CN102533844A - 含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体及其应用。所述转基因表达载体包括：5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因的表达盒，玉米叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶基因的表达盒位于同源重组片段atpB和rbcL之间。本发明还提供了该叶绿体转基因表达载体的构建方法。本发明进一步提供了该叶绿体转基因表达载体在提高玉米草甘膦抗性中的应用，包括：将所述的表达载体转化玉米愈伤组织或细胞，筛选得到抗性愈伤组织或细胞；诱导抗性愈伤组织或细胞分化，再生获得玉米抗性植株。本发明可显著提高玉米的草甘膦抗性，具有生物安全性高、省时高效、能耗少、成本低等诸多优点。

Description

含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种叶绿体表达载体，尤其涉及一种含EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因玉米叶绿体表达载体及其构建方法，本发明还涉及该EPSP合酶基因玉米叶绿体表达载体在提高玉米草甘膦抗性中的应用，属于玉米抗草甘膦转基因工程领域。

背景技术

1988年Boynton等首次利用基因枪法将带有atpB野生型基因的叶绿体DNA轰击了atpB突变的衣藻，使其恢复了光合作用的能力，从而标志着叶绿体基因工程的开始。1900年首次利用基因枪法将rrn16基因在烟草叶绿体中得到表达，拉开了高等植物叶绿转化的帷幕。水稻、玉米及小麦等禾本科植物是重要的粮食作物，但是叶绿体转化技术在禾本科植物的应用进展却很缓慢。2006年，Lee等首次将GFP和aadA基因成功重组到水稻(Oryza sativa)叶绿体基因组中，为叶绿体转化技术在禾本科植物中的应用奠定了基础(Lee，S.M.，et al.，Plastid transformation in the monocotyledonous cereal crop，rice(Oryza sativa)and transnmission of transgenes to their progeny.Mol Cells，2006.21(3)：401-410.)。李轶女等(李轶女等.水稻叶绿体表达体系的建立及抗PPT叶绿体转化植株的获得.中国农业科学，2007.40(9)：1849-1855.)选择ndhF与trnL的基因间序列作为除草剂PPT抗性基因bar定点整合的位点，将bar基因重组到水稻叶绿体基因中，bar基因在水稻基因组中正常的表达，既提高了水稻抗PPT的能力，又可以作为转化的筛选标记。Cui等利用基因枪法将GFP和npt II基因转化小麦未成熟盾片和花序，培养获得了转化植株，为叶绿体转化技术成功的应用到禾本科植物培育新的品种奠定了基础(Cui，C.，et al.，Stable chloroplast transformation of immature scutella andinfiorescences in wheat(Triticum aestivum L.).Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai).43(4)：p.284-91.)。

叶绿体转化的表达效率高且外源基因可以定点整合，显花植物每个叶肉细胞含有约100个叶绿体，每个叶绿体含有约100个叶绿体基因组拷贝，如果完全同质化并有强启动子存在，外源基因可以得到高效的表达，同时叶绿体对外源基因的表达有很强的承受能力。叶绿体可以直接表达来自原核的基因；叶绿体基因组具有原核性，叶绿体基因组多顺反子转录、基因排列、调控方式、密码子的偏爱性等与原核性很相似。叶绿体的原核性利于原核来源基因的表达。但是真核基因在叶绿体基因中也能很好的表达。多基因可以同时转化，提高转化效率；叶绿体基因组具有重叠基因，是以多顺反子为转录单位，产生多顺反子mRNA来合成蛋白质，所以由一个启动子引导下的多个外源基因可以同时在叶绿体中表达，可实现多个基因的同时表达，多个外源基因可以同时进行表达，而不相互影响，避免因多个相同的启动子调控多个基因在表达时产生基因沉默现象。叶绿体转化没有载体序列，位置效应和多效应；属于母性遗传，后代材料稳定；安全性高。叶绿体是母系遗传，外源基因不会随花粉传播，造成基因漂移。

草甘膦是一种高效、广谱、低残留、低毒、易被微生物分解和内吸传导的非选择性的除草剂，被广泛的应用于农业，其对大多数植物具有灭生性。由于草甘膦使用容易、高效、价格便宜，各国不断增加草甘膦的生产量满足日益增加的需求。转基因的抗草甘膦作物大面积推广给农民提供了草甘膦使用的新领域。1996年孟山都公司开发的抗草甘膦大豆GTS40-3-2首次销售，到目前为止已经有超过1000个商业化的抗草甘膦大豆品种。

