CN103525828B - 番茄SlEBI基因及其RNAi表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了番茄SlEBI基因及其RNAi表达载体和应用，番茄SlEBI基因的序列如SEQ ID No.3所示，将番茄SlEBI基因沉默后番茄表型呈多花及花柄、果柄无离区表型，因此可以通过沉默SlEBI基因获得多花且不易落花落果的高产番茄新品种，具有良好的市场前景和经济价值，同时为其它观赏植物的多花新品种培育和筛选以及为农作物的高产新品种的培育和筛选提供了参考和借鉴。

Description

番茄SlEBI基因及其RNAi表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及番茄SlEBI基因和利用该基因构建的RNAi载体及其应用，还涉及该RNAi载体的构建方法。

背景技术

番茄是一种深受人们所喜爱的世界性蔬菜。其每一台花序一般8到12朵花，且由于每一花柄处都具有离区，使得花朵在受到外力（如风、雨等）影响时极易脱落，这一特征大大限制了番茄的产量。而番茄的产量是农民们一直关注的重要问题。传统的育种方法一般通过杂交等方法增加番茄重量或延长番茄结果期来培育高产品种。该方法周期长、耗资多、增产效果并不理想且不可稳定遗传。目前，传统育种方法已不能满足番茄生产的需要。近年来，随着基因工程的迅速发展和转基因技术的日益完善，基因工程技术在培育高产番茄方面显示了极大的潜力。自1983年世界上第一例转基因作物问世以来，转基因植物的研究得到了迅速发展。1994年延熟保鲜转基因番茄在美国批准上市。目前，基因工程技术已广泛的用于番茄品种的改良和育种中。利用基因工程技术快速获得稳定遗传的番茄新品种必将是当前和未来的发展趋势。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种番茄SlEBI基因；本发明的目的之二在于提供番茄SlEBI基因核心片段；本发明的目的之三在于提供番茄SlEBI基因核心片段在培育多花高产番茄品种中的应用；本发明的目的之四在于提供番茄SlEBI基因核心片段在培育花柄无离区番茄品种中的应用；本发明的目的之五在于提供含有SlEBI基因核心片段的RNAi表达载体；本发明的目的之六在于提供含有所述RNAi表达载体的微生物转化体；本发明的目的之七在于提供RNAi表达载体的制备方法；本发明目的之八在于提供RNAi表达载体在培育多花高产番茄品种中的应用。

1,番茄SlEBI基因，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.番茄SlEBI基因核心片段，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.所述番茄SlEBI基因核心片段在培育多花高产番茄品种中的应用。

4.所述番茄SlEBI基因核心片段在培育花柄无离区番茄品种中的应用。

5.含有所述SlEBI基因核心片段的RNAi表达载体。

优选的，所述RNAi表达载体是以pBin19载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的CaMV35S启动子、番茄SlEBI基因核心片段的反向序列、PDK内含子、番茄SlEBI基因核心片段正向序列和Nos终止子表达框。

6.含有所述RNAi表达载体的微生物转化体。

7.所述RNAi表达载体的制备方法，包括如下步骤：

a.以含SEQ ID No.6的重组质粒为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物进行PCR扩增，将扩增产物纯化后用Cla I和Xba I双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(1)；

b.按步骤a的方法进行PCR扩增，将扩增产物纯化后用Kpn I和Xho I双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(1)连接，获得重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(2)；

c.将步骤b所得重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(2)用Sac I和Spe I双酶切，再与经Sac I和Xba I双酶切的pBin19载体连接，得RNAi表达载体。

优选的，所述含SEQ ID No.6的重组质粒由如下方法制备，以含SlEBI基因的重组质粒为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物进行扩增，将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接，得含SEQ ID No.6的重组质粒。

