CN102174566A - 一种通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CgHSP70基因提高切花菊抗逆性的方法。将从菊花“钟山紫桂”中克隆得到的CgHSP70基因构建植物表达载体采用农杆菌介导法转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株，经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株。对转化植株进行PCR和荧光定量PCR分析，证实内源基因已经转入到转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株后代进行抗性分析证实其对高温、干旱及高盐的抗性有明显的提高。本发明通过转化内源CgHSP70基因并正常转录表达，及在逆境下诱导该基因的表达从而提高切花菊的抗逆性，为利用基因工程技术选育菊花抗逆性品种提供新颖而使用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

Description

一种通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法。

背景技术

菊花(Chrysanthemum grandiflorum)，菊科多年生草本植物，原产中国，栽培历史悠久，品种丰富，花型花色千变万化，观赏价值极高，是中国十大传统名花之一，也是深受广大民众喜欢的园艺植物，广泛应用于盆花、切花等，居世界四大切花之首。但夏季高温使其观赏价值和栽培生产时间范围受到影响。为了解决菊花的周年稳定供应，获得适应夏季高温气候的菊花材料，提高菊花耐热性成为当今研究的重要课题。目前有关菊花耐热性鉴定与耐热性研究的报道不少，但关于通过转基因技术提高菊花的耐热性方研究报道还相对较少。

热激蛋白是一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白，是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用。热激蛋白种类很多，其中分子量为70kDa的HSP70是最保守、最普遍的。目前关于HSP70是否能提高抗逆性的报道很少。Cheng等报道指出水母雪莲中的HSP70受到高温和低温胁迫短时处理的强烈表达(Cheng等，2006)；Cho等研究表明转HSP70-1基因的烟草能增强植株的抗旱性(Cho等，2006)。

在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将耐热基因HSP70构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐逆特性的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

参考文献：

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发明内容

本发明的目的在于为解决现实生产中切花菊对高温、干旱和高盐耐逆性不强的问题，提供一种通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法。CgHSP70基因是从菊花(Chrysanthemum grandiflorum)‘钟山紫桂’中克隆得到的耐热基因，序列为SEQ IDNO.1。本发明涉及的植物表达载体构建和遗传转化，转基因植物的分子检测及转基因后代对高温、干旱及高盐的抗逆性分析。为利用基因工程技术开展耐逆性菊花新品种分子育种提供方法和实例。

本发明是通过以下技术方案实现的：

构建包含CgHSP70基因的植物表达载体，利用根癌农杆菌介导法，将CgHSP70基因导入切花菊，并经过潮霉素筛选抗性植株；经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR检测，荧光定量PCR检验内源基因已整合到切花菊基因组DNA上。对转基因后代进行耐高温、干旱和高盐分析，最终获得抗逆性提高的转基因菊花植株。

一种通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)构建CgHSP70基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CgHSP70

以菊花‘钟山紫桂’为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CgHSP70基因的上下游分别引入SmaI和XbaI酶切位点，上游引物为：CgHSP70-F：5′-CCCCGGGATGGCTGGTAAAGGTGAA-3′，下游引物为CgHSP70-R：5′-AGTAGAACAGATAAATATCGACCACA-3′，将扩增出来的含有CgHSP70完整开放阅读框的PCR产物片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，提取阳性质粒，由SmaI和XbaI双酶切得到的CgHSP70基因片段，与SmaI和XbaI双酶切线性化的表达载体pCAMBIA1301连接，并转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-CgHSP70构建成功，所述的CgHSP70基因序列为SEQ ID NO.1；

(2)农杆菌介导叶盘法转化菊花：采用农杆菌介导法将CgHSP70基因的植物表达载体转入到菊花中，进行培养初步获得抗性植株。

上述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，步骤(2)采用农杆菌介导法将CgHSP70基因的植物表达载体转入到菊花中，进行培养初步获得抗性植株的操作过程为：制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的含有CgHSP70基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CgHSP70转入感受态的农杆菌菌株中；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养培养基中预培3d，然后浸入备好的转入了CgHSP70基因植物表达载体的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再将其接种到共培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。

菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8～6.0，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；筛选培养基：MS+潮霉素10mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

详细过程为：以上过程中所用的农杆菌菌株为EHA105，从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。取10μL pCAMBIA1301-CgHSP70载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。

以切花菊‘神马’叶片为外植体，取组培瓶中菊花苗顶端叶盘(0.5cm×0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时切下绿芽转入生根培养基中，当根系发达成为完整的植株，经炼苗后移栽至营养土直径5cm盆钵，获得植株为具有潮霉素抗性T0代转基因菊花，初步获得抗性植株。

