGTCCTATCTTTTTAAAGGACTCAAAAAAATGAAAAAAATGGTTTTTGTCTCTTGTGTAAAAATTACGAGTATGCTAGCATAAATTATAAGATCAATTAGTTAAAAAAAACTCTTTTTTTAAGGATTCTCAATTTTCAGTGTAACTGAAATTTTTTAAAAAATTCAAGCAGAAGTAGAGAAAAACACCTTAAACCTTATTTTTCGGGCAGAGTGCAAGATCGTAAACCATACACTTTTTATTAGA-3‘

（a）序列特征：rbcL启动子

●长度：372 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：小球藻叶绿体基因组

SEQ ID NO.5

5’-TTTTTTTTCCTCTCTTAAGCTTCTTAGCTTAAAGCACTGGGTATCCGGTTTCCTTTTCTTTAGGAAAAGGAAACCGGATACTTTTGTCGAAAACATCCGTAATTTCTAAAAAAGAAAGTTATTTTCTTTCTCTGCCCAAAAATGAAATTTTTGTGGTAAAGATTTTTACCAGAACATTTCGCAATTTTGGGAAGAGACCTG-3‘

（a）序列特征：rbcL 终止子

●长度：201 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：小球藻叶绿体基因组

SEQ ID NO.6

5’-TTCATGTATTCTGTCTATAAAGCTCTCATAAAATGAGAGCTTTATTTCAAAAGAAAAGTTTCGATTTCAAAATCGAAACTTTCTAAAAAAAAGAAAAAAGCCTCCCCATCAGAAATTTAAAGGCCTCGTTTTTGAAGAATTCTAACGAGTTTTGACTTGACTGCAATATCTTTTTCTTTGGATTCTAGTGAAATGAGTAGTGTGCAAAAGAAAAAGGTCAAAGGAATTTATTTTTTTCTTGACTCGGATTCAAGTTCCACTGAAGCCTCTTTATTTCTCAAGTACTC-3‘

（a）序列特征：psbA 终止子

●长度：287 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：小球藻叶绿体基因组

SEQ ID NO.7

5’-caaacattgaacctagaat-3‘

（a）序列特征：rbs，核糖体结合位点

●长度：19 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：小球藻叶绿体基因组。

序列表

<110> 中国科学院烟台海岸带研究所

<120> 一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctgggccat aactgacact gagagacgaa agcgagggga gcaaaaggga ttagataccc 60

ctgtagtcct cgccgtaaac gatggatact agatgttgga taggttaaat cattcagtat 120

cgtagctaac gcgtgaagta tcccgcctgg ggagtatgct cgcaagagtg aaactcaaag 180

gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag 240

aaccttacca ggacttgaca tgccactttt tccctgaaaa gggaagttac agagtggaca 300

caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcttgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 360

agcgcaaccc ttgttttgaa ttgccattca tgggaaattc aaaagactgc cggtgacaag 420

ccggaggaag gtgaggatga cgtcaagtca gcatgcccct tacgtcctgg gcgacacacg 480

tgctacaatg gccgggacaa agagatgcaa acccgcgagg gctagccaac ctcaaaaacc 540

cggtctcagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat 600

cgcaggtcag ccatactgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 660

ccatgggagc tggctatgcc caaagtcgtt accccaaccg tttggagggg gacgcctaag 720

gcagggctag tgactggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtactggaag gtgcggctgg 780

aacacctcct ttaaaaggat aaaatcaact gtgttttcaa tcttttggtt gcgaaaggaa 840

tcaaaagact gcaaacatag aaaacaaaaa tgatcgtttt tttcgttcca aaagtacact 900

tttggaacgt gcattagtca ctagcttact tttaatatca aagcttctag ttcttttctt 960

tccaaaagca cgcttttgga acacaaagtg ttagtgttag gaaaagcaac gggctattag 1020

ctcagttggt tagagcgcac ccctgataag ggtgaggtcg ctggttcaaa tccagcatag 1080

cccaccatgg tg 1092

<210> 2

<211> 1068

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttccattttt ggggagaaaa gggggtatag ctcagttggt agagcgctgc ccttgcaagg 60