8.所述RNAi表达载体在培育多花高产番茄品种中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明获得了番茄SlEBI基因，利用番茄SlEBI基因核心片段构建番茄SlEBI基因沉默的RNAi载体，将该RNAi载体转入番茄，所得转基因番茄阳性植株中SlEBI基因的表达均较非转基因植株显著降低，植物株型为多花及花柄无离区表型，成功获得了多花且不易落花落果的高产番茄新品种；与传统育种方法通过杂交等方法培育高产品种的周期长、耗资多、增产效果不理想且不可稳定遗传相比，本发明采用基因工程技术，高效并可稳定遗传地增加了番茄的花数，进而增加了产量，为番茄的品种改良作出了积极的探索，也为观赏植物的多花育种和其他植物的高产育种提供了参考和借鉴，所得多花高产番茄新品种具有良好的市场前景和经济价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为番茄SlEBI基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中a为番茄SlEBI基因全长的的琼脂糖凝胶电泳分析图；b为番茄SlEBI基因核心段的琼脂糖凝胶电泳分析图，M为DNA分子量标准（Maker）。

图2为重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(1)构建示意图。

图3为重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(2)构建示意图。

图4为重组质粒pBin19::SlEBIi构建示意图。

图5为番茄转基因组织培养过程（其中a为番茄子叶片预培养1天后，b为番茄愈伤组织分化，c为番茄抗性芽的分化，d为番茄抗性植株的产生）。

图6为PCR检测NPTII报告基因在转基因番茄植株中的表达（M为Maker，CK-为阴性对照，CK+为阳性对照，-为空白对照，1-15为转基因番茄植株）。

图7为SlEBI基因在转基因番茄阳性植株中的沉默效果鉴定（WT为非转基因番茄，RNAi#1,4,6,8,15为不同的转基因番茄阳性株系）。

图8为转基因番茄阳性植株结果图（A，B为非转基因番茄花序；C为非转基因番茄花序的电镜照片；D，E为转基因番茄花序；F为转基因番茄花序的电镜照片）。

图9为转基因番茄阳性植株的无离区表型（其中A图中WT为非转基因番茄，RNAi转基因番茄阳性株系，B为非转基因番茄，C为转基因番茄）。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第双版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中使用的番茄品种为“Solanum lycopersicon Mill.cv.Ailsa Craig”，为本实验室留种。pGEM-T Easy载体为Promega公司产品，pHANNIBAL载体、pBin9载体、大肠杆菌DH5α、含有游动质粒pRK2013的大肠杆菌“协助”菌（简称helper）和根癌农杆菌LBA4404由本实验室保存；RNA提取试剂盒、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒、DNA提取试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.0（T4DNA连接酶/SolutionI）、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶均为大连TaKaRa公司产品；DNA纯化试剂盒（离心柱型）为TIANGEN公司产品；其余试剂均为分析纯试剂。

一、获得番茄SlEBI基因全长序列

根据TIGR数据库中番茄EST序列（EST244410）以及NCBI数据库中番茄序列（XM_004252200），设计特异性引物SlEBI(c)-F和SlEBI(c)-R，引物序列如下：

SlEBI(c)-F：5'-agaaaaatgggaagaggaa-3'（SEQ ID No.1）；

SlEBI(c)-R：5'-gcatagttgagatggggcc-3'（SEQ ID No.2）；

提取番茄授粉期花总RNA，按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书，以oligodT引物反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以SlEBI(c)-F和SlEBI(c)-R为引物，PCR扩增番茄SlEBI基因全长，PCR反应体系为：ddH₂O16.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、MgCl₂2.5μL、dNTP(10μM)1.0μL、100μM的上、下游引物各0.5μL、cDNA模板1.0μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，共25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃终延伸10分钟。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图1a所示。然后将扩增条带采用DNA纯化试剂盒进行回收纯化，将纯化的番茄SlEBI基因全长片段与pGEM-T Easy载体连接，获得重组质粒pGEM-T::SlEBI(c)。将上述重组质粒委托英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，结果显示，获得931bp的番茄SlEBI基因全长序列（SEQ ID No.3）。