上述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其在于将转CgHSP70基因初步获得的抗性植株进行分子检测(PCR和荧光定量PCR分子检测)，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系：

(1)PCR检测

取生根筛选得到的潮霉素抗植株嫩叶及未转化株嫩叶，采取CTAB法提取基因组DNA。由于是同源转化，将hptII基因作为检测目标。根据hptII基因两端合成扩增反应引物，扩增出的基因的片段长度408bp，引物序列为：HII-F：CTCGATGAGCTGATGCTTTGGG，HII-R：GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA。分别以潮霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以HII-F和HII-R为引物，进行PCR检测。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

(2)荧光定量PCR检测

按照荧光定量试剂盒(

Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立扩增体系。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的C_T值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。扩增出的基因片段长度为115bp，引物序列为：HSP-F：GCTTGCTGAGGCGGATGAGT和HSP-R：ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC，以PsaA扩增的基因片段为内标，扩增片段长度为127bp，引物序列：PsaA-F：CCAATAACCACGACCGCTAA，PsaA-R：CACAGTCCTCCCAAGTAA。

上述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其在于对所获得转基因植株后代进行抗性分析：

(1)采集转基因株系和未转化植株生长一致的幼苗叶片，用去离子水洗净，纱布擦干，去除主脉并剪成0.5cm²的小片，放入烧杯中并准确加入20mL去离子水，用真空泵抽气10min后分别在室温、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴中放置20min，取出静置冷却2h，并测定相对电导率，拟合Logistic回归方程，得到高温半致死温度(LT₅₀)。

(2)转基因株系及野生型植株高温胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的高温胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株进行高温胁迫处理。处理后，将转基因及未转基因植株苗种植于营养钵中恢复生长一周，然后统计存活率并观察生长情况。

(3)转基因株系及野生型植株干旱胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的干旱胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株进行干旱胁迫处理。处理后，将转基因及未转基因植株脚芽扦插苗种植于营养钵中恢复生长两周，然后统计存活率并观察生长情况。

(4)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的盐胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株进行盐胁迫处理。处理后将植株根系用去离子水冲洗3遍，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长一周，统计植株存活率并观察生长情况。

本发明的有益效果：

本发明提供的方法选育了转基因菊花材料，采用转基因技术，将CgHSP70基因整合到菊花基因组中，通过高温、干旱及高盐试验分析获得耐高温、干旱及高盐的转基因菊花株系。结果发现，与野生型株系和转空载体植株相比，转CgHSP70的植株耐高温、干旱及高盐能力得到很大提高，而野生型植株和转空载体的CgHSP70的植株抗性很弱。利用本方法可以显著提高菊花的耐逆性。

附图说明

图1：植物重组表达质粒pCAMBIA1301-CgHSP70构建图谱

R，右边界；L，左边界；CgHSP70表达热激蛋白70的基因；hpt为潮霉素磷酸转移酶基因。

图2：植物表达载体构建酶切验证图A，Marker；B，植物表达载体

图3：转基因切花菊的转化和再生过程

A，转化叶盘分化出愈伤组织；B，转化叶盘分化出抗性芽；C，抗性芽生根；D，抗性芽生根培养长成完整植株。

图4：转CgHSP70基因植株的PCR检测结果

M，DL2000Marker；1-5、转基因切花菊植株；6、未转化切花菊；7、质粒pBI121-HSP70阳性对照；8、以水为模板阴性对照。

图5：荧光定量PCR检测CgHSP70基因在转基因和未转基因植株的表达

WT：野生型植株；Vector：转空载体植株；Th1-9转CgHSP70基因株系

图6：荧光定量PCR检测高温胁迫后CgHSP70基因在转基因和未转基因株系中的表达WT：野生型植株；Vector：转空载体植株；Th4转CgHSP70基因植株

图7：转基因株系和未转基因植株在高温胁迫后24h内的表型分析

图8：转基因植株和未转基因植株未胁迫处理(23℃)和高温胁迫(45℃)处理后恢复生长存活率分析

图9：转基因植株和未转基因植株未胁迫(23℃)处理和干旱胁迫(30℃)处理后恢复生长存活率分析

图10：转基因植株和未转基因植株未胁迫处理和高盐处理胁迫处理后恢复生长存活率分析

具体实施方式

下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。

实施例1

1、植物表达载体pCAMBIA 1301-CgHSP70的构建

以菊花‘钟山紫桂’为材料，提取总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CgHSP70基因的上下游分别引入SmaI和XbaI酶切位点，上游引物为：CgHSP70-F：5′-CCCCGGGATGGCTGGTAAAGGTGAA-3′，下游引物为CgHSP70-R：5′-AGTAGAAC AGATAAATATCGACCACA-3′。50μL反应体系：10×RCR Buffer 5.0μL，CgHSP70-F、CgHSP70-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNAPolymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.8μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，反应33个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到T-载体(TaKaRa)，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，测定序列为SEQ ID NO.1。