迄今为止，抗草甘膦的大豆、棉花、玉米、花生、烟草、甜菜等作物得到了推广。2003年全世界抗草甘膦大豆种植面积大于0.41亿hm²，其它抗除草剂的作物也大量的推广，主要是抗草甘膦品种。从已经推广的抗草甘膦作物来看，主要是美国的孟山都公司开发，转入的基因是CP4EPSPS基因。孟山都将抗草甘膦作物种子与农达除草剂捆绑式销售，已经形成了独霸的局面。虽然从微生物、植物等克隆出了一些抗除草剂的EPSPS基因，也获得了相应的转基因植物，但是很少能达到推广的水平。

目前中国国内还没有出现广泛推广的抗草甘膦的新品种。

叶绿体转化体系具有表达效率高且外源基因可以定点整合，无论是真核还是原核的外源基因都可以在叶绿体中高效的表达，尤其是叶绿体属于母系遗传，后代材料稳定，安全性高，外源基因不会随花粉传播，造成基因漂移等优势，所以受到愈来愈多的重视。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体；

本发明的目的之二是提供一种构建所述含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体的方法；

本发明的目的之三是将所构建的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体应用于提高玉米的草甘膦抗性。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，该含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体包括：EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)编码基因的表达盒，玉米叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶编码基因的表达盒位于同源重组片段atpB和rbcL之间。

所述的EPSP合酶基因是公开号为CN101429499A(发明名称：高耐受草甘膦的EPSP合酶及其编码序列)中所述的编码EPSP合酶的编码基因，该基因序列已在该专利文献(CN101429499A)中全部公开(注：EPSP合酶基因为CN101429499A序列表中的SEQIDNO：2或SEQID NO：3所示的核苷酸序列)。

所述的EPSP合酶基因的表达盒由启动子、EPSP合酶基因和终止子组成；将EPSP合酶基因置于所述玉米叶绿体特异启动子和终止子的调控之下，即得到本发明所述的EPSP合酶基因的表达盒。其中，所述的启动子是玉米叶绿体特异启动子，例如，可以是prrn、atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL等启动子，优选的，所述的启动子为prrn启动子，本发明进一步地将prrn启动子序列进行了优化，将一段含有SD序列的序列(GGGAGG)引入prrn启动子的3’端，提高prrn启动子与核糖体的结合能力，从而提高下游基因的翻译水平，所得到的启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述的终止子优选为psbA终止子，其核苷酸序列为SEQID NO：2所示。

所述的同源重组片段atpB的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

所述的同源重组片段rbcL的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

为了达到更好的效果，所述的EPSP合酶基因玉米叶绿体表达载体中还可含有显性选择标记基因的叶绿体基因表达盒；该显性选择标记基因优选为细菌来源的抗菌素抗性基因，更优选为抗潮霉素基因(HPT)，其核酸序列为SEQ ID No.5所示；作为本发明的一个优选的具体实施方案，可以将抗潮霉素基因插入到玉米叶绿体基因组的16srRNA启动子和psbA终止子之间构建得到抗潮霉素的叶绿体基因表达盒。

本发明另一方面是提供了一种构建所述EPSP合酶基因玉米叶绿体表达载体的方法，该方法包括以下步骤：

(1)、将EPSP合酶编码基因可操作的与玉米叶绿体特异启动子和终止子相连接，使EPSP合酶编码基因置于玉米叶绿体特异启动子和终止子的调控之下，得到EPSP合酶编码基因的表达盒；

(2)、将玉米叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及rbcL分别连接在EPSP合酶编码基因的表达盒的两侧，即得。