二、番茄SlEBI基因核心片段的克隆

根据SlEBI基因全长序列，设计扩增番茄SlEBI基因核心片段的特异引物SlEBI-F和SlEBI-R，具体序列如下：

SlEBI-F：5'-ctccttcaacgttctcaaag-3'（SEQ ID No.4）；

SlEBI-R：5'-catgatcatttgcaccc-3'（SEQ ID No.5）；

以包含SlEBI基因的重组质粒pGEM-T::SlEBI(c)为模板，SlEBI-F和SlEBI-R为引物，PCR扩增番茄SlEBI基因核心片段，PCR反应体系为：ddH₂O16.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、MgCl₂2.5μL、dNTP(10μM)1.0μL、100μM的上、下游引物各0.5μL、稀释十倍的pGEM-T::SlEBI(c)1.0μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，共25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃终延伸10分钟。将获得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图1b所示。然后将扩增条带采用DNA纯化试剂盒进行回收纯化，将纯化的番茄SlEBI基因核心片段与pGEM-T Easy载体连接，获得重组质粒pGEM-T::SlEBI。将上述重组质粒委托英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，结果显示，获得385bp的番茄SlEBI基因核心片段（SEQ ID No.6）。

三、构建含番茄SlEBI基因的RNAi表达载体

根据pHANNIBAL载体的多克隆位点和所得SlEBI基因序列，设计构建含番茄SlEBI基因核心片段的RNAi表达载体的引物，具体为：

SlEBIi-F：5'-cggggtacc ctccttcaacgttctcaaag-3'(SEQ ID No.7)，下划单直线部分为KpnI酶切位点，下划双直线部分为CalI酶切位点。

SlEBIi-R：5'-ccgctcgag catgatcatttgcaccc-3'(SEQ ID No.8)，下划部分为XhoI酶切位点，下划双直线部分为XbaI酶切位点。

以重组质粒pGEM-T::SlEBI为模板，以SlEBIi-F和SlEBIi-R为引物，进行PCR扩增，PCR反应体系为：ddH₂O16μL、10×PrimeSTAR Buffer(含MgCl₂)2.5μL、dNTP(2.5μM)4.0μL、上下游引物各0.5μL、质粒模板1.0μL、PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5μL，共25μL，PCR反应条件为：98℃变性10秒，56℃退火15秒，72℃延伸1.5分钟，共40个循环；最后72℃终延伸10分钟。扩增PCR产物为两侧带Kpn I/Cal I和Xho I/Xba I酶切位点的SlEBI基因核心片段；纯化后用Cal I和Xba I双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(1)，重组质粒结构图如图2所示；另将上述纯化的PCR产物用Kpn I和Xho I双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(1)在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(2)，重组质粒结构图如图3所示。由图3可知，pHANNIBAL::SlEBI(2)中SlEBI基因核心片段分别正向和反向插入pHANNIBAL载体中PDK内含子的两侧。

最后，将重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(2)用Spe I和Sac I双酶切，再与Xba I和Sac I双酶切的植物表达载体pBin19在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒pBin19::SlEBIi，如图4所示。重组质粒pBin19::SlEBIi即为番茄SlEBI基因RNAi载体，其含有一个hpRNA表达盒，即顺序连接的CaMV35S启动子、SlEBI基因核心片段(SEQ ID No.6)的反向序列、PDK内含子、SlEBI基因核心片段(SEQ ID No.6)正向序列和Nos终止子，并命名为“35Spro-rSlEBI-pdk-fSlEBI-Nos ter”。

四、含番茄SlEBI基因的RNAi表达载体转化农杆菌

将根癌农杆菌LBA4404在含有1.2%(w/w)琼脂、50mg/L利福平和500mg/L链霉素的YEB固体培养基上划线，28±2℃黑暗条件下培养2-2.5天至长出单菌落；分别将含有重组质粒pBin19::SlEBIi的大肠杆菌DH5α和含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，37±2℃条件下倒置培养14-16小时至长出单菌落；将根癌农杆菌LBA4404单菌落、含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌单菌落和含有重组质粒pBin19::SlEBIi的大肠杆菌DH5α单菌落依次重叠均匀涂在含有1.2%(w/w)琼脂的YEB固体培养基(pH7.2)中央直径为1cm的圆圈中，28±2℃黑暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌团适量，在含有质量分数为1.2%的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基（pH7.2）中划线，28±2℃黑暗条件下倒置培养2-2.5天至长出单菌落，挑取3-4个单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基（pH7.2），在28±2℃、黑暗、200rpm条件下摇床培养1.5天至菌液均匀且OD₆₀₀为1.8-2.0，提取重组质粒，用EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定，阳性重组子即为pBin19::SlEBIi农杆菌工程菌株，-80℃冻存备用。