提取含有目的片段的T-载体及表达载体pCAMBIA1301质粒DNA并双酶切，酶切体系为：10×Buffer K 2.5μl，Sma I 2.0μl，Xba I 2.0μl，质粒DNA 10μl，ddH₂O补齐至50μl，37℃过夜充分酶切。将含有CgHSP70完整开放阅读框的片段和pCAMBIA1301线性化质粒片段分别回收，并将两个片段连接。连接反应体系为：T4Buffer 2.0μl，T4连接酶1.0μl，载体回收液1.0μl，目的基因回收液4.0μl，dd H₂O补齐至20μl，4℃过夜连接。将连接好的重组质粒pCAMBIA 1301-CgHSP70转化TOP10细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证(图1和图2)。

2、农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花

制备感受态的农杆菌，将CgHSP70基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CgHSP70转入感受态的农杆菌菌株中，详细过程：

从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。取10μL pCAMBIA 1301-CgHSP70载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。

采用同样方法将空白载体pCAMBIA1301转入农杆菌菌株EHA105中，作为对照。

采用的农杆菌指包含CgHSP70基因和空白载体的植物表达载体的EHA105，用YEB液体培养基培养农杆菌EHA105；将转CgHSP70基因和空白载体的转基因植株后代分别命名为Th和Vector，以切花菊‘神马’叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将菊花(Chrysanthemum grandiflorum)‘钟山紫桂’中克隆得到的CgHSP70基因导入‘神马’。取组培瓶中‘神马’苗顶端叶盘(0.5cm×0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3cm时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株(图3)。

菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8～6.0，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；筛选培养基：MS+潮霉素10mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

2、将转CgHSP70基因抗性植株进行分子检测(PCR及荧光定量PCR)呈阳性，获得转基因菊花株系

1)PCR检测

取生根筛选得到的潮霉素抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，采取CTAB法提取基因组DNA。由于是同源转化，将hptII基因作为检测目标。根据hptII基因序列合成扩增引物，扩增片段长为408bp，引物序列为：HII-F：CTCGATGAGCTGATGCTTTGGG，HII-R：GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA。分别以潮霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以HII-F和HII-R为引物，进行PCR检测。扩增体系为：1μLDNA模板，2.5μL10×PCRBuffer，2μL dNTP，1.5μL 2.5mmol·L^-1MgCl²，5U·μL^-1Taq酶0.2μL，HII-F和HII-R各1μL，去离子水补足25μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图4)。图中可以看到，转CgHSP70的植株中有6个株系扩增出与阳性对照相同的特异扩增带，转pCAMBIA1301空载体和野生型植株没有扩增出条带。

2)荧光定量RT-PCR检测

采用TaKaRa公司生产的RNAiso Reagent试剂盒，提取抗潮霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量RT-PCR对CgHSP70基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒(

Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立25μl扩增体系：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，40个循环。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的C_T值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。特异引物扩增出的片段长为115bp，引物序列为：HSP-F：GCTTGCTGAGGCGGATGAGT和HSP-R：ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC，以PsaA扩增的基因片段为内标，扩增的基因片段长度为127bp，引物序列：PsaA-F：CCAATAACCACGACCGCTAA，PsaA-R：CACAGTCCTCCCAAGTAA。

根据荧光定量PCR检测结果(图5)，转CgHSP70的植株株系基因表达量高于野生型和转空载体植株，转基因株系中Th1、Th4、Th9表达量明显较高，而转空载体植株与野生型相比表达量都比较低。证实内源基因已经转入切花菊基因组DNA中并表达。3)45℃高温处理转基因株系及野生型植株荧光定量PCR分析

将转基因及未转基因植株组培苗分别种植于营养钵中，栽培基质为按1∶l比例混和的营养土∶蛭石混和物，种植于温室(23土2℃，12h光周期)中，待转基因及未转基因植株展叶8～10片时，将植株移至光照培养箱中，温度设置为45℃，分别在0，1，3，6，12，24h取叶片0.1g(3次重复)液氮保存。采用TaKaRa公司生产的RNAiso Reagent试剂盒，提取转基因及未转基因植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量PCR对CgHSP70基因的表达量进行检测。荧光定量PCR检测方法同2)。CgHSP70基因特异引物序列为：HSP-F：GCTTGCTGAGGCGGATGAGT和HSP-R：ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC，以PsaA扩增的基因片段为内标，扩增的基因片段长度为127bp，引物序列：PsaA-F：CCAATAACCACGACCGCTAA，PsaA-R：CACAGTCCTCCCAAGTAA。