本发明EPSP合酶基因玉米叶绿体表达载体构建的一个优选实施方案，包括：将EPSP合酶编码基因克隆到pSK-prrn-T载体的EindIII和XbaI之间，使EPSP合酶基因片段置于玉米叶绿体基因特异启动子Prrn和PsbA终止子调控之下得到质粒pSK-prrn-A15N-T；将抗潮霉素基因表达盒插入质粒pSK-prrn-A15N-T的Sa1I和KpnI之间构建pSK-prrn-A15N-T-hpt。再将两个表达盒克隆入含有同源重组片段atpB-rbcL的pBR质粒BamH I位点，构建得到EPSPSA15N玉米叶绿体表达载体pBR-PTN-hpt；将pBR-PTN-hpt用基因枪法转化玉米愈伤组织，筛选得到转化有EPSPSA15N基因的玉米抗性愈伤组织，诱导玉米抗性愈伤组织再生获得转基因玉米植株。更进一步的，本发明将所构建的EPSP合酶基因玉米叶绿体表达载体转化玉米愈伤组织、细胞或原生质体，以提高玉米的草甘膦抗性。

为达上述目的，可以将构建的EPSP合酶编码基因玉米叶绿体表达载体转化玉米，筛选得到玉米抗性愈伤组织、细胞或原生质体；诱导抗性愈伤或细胞分化，再生获得抗性植株，即得。

所述“转化”是将EPSP合酶编码基因导入到玉米愈伤组织或细胞，再采用本领域熟知的细胞或组织培养方法，诱导转化的玉米愈伤组织或细胞再生得到完整植株。所述的“转化”方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、基因枪法以及高速弹道轰击等，优选为基因枪法。

采用常规方法可使已转化的玉米愈伤组织、细胞再生获得稳定的转化植株(McCormick et al.Plant Cell Reports.1986.5：81-84)。

所述的玉米品系优选为综31或综3。

本发明采用基因同源重组技术，将来源于斯氏假单胞菌的EPSP合酶编码基因构建到由玉米叶绿体特异启动子prrn和psbA终止子组合所驱动的表达盒，利用玉米叶绿体基因组中的atpB-rbcL作为同源片段，发生同源重组，通过基因枪转化法导入玉米叶绿体中，通过PCR分子生物学手段检测，最终获得转基因玉米，EPSP合酶编码基因在玉米叶绿体中得到成功表达，试验证实，所获得的转基因玉米植株具有较强的草甘膦抗性。

本发明利用玉米叶绿体表达系统获得抗草甘膦转基因水稻，具有以下优点：第一，玉米叶绿体能够高效的表达外源基因，植株可以获得良好的抗性；第二，生物安全性高，由于叶绿体是母系遗传，发生基因漂移的可能性极低；第三，外源基因能定点整合在玉米叶绿体基因组上；第四，外源基因在后代中可稳定表达；第五，玉米叶绿体基因组具有分子量小、结构简单、不结合组蛋白等特点有利于实现分子操作。

本发明采用玉米叶绿体表达系统获得抗草甘膦转基因玉米，获得的转基因玉米具有优异的草甘膦抗性。本发明获得的转基因玉米与原核转化相比：外源基因定点插入到玉米叶绿体基因组中，无性状分离，易于检测，省时高效；外源基因在叶绿体中高效的表达，获得转基因植株具有良好的抗性；生物安全性极高，外源基因发生漂移的可能性极低。

总体而言，本发明可以显著提高转基因玉米的草甘膦抗性，具有生物安全性高、省时高效、能耗少、成本低等诸多优点。

附图说明

图1转基因玉米A15N的PCR检测结果；M：DL2000；1，2，3，4：为转基因样品；5：野生型对照。

图2叶绿体转基因玉米同质化程度的PCR检测结果；M：DL2000；1，2，3：转基因样品；4：野生型对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

1.E.coli TOP10购自Promega公司；玉米综31、综3春夏种植于中国农科院廊坊实验基地，冬季种植于中国农科院海南岛实验基地。

2.酶与试剂：各种限制性内切酶、T₄DNA连接酶、Klenow酶及其配套缓冲液购自Promega公司；检测所用的所有二抗抗体均购自Sigma公司；

3.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；植物培养基为N6和MS培养基；

实施例1、EPSP合酶基因的获得、表达载体的构建和转化、转基因玉米的鉴定。

1、玉米叶绿体基因组的提取：

(1)将5-10g玉米叶片去除叶脉，将叶片剪碎，液氮研磨；

(2)加入5倍体积4℃预冰冷的buffer A(buffer A：50mM Tris-HCl，20mMEDTA，0.5M蔗糖，0.25M Vc，pH3.5)，匀浆用8层医用纱布过滤滤液至预冷的50mL离心管中，弃残渣；