cagatgtcag cggttcgagt ccgcttatct ccaccagtga ttgaacatct ggtaaaaaaa 120

agtaaggtag tggctcatgc acgagtcctc atttttgagt taatccgaaa aaaatgatct 180

cgtccctgat tcgaaacgtt agttttgaaa aaggaatgaa ccattctcca aaaaattgta 240

ttttttggac aagtttcact taattaccaa aaaaactttt tggtacgaaa ctgaaacaac 300

aaggtcaaat gacttaaggc gtagggtgga tacctaggca cctagagacg atgaagggcg 360

tggaaccgac gaaacgcttc ggggagctgg aaacaagcaa tgatccggag attcccgaat 420

agggcaacct cttgtacttc taactgaatt cataagttag aaagaggcaa ctcagtgaac 480

tgaaacatct tagtagctga aggaaaagaa agcaaaagcg attccctgag tagtggcgag 540

cgaaatggga acagcctaaa ccaagtttta aacttggggt cgtgggaaaa catctgcgtc 600

aaaatttgca ttttgacgat aaaactattc ataaaaaatt tagacgaagc agctgaaacc 660

tgcaccatag atggtgaaag tccagtagtt aaaaaattaa aatgagtagc tgtttatccc 720

gagtagcatg ggacacgtga aatcccgtgt gaatcagcga ggaccacctc gtaaggctaa 780

atactcctag gtgaccgata gcgaaatagt accgtgaggg aaaggtgaaa agaacccctg 840

taggggagtg aaatagaaca tgaaacccta tgctgacaat cagtgggaga cacttgagtg 900

ttgaccgcgt gcctgttgaa gaatgagccg gcgacttaga aaacgtggca aggttaagga 960

catgtatccg gagccgaagc aaaagcaagt ctgaataggg cgatgaagtc attttttcta 1020

gacccgaacc cgggtgatct aaccatgacc aggatgaaac ttgggtga 1068

<210> 3

<211> 599

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaaattg atacaataga tttcattgat ttctactctg aaaagaagtt tctcttcacc 60

tctcttatag agagaggcta ctgtactgct ttaattcaac attttgcaat agcagaacaa 120

cattcctctc actttaaaga tccggagttt caataacccc ttttagttcg tacctgttat 180

ggttcaaaag atgaggcagt aatggcgcca atttatcggt attatacgaa aggtggtgct 240

ttactctttc atagaatcat ggaattagat gggtcttttt ggtcaacttt aattgcagca 300

gcaaaatcaa caaatttgct aatgtttaaa gaggttcact tagctgctga ttgtgacaat 360

gaccttatga aatatgtgtc acatgcagtt cagaaacgtc attatgaggc aggtggttta 420

aaaccgtatg gatagtattc tgtgaatgga agtaaaaagg cagggactct gggaaaacat 480

tcttcgaact ttaagtcatt taaaagcaag cgatttgagg aagagagagg aagactggtt 540

tgactttttt tttctttcag gatacattag taaatgtgaa aaacaaaagt tttcacgga 599

<210> 4

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaatctct tggaactatg gtatcataca tatacattat gtgtcgatta gttagcgaat 60

taggttttca tctgaatcag taaaaaactc tttttttttc aaaacaacac cgtagtattt 120

cagaattagt cctatctttt taaaggactc aaaaaaatga aaaaaatggt ttttgtctct 180

tgtgtaaaaa ttacgagtat gctagcataa attataagat caattagtta aaaaaaactc 240

tttttttaag gattctcaat tttcagtgta actgaaattt tttaaaaaat tcaagcagaa 300

gtagagaaaa acaccttaaa ccttattttt cgggcagagt gcaagatcgt aaaccataca 360

ctttttatta ga 372

<210> 5

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttttttttcc tctcttaagc ttcttagctt aaagcactgg gtatccggtt tccttttctt 60

taggaaaagg aaaccggata cttttgtcga aaacatccgt aatttctaaa aaagaaagtt 120

attttctttc tctgcccaaa aatgaaattt ttgtggtaaa gatttttacc agaacatttc 180

gcaattttgg gaagagacct g 201

<210> 6

<211> 287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcatgtatt ctgtctataa agctctcata aaatgagagc tttatttcaa aagaaaagtt 60

tcgatttcaa aatcgaaact ttctaaaaaa aagaaaaaag cctccccatc agaaatttaa 120

aggcctcgtt tttgaagaat tctaacgagt tttgacttga ctgcaatatc tttttctttg 180

gattctagtg aaatgagtag tgtgcaaaag aaaaaggtca aaggaattta tttttttctt 240

gactcggatt caagttccac tgaagcctct ttatttctca agtactc 287

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaacattga acctagaat 19

Claims

1.一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：重组空载体包括上下游同源臂，以及同源臂间设至少一个启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列；其中，上游同源臂为SEQ ID NO:1所示碱基序列，下游同源臂为SEQ ID NO:2所示碱基序列。

2.按权利要求1所述的普通小球藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述同源臂间插入选择标记基因。

3.按权利要求1或2所述的普通小球藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述重组空载体依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列、终止子和下游同源臂。

4.按权利要求3所述的普通小球藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述启动子为调控外源基因的启动子；或，启动子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。

5.按权利要求3所述的普通小球藻叶绿体同源重组空载体，其特征在于：所述终止子为调控外源基因的终止子；或，终止子为调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的终止子；其中，终止子为SEQ ID NO:5所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:6所示的碱基序列。

6.一种权利要求1所述的普通小球藻叶绿体同源重组空载体在普通小球藻叶绿体转化中的应用。

7.按权利要求6所述的应用，其特征在于：将外源基因导入至构建的同源重组空载体再导入普通小球藻细胞，经培养筛选获得转基因普通小球藻。