根据荧光定量PCR检测(图6)，在45℃条件下，与未转化植株和转空载体植株相比，Th4植株中短时间内快速提高，且在第1h时达到最高，而未转基因植株和转空载体植株CgHSP70基因的表达虽然也在1h达到最高，但一直保持较低水平。转基因株系在短时间内合成大量的热激蛋白，从而提高植株的抗逆性。

3、转基因植株后代的抗性分析

1)转基因株系及野生型植株高温半致死温度(LT₅₀)及相对电导率回归方程分析采集转基因株系和未转化植株生长一致的土培苗叶片，先用自来水冲洗干净，然后用去离子水漂洗3次，在滤纸上吸干。将叶片剪成0.5cm²的小叶片，称取0.1g，放入装有20mL去离子水的试管中，在真空泵中抽气10min后分别在40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴中放置20min，取出静置冷却2h，用电导仪测定电导率后全部放入100℃沸水浴中煮沸20min以杀死植物组织。取出冷却在25℃恒温下测定电导率，每组试验重复3次。以室温下植物叶片的电导率作为对照，按下式计算细胞伤害率。

细胞伤害率＝[(1-Rt/Rm)/(1-Ct/Cm)]×100％并测定相对电导率，式中Rt为不同水浴温度电导率，Rm为沸水浴后电导值，Ct和Cm为对照煮前和煮后电导值。将处理温度与细胞的伤害用Logistic方程：Y＝k/(1+ae^-bx)来拟合，方程中Y代表细胞的伤害率，x代表处理温度，k为细胞伤害率的饱和容量，由于细胞伤害率消去了本底干扰，因而k值为100，a、b为方程参数。为了确定a，b的值，将方程进行线性化处理，ln[(K-y)/y]＝lna^-bx，令y1＝ln[(K-y)/y]，则转化为细胞伤害率(y₁)与处理温度(x)的直线方程。通过直线回归的方法求得a，b值及相关系数R，高温半致死温度LT₅₀＝ln[(1/a)]/b(盖钧镒，2000)。所得数据统一使用SYSTAT 7.0(SYSTAT，1997)软件进行单因素方差分析(表1)。

表1转基因植株及野生型植株叶片电导率的Logistic方程参数及半致死温度(LT₅₀)

注：表中数值为平均值，a、b、c、d、e代表经Tukey检验为显著差异(P＜0.05)

如表1，与野生型(WT)和转空载体(Vector)相比，转CgHSP70基因株系(Th1、Th4、Th11)半致死温度明显较高。表明半致死温度可作为转基因菊花耐高温性评价的一个可靠指标。

2)转基因株系及野生型植株高温胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的高温胁迫耐性，对转基因株系Th4、Vector及野生型植株进行高温胁迫处理。将转基因及未转基因植株各20棵种植于营养钵中，栽培基质为按1∶1比例混和的营养土∶蛭石混和物，种植于温室(23土2℃，12h光周期)中，待植株展叶8～10片时即可进行高温胁迫处理，各株充分浇水，然后置于光照培养箱(温度为45℃，相对湿度为30％)中，处理24小时(h)，然后将温度降至23℃，浇足水恢复生长一周，统计植株存活率。

由图7可以看出，在高温胁迫下，野生型株系萎蔫进程最快，转空载体植株次之，Th4转基因株系最慢，受到的胁迫伤害最轻；由图8可以看出，高温胁迫处理后，Th4转基因株系的植株顶端仍然保持绿色，只有顶部叶片稍有灼伤；恢复生长后，存活率为100％；野生型和转空载体植株叶片几乎全部皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率为0％。3)转基因株系及野生型植株干旱胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的干旱胁迫耐性，对转基因株系Th4、转空载体植株及野生型植株进行干旱胁迫处理。将转基因及未转基因植株组培苗炼苗后各20棵种植于营养钵中，栽培基质为按1∶1比例混和的营养土∶蛭石混和物，种植于温室(23土2℃，12h光周期)中，待植株展叶8～10片时即可进行干旱胁迫处理，各株充分浇水，然后置于光照培养箱(温度为30℃，相对湿度为30％)中，控水处理9天(d)，然后将温度降至23℃，浇足水恢复生长两周，统计植株存活率。