(3)滤液1500g/min，15min离心，弃上清，留沉淀；

(4)向沉淀中加入3mL bufferA，充分悬浮，转入10mL离心管中；

(5)2000g/min，15min离心，弃上清，收集沉淀；

(6)加入2mL bufferB，充分悬浮(buffer B：50mM Tris-HCl，20mM EDTA，0.5M蔗糖，1％BSA，7mM β-巯基乙醇现用现加)；

(7)1500g/min，离心10min，弃上清，收集沉淀，再用buffer B洗一次；

(8)同上离心，弃上清，再加buffer C，洗一次，离心，沉淀大部分为叶绿体(bufferC：50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA，0.5M蔗糖)；

(9)叶绿体沉淀悬浮于3mL bufferD(50mM Tris-HCl，20mM EDTA)中，加入2mL裂解液(50mM Tris-HCl，20mM EDTA，10％N-lauroylsarcosine)，37保温15min后，加蛋白酶K至100μg/mL继续37℃，保温4h；

(10)用等体积酚，氯仿抽提。加入3M NaAC至0.3M，两倍体积的无水乙醇，-20沉淀过夜；

(11)离心，沉淀凉至半干，溶于50μLTER(加有RNase的TE)中；

2EPSP合酶编码基因的克隆和叶绿体表达载体的构建

2.1目的基因的获得

根据已知的EPSP合酶编码基因序列，分别设计引物，并且分别引入HindIII位点和XbaI位点，两对引物如下：

A15FP1：GAAGCTTATGCATTCCAATGACCTCG    HindIII

A15RP1：GTCTAGATCATGAGGCGCCCTC        XbaI

在0.5mL eppendorf管中加入

反应程序：

2.2抗潮霉素基因(HPT)的克隆

根据已知的质粒pSELECT-hygro-mcs(InvivoGen，货号：pseth-mcs)中HPT基因序列设计引物，并且分别引入HindIII位点和XbaI位点，两对引物如下：

HPTFP：CAAGCTTATGCAAAAGCCTGAACTCACCG HindIII

HPTRP：CTCTAGACTACTCTATTCCTTTGCCCTC  XbaI

PCR程序同上述2.1步骤中的PCR程序。

2.3PCR产物的回收

用普通凝胶进行电泳，切下所需DNA条带，称重后放入Eppendorf管中，加入3倍体积(v/w)的6mol/L NaI溶液，37℃下使凝胶充分溶解，再加入10μL玻璃奶吸附DNA，室温下放置5min，稍离心5s，去上清，沉淀用New Wash洗液洗涤一次，重复离心、洗涤三次，晾干后用30μL 0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后取上清，将DNA保存于-20℃备用。

2.4T载体的连接反应

回收的PCR产物2.5μL、pMD18-T 0.5μL和soul I 3μL混匀后，16℃反应2h。

2.5质粒DNA或连接产物的转化

取-70℃冻存的感受态细胞，用双手搓至大部分融化后迅速置冰上。感受态细胞完全融化后加入质粒DNA20～100ng或连接混合物5μL，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90sec，迅速置冰上1～2min。加入1mL LB培养基，37℃振荡(≤150rpm)培养1h。4,000g离心5min，去部分上清后(留150～200μL)涂布于含适当抗生素的LB平板上。37℃倒置培养过夜。

2.6碱裂解法提取质粒DNA

2.7重组子的鉴定

酶切鉴定：首先小量抽提质粒DNA，然后利用HindIII和xbaI进行酶切反应，电泳后出现约1.3kb的DNA条带的质粒为重组质粒T-A15N。将重组质粒T-A15N进行测序。测序结果与预期结果一致。

3.玉米叶绿体表达载体的构建

3.1玉米叶绿体同源载体pBR的构建

3.1.1同源片段的获得

根据已知的玉米叶绿体基因组序列分别设计引物如下：

MAtpBFP：CAAGCTTCTTGGAAGCTAATCCTCTGG   HindIII

MAtpBRP：CGGATCCGAATCTAAATACCTAAATACTAAG  BamH I

MRbcLFP：CGGATCCGATTAGGGTTTGGGTTGCGC    BamH I

MRbcLRP：GTCTAGA GTTACGAGCTTGTACACAGG Xba I

在0.5mL eppendorf管中加入

反应程序：

回收大小正确的PCR扩增片段，将上述两个基因片段atpB，rbcL分别连接到T载体进行测序鉴定，结果与预期完全一致。

3.1.2载体的构建

用HindIII和BamH I酶切克隆的atpB基因片段的T载体，回收1.45kb的片段，将该片段克隆到载体pBluescript SK(Biovector Co.，LTD；货号：Biovector008)的HindIII和BamH I位点之间，构建载体pSK-atpB。然后用BamH I和Xba I酶切克隆的rbcL基因片段的T载体，回收1.6kb的DNA片段，将该片段克隆到载体pSK-atpB的BamH I和Xba I位点之间，获得含有玉米叶绿体同源片段atpB-rbcL基因片段的载体pBR。

3.2玉米叶绿体16srRNA启动子和psbA终止子的克隆

本实验将一段含有SD序列的序列(GGGAGG)引入16SrRNA启动子的3’端，提高16SrRNA启动子与核糖体的结合能力，从而提高下游基因的翻译水平。

根据玉米叶绿体基因序列，设计引物如下：

MPrrnFP：CGTCGACATGTGCTATGGCTCGAATC    Sal I

MPrrnRP：GAGGAGAAAAACCTCTAGAGATCTGAAGCTTCCCTCCCTACTTCAT

AGTTGCAT XbaI HindIII

MTpsbAFP：GATGCAACTATGAAGTAGGGAGGGAAGCTTCAGATCTCTAGAGG

TTTTTCTCCT  HindIII  Xba I

MTpsbARP：CGGATCCATACCTCGATCGAGATAGTGGAC  BamH I

在0.5mL eppendorf管中加入

反应程序：

用pfu酶分别扩增prrn和TpsbA两段序列，以这两段序列为模板，利用prrnFP、TpsbARP为引物，进行PCR扩增。回收大小正确的PCR扩增片段，连接到pMD18Tsimple载体进行测序鉴定，结果与预期完全一致。

3.3EPSP合酶编码基因表达盒的构建

3.3.1EPSP合酶编码基因的插入

用HindIII、Xba I酶切测序正确的阳性重组质粒T-A15N，回收约1.3kb的酶切产物。将回收的EPSP合酶编码基因连接到玉米叶绿体特异启动子prrn和终止子TpsbA调控之下，得到质粒T-prrn-A15N-T；用Sal I、BamH I酶切质粒T-prrn-A15N-T，回收约2.0kb的片段，将回收片段连接到pSK的Sal I、BamH I位点，构建出pSK-prrn-A15N-T载体。

3.3.2筛选标记表达盒的构建

用HindIII、Xba I将克隆的抗潮霉素的目的基因(HPT)插入到玉米叶绿体基因组的16srRNA启动子和psbA终止子之间构建出抗潮霉素的叶绿体基因表达盒。重新设计引物PcoreFP、PcoreRP改变潮霉素表达盒两端的酶切位点，然后连接到pMD18T载体上进行测序。

设计引物如下：

PcoreFP：CGTCGACATGTGCTATGGCTCGAATC          Sal I

PcoreRP：CGGTACCGGATCCATACCTCGATCGAGATAGTGG  Kpn I BamH I

3.3.3叶绿体表达载体的构建

用Sal I、Kpn I酶切构建在上述pMD18T载体的抗潮霉素表达盒，回收约2.0kb的目的片段，将回收的片段连接到pSK-prrn-A15N-T的Sal I、Kpn I位点，构建出pSK-PTN-hpt载体。再用BamHI进行酶切，回收含有EPSP合酶编码基因和抗潮霉素基因的表达盒的约4.2kbDNA片段，将其克隆入具有同源重组片段aptB-rbcL的pBR质粒BamH I位点，构建成具有EPSP合酶基因表达盒的玉米叶绿体表达载体pBR-PTN-hpt。