由图9可以看出，干旱胁迫处理后，Th4转基因株系的大部分植株顶端仍然保持绿色，只有基部叶片皱缩、萎蔫下垂；恢复生长后，存活率为100％；野生型植株只有少部分植株顶端保持绿色，叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率只有45％；而转空载体株系叶片全部重度皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率为40％。

3)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的盐胁迫耐性，对转基因株系Th4、转空载体植株及野生型植株进行盐胁迫处理。将转基因及未转基因植株组培苗各20棵种植于营养钵中，栽培基质为按1∶1比例混和的营养土∶蛭石混和物，种植于温室(23土2℃，12h光周期)中，待转基因及未转基因植株展叶8～10片时控水处理4d，然后浇灌NaCl溶液15d，以5d为周期逐渐提高NaCl溶液浓度，分别为100mM、200mM、300mM，然后将植株根系用去离子水冲洗3遍，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长一周，统计植株存活率。

由图10可以看出，随着NaCl溶液浓度逐渐提高，与未转基因植株相比，盐胁迫处理后，转空载体株系叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率为80％；野生型植株顶端绿色，叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率只有75％；而Th4转基因株系的大部分植株只有基部叶片皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率为100％。

Claims (6)

1.一种通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)构建CgHSP70基因的植物表达载体：

以菊花‘钟山紫桂’为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CgHSP70基因的上下游分别引入SmaI和XbaI酶切位点，上游引物为：CgHSP70-F：5′-CCCCGGGATGGCTGGTAAAGGTGAA-3′，下游引物为CgHSP70-R：5′-AGTAGAACAGATAAATATCGACCACA-3′，将扩增出来的含有CgHSP70完整开放阅读框的PCR产物片段与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，提取阳性质粒，由SmaI和XbaI双酶切得到的CgHSP70基因片段，与SmaI和XbaI双酶切线性化的表达载体pCAMBIA1301连接，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-CgHSP70构建成功，所述的CgHSP70基因序列为SEQ IDNO.1；

(2)采用农杆菌介导法将CgHSP70基因的植物表达载体转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株。

2.根据权利要求1所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于步骤(2)的操作过程为：制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的含有CgHSP70基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CgHSP70转入感受态的农杆菌菌株中；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的转入了CgHSP70基因植物表达载体的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再将其接种到共培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。

3.根据权利要求2所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8～6.0，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；筛选培养基：MS+潮霉素10mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

4.根据权利要求1或2所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于所用的农杆菌菌株为EHA105。

5.根据权利要求1或2所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于将转CgHSP70基因初步获得的抗性植株进行PCR和荧光定量PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系：

(1)PCR检测

取生根筛选得到的潮霉素抗植株嫩叶及未转化植株嫩叶，采取CTAB法提取基因组DNA，将hptII基因作为检测目标，根据hptII基因两端合成扩增反应引物，扩增片段长为408bp，引物序列为：HII-F：CTCGATGAGCTGATGCTTTGGG，HII-R：GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA；分别以潮霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以HII-F和HII-R为引物，进行PCR检测；分子检测筛选获得抗性株系，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

(2)荧光定量PCR检测

建立扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的C_T值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物片段长为115bp，引物序列为：HSP-F：GCTTGCTGAGGCGGATGAGT和HSP-R：ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC，以PsaA扩增的基因片段为内标，扩增片段长度为127bp，引物序列为：PsaA-F：CCAATAACCACGACCGCTAA，PsaA-R：CACAGTCCTCCCAAGTAA，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

6.根据权利要求5所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于对所获得转基因植株后代进行抗性分析：

(1)采集转基因株系和未转化植株生长一致的幼苗叶片，用去离子水洗净，纱布擦干，去除主脉并剪成0.5cm²的小片，放入烧杯中并准确加入20mL去离子水，用真空泵抽气10min后分别在室温、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴中放置20min，取出静置冷却2h，并测定相对电导率，拟合Logistic回归方程，得到高温半致死温度(LT₅₀)；

(2)转基因株系及野生型植株高温胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的高温胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株WT进行45℃高温胁迫处理，处理后，将转基因及未转基因植株苗种植于营养钵中恢复生长一周，然后统计存活率并观察生长情况；

(3)转基因株系及野生型植株干旱胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的干旱胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株WT进行干旱胁迫处理，处理后，将转基因及未转基因植株苗种植于营养钵中恢复生长两周，然后统计存活率并观察生长情况；

(4)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的盐胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株WT进行盐胁迫处理，处理后将植株根系用去离子水冲洗3遍，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长一周，统计植株存活率并观察生长情况。

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