3.4玉米幼胚的分离及愈伤组织的诱导

(1)将玉米综31、综3分期夏天播种或冬天种植于南方(例如海南岛)。

(2)抽雄开花期进行自交，并记录授粉日期。

(3)授粉后14天左右，根据幼胚的生长速度来确定取材时间，当幼胚长到1-1.5mm时取幼穗，剥去苞叶，在超净台上先用70％酒精消毒2min，再用10％的次氯酸钠消毒10-15min，用高温灭菌水清洗3次，每次10min左右。经表面消毒后削去子粒的一部分，取出幼胚，将幼胚盾片朝上，接种于诱导培养基上，每培养皿接种20-30个幼胚。28℃暗培养1周左右去芽，经2-3周，愈伤组织逐渐产生。分离出愈伤组织，在同样的培养基上继代培养。

4.基因枪转化

4.1受体细胞的准备

(1)愈伤组织

取生长旺盛的胚性愈伤组织，切成直径为3-4mm的小块，接种在培养皿的N6高渗培养基(0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇)的中央上，4h后轰击转化。

(2)幼胚

将幼胚剥离后，接种到诱导培养基上培养3-4天，启动愈伤组织的诱导，然后作同样高渗处理用于轰击。

4.2微粒子弹(DNA coated microprojectiles)的制备

称60mg 1.0μm的金粉(Bio-Rad)于1.5mL Eppendorf管中；加入1mL无水乙醇，充分涡旋(vortex)，然后静置10min，10,000rpm离心10sec；小心去除上清液，加入1mL无菌水，充分涡旋，10,000rpm离心10sec，弃上清液；重复用无菌水洗涤2次；用1mL无菌的50％(v/v)甘油重悬金粉颗粒。处理后的金粉可在-20℃长期保存；

取50μL上述制备好并已涡旋的金粉颗粒，转入一无菌的1.5mL eppendorf管中，按顺序加入5μL DNA(1μg/μL)、50μL 2.5mol/L CaCl₂和20μL 0.1mol/L亚精胺(Free base，现配现用)；将混合物涡旋1min，置于冰上1min；重复10次；置于冰上30min以上；15,000rpm离心5sec，去除上清液；用250μL无水乙醇洗涤包被好的金粉颗粒2次，10,000rpm离心10sec，去除上清液；60μL无水乙醇重悬金粉颗粒。

4.3装备基因枪

(1)基因枪的准备

将基因枪放置于一个较大型号的超净工作台上，打开超净台紫外灯灭菌30min以上；用70％酒精擦净基因枪真空室及各种元件；用浸泡消毒法将可裂膜(Rupturedisk 1，100psi)、载体膜(Macrocarrier)、阻挡网(Stopping screen)及Macrocarrierholders于无水乙醇中消毒15min，然后将Rupture disk和Macrocarrier置于无菌滤纸上，在超净台中吹干；用镊子夹住Macrocarrier holder，在酒精灯火焰上稍事灼烧后置于无菌滤纸上；待Macrocarrier holder冷却后，用镊子将Macrocarrier置于其中并展平。取10μL包被DNA的金粉颗粒无水乙醇悬浮液，点于Macrocarrier中心位置，于超净工作台中吹干；打开电源开关、真空泵及氦气瓶阀门；取出Macrocarrierlaunch assembly，拧开盖子，将Stopping screen在酒精灯火焰上灼烧后置于凹槽内，把Macrocarrier holder倒扣于凹槽上，旋紧盖子；将Rupture disk装于固定盖中并旋紧；将组装好的Macrocarrier launch assembly置于基因枪真空室的上数第二个格子中；将装有衣藻培养基的培养皿置于Target shelf中心，并将Target shelf置于真空室的上数第四个格子中，使轰击距离为9cm；关紧真空室小门。

(2)轰击

抽真空：按VAC键，当真空度达到25～28inches Hg时，将VAC键直接锁定在HOLD位置；轰击：按住FIRE键，直至Rupture disk爆裂；再按VENT键，使真空表指针回零。打开真空室小门，取出样品。通常每个样品轰击2次。

5转基因玉米愈伤组织的筛选

(1)过渡培养

将轰击后的样品置于含有渗透剂(0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇)的N6继代培养基中继续处理16h，然后转入不含任何其它成分的N6继代培养基中过渡培养5～7天。过渡培养有利于受轰击细胞的恢复及外源基因的充分表达。

(2)筛选培养

抗性愈伤筛选将转化受体转移到选择培养基上筛选，选择压为潮霉素(40mg/L)，筛选周期约为6个月，每轮筛选时间为3-4周。每次继代皆淘汰褐色和呈水渍状的愈伤组织，而把生长正常的愈伤组织切成2-3块，紧贴培养基表面培养。

(3)植株的再生

将筛选的抗性愈伤转接到N6培养基(潮霉素40mg/L)上，光照培养(14h光照，10h黑暗)，培养约3周分化出植株。

(4)幼苗锻炼

当再生幼苗长到约3cm，并有2-3片叶和主根时，将幼苗转移到三角瓶或培养管中，在室内培养1-2周。幼苗主茎进一步伸长增粗，叶片数增多，伸展。

(5)再生苗移栽将幼苗小心从三角瓶或培养管中取出，用自来水冲净培养基，剪去枯叶和褐色根状物，移栽于营养土和蛭石(1∶2)的小花盆中，外罩塑料膜保湿一周。当幼苗在小花盆中又长出1-2片新叶时，可带土移栽到温室大花盆中或温室内。

6转基因玉米的检测

6.1玉米叶绿体DNA的提取(DNA的提取方法同上述的玉米叶绿体基因组的提取)；

6.2转基因玉米PCR检测

(1)转基因玉米A15N的PCR检测

PCR体系：

反应程序为：

取4μL PCR产物上样于1％琼脂糖凝胶上电泳，在转基因玉米的DNA中分别扩增获得与预期大小完全一致的片段，而在野生型玉米中则没有相应的条带出现(图1)。

(2)叶绿体转基因玉米同质化程度的PCR检测

FP：GGGGACTCGCACTTGATTTCGTTG

RP：CACCCTGTGTACGTTCTATCCTATAG

以转基因玉米叶绿体DNA为模板，用LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。

PCR体系：

反应程序为：

扩增结果，转基因玉米的叶绿体总DNA扩增出了一条约4.6kb的条带和一条约0.4kb的条带，而野生型的玉米叶绿体DNA仅扩增出一条0.4kb的条带(图2)，说明EPSP合酶编码基因已定点整合到玉米叶绿体基因组中。

6.3草甘膦抗性检测

将野生型植株和所筛选到的阳性转基因玉米植株同时种植在温室(28℃，16h光照，8h黑暗)中，其中，野生型植株30株，阳性玉米植株30株，野生型植株和阳性玉米植株在长势、生长期上基本相同，二者在光照、温度、湿度、土壤及其它栽培管理上完全相同；当植株长出5-6片叶子时候，同时喷洒3％草甘膦溶液(w/v)。一周后，野生型玉米植株叶片出现大量的黄色斑点，叶尖和边缘开始枯萎，而转基因玉米植株生长基本正常。两周后，野生型玉米植株的大部分叶片枯萎，根部和茎部变黑，而转基因玉米植株的叶片基本正常，只有叶尖和叶边缘略有枯萎现象。

7.转基因玉米植株中EPSP合酶的酶活测定

7.1蛋白的定量分析

7.1.1采用BCA法蛋白定量试剂盒来进行蛋白定量。

蛋白定量试剂盒的组成：蛋白标准(5mg/mLBSA)，BCA Solution A和BCASolution B。

7.1.2蛋白质定量原理简介

蛋白质定量是蛋白质研究的基础工作之一。BCA(bicinchoninic acid)是理想的蛋白质定量方法。碱性条件下，蛋白将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

7.1.3测定方法

①配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA Solution A加1体积BCA Solution B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定；

②稀释标准品：取10μL标准品用PBS稀释至100μL(标准品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20μL；

③加适当体积样品(转EPSP合酶编码基因玉米植株的可溶性总蛋白)到96孔板的样品孔中，补加PBS到20μL；

④各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min；

⑤冷却到室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

测定结果表明，本发明转EPSP合酶编码基因玉米植株叶片的可溶性总蛋白含量为13.4±0.35mg/g。

7.2转基因玉米植株中的EPSP合酶动力学分析

7.2.1无机磷标准曲线的建立

10mM无机磷标准液(原液、1∶5稀释液和1∶10稀释液)，分别取0、1、2、3…20μL于1.5mL Eppendorf离心管中，加入milli-Q水至100μL混匀，加入MAT溶液0.8mL混匀，计时3min后加入34％SC溶液100μL迅速混匀，室温静置20min后测定OD660值，重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD660值为纵坐标作图得到无机磷标准曲线(Lanzetta，P.A.，Alvarez，L.J.，Reinach，P.S.，et al..An improved assay fornanomole amounts of inorganic phosphae.Anal Biochem，1979.100：95-97)。

7.2.2酶活测定

提取本发明转EPSP合酶编码基因玉米植株的含酶粗提物蛋白的总可溶性蛋白，将所提取的含酶粗提物的总可溶性蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法进行定量(Brodford，M.M..A rapid and sensitive metod for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.，1976.72：248-254)。所述含酶粗提物的总可溶性蛋白的提取方法如下：取转EPSP合酶编码基因玉米叶片500毫克，液氮研磨，加入200μL 1×PBS转入1.5mL离心管中，4000rpm离心5分钟，取上清，再将沉淀物按上述操作步骤重复2次，合并所得上清，即得叶片可溶性总蛋白。将所提取的叶片可溶性总蛋白稀释后按上述方法进行蛋白质浓度测定。

转基因玉米植株中EPSP合酶酶活的测定方法如下：在冰上于1.5mL Eppendorf离心管中加入以下溶液：10mM PEP溶液2μL，10mM S3P溶液2μL，0.5M HEPES溶液2μL，1mM(NH⁴⁺)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μL和milli-Q水12μL混匀，于28℃温浴5min，各管样品间隔2秒加入1μL转EPSP合酶编码基因玉米植株的粗酶液并计时，2min后再间隔2秒依次加入200μLMAT溶液，显色3min后再间隔2秒依次加入20μL 34％SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD660值。对照除不加粗酶液外，其余同样品管。样品管与对照管的OD₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到该酶的酶活力(U/mg)，结果测得转基因玉米植株中的EPSP合酶的酶活力为2.667U/mg±0.134。

<110>  中国农业科学院生物技术研究所

 

<120>  含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体及其应用

 

<130>  DQXL-0018

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  506

<212>  DNA

<213>  Zea mays

 

<400>  1

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<210>  2

<211>  473

<212>  DNA

<213>  Zea mays

 

<400>  2

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<210>  3

<211>  1237

<212>  DNA

<213>  Zea mays

 

<400>  3

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<210>  4

<211>  1919

<212>  DNA

<213>  Zea mays

 

<400>  4

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<210>  5

<211>  1026

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  5

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aaatag                                                                1026

Claims (10)

1.一种含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于，包括： 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的表达盒，玉米叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及rbcL；其中，5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的表达盒位于同源重组片段atpB和rbcL之间。

2.按照权利要求1所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于：所述的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的表达盒由玉米叶绿体启动子、5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因和终止子组成。

3.按照权利要求2所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于：所述的玉米叶绿体启动子包括prrn、atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL启动子；所述的终止子为psbA终止子。

4.按照权利要求3所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于：所述的prrn启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述psbA终止子的核苷酸序列为SEQID NO:2 所示。

5.按照权利要求1所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于：所述的同源重组片段atpB的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述的同源重组片段rbcL的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

6.按照权利要求1所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体，其特征在于：还含有显性选择标记基因的表达盒；所述的显性选择标记基因优选为细菌来源的抗菌素抗性基因；更优选为抗潮霉素基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。

7.含有权利要求1-6任何一项所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体的玉米组织、玉米细胞或玉米原生质体。

8.一种构建权利要求1-6任何一项所述含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体的方法，该方法包括以下步骤：

（1）、将5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因可操作的与玉米叶绿体特异启动子和终止子相连接，使5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因置于玉米叶绿体特异启动子和终止子的调控之下，得到5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的表达盒；

（2）、将玉米叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及rbcL分别连接在5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因的表达盒的两侧，即得。

9.权利要求1所述含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体在提高玉米草甘膦抗性中的应用。

10.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：将所述的含抗除草剂基因玉米叶绿体转基因表达载体转化玉米愈伤组织、玉米细胞或玉米原生质体，筛选得到玉米抗性愈伤组织或细胞；(3)诱导玉米抗性愈伤组织或细胞分化，再生获得玉米抗除草剂植株。

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