五、农杆菌介导的含番茄SlEBI基因的RNAi表达载体转化番茄

将含有pBin19::SlEBIi的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1.2%的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB固体培养基上，在28±2℃黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基20mL，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养1.5天，再将所得菌液按体积比为1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基中，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养至OD₆₀₀为1.8-2.0，然后28±2℃离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有质量分数为3%的蔗糖、pH为5.8的MS盐溶液100mL重悬，制得农杆菌工程菌液。

用体积分数为75%的酒精浸泡番茄种子2min，无菌水冲洗3次；灭过菌的饱和Na₃PO₄浸泡种子20min，并不时剧烈振荡，无菌水冲洗3次；1%（V/V）的NaClO水溶液浸泡种子10min，无菌水冲洗7次；无菌水浸泡种子4h，播种在MS固体培养基上，光照培养箱26℃（16h光照）/18℃（8h黑暗）培养直至子叶展平，切取已展平的子叶即得番茄外植体。将番茄外植体的子叶切下，在MS液体培养基中浸泡1h，滤纸吸干残留液体培养基并放置在质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，26℃（16h光照）/18℃（8h黑暗）预培养1d后置于农杆菌工程菌液中浸染15分钟后，放回质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃黑暗条件下共培养48小时，再转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、500mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养至长出愈伤组织及抗性芽；将长2-3cm的抗性芽切下，转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、250mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养至生根，即得转基因番茄植株，如图5所示。

六、转基因番茄阳性植株的筛选

1.PCR检测NPTII报告基因在转基因番茄植株中的表达

根据载体pBin9中的NPTII报告基因序列，设计如下特异引物：

NPTII-F：5'-gacaatcggctgctctga-3'(SEQ ID No.9)；

NPTII-R：5'-aactccagcatgagatcc-3'(SEQ ID No.10)。

分别取转基因番茄植株和非转基因番茄植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、NPTII-F和NPTII-R为引物进行PCR扩增，检测NPTII报告基因在转基因番茄植株中的表达。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果如图6所示，阳性转基因番茄植株的PCR产物在900bp位置出现目标DNA条带，经测序证明与NPTII报告基因片段序列一致，证实这些植株为转基因番茄阳性植株。

2.qPCR检测SlEBI基因在转基因番茄阳性植株中的表达

根据番茄SlEBI基因序列和番茄内参基因序列，设计如下引物：

qSlEBI-F：5'-aacctttctttcaacctctccg-3'(SEQ ID No.11)；

qSlEBI-R：5'-tccattagagcatccaccctg-3'(SEQ ID No.12)；

qCAC-F：5'-cctccgttgtgatgtaactgg-3'(SEQ ID No.13)；

qCAC-R：5'-attggtggaaagtaacatcatcg-3'(SEQ ID No.14)。

分别取转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株的幼叶，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以qSlEBI-F和qSlEBI-R，qCAC-F和qCAC-R为引物进行qPCR，检测SlEBI基因在转基因番茄阳性植株中的表达。结果如图7所示，转基因番茄阳性植株中SlEBI基因的表达都较非转基因番茄植株显著降低，基因沉默效率较高。

六、转基因番茄阳性植株的表型分析

将上述筛选出的转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株按常规方法培育，观察分析转基因番茄阳性植株的表型特征，结果如表1和表2，图8和图9所示。

表1转基因番茄和非转基因番茄中每一台花序的花数

表2转基因番茄和非转基因番茄中每一台花序的果数

由表1和图8可知，转基因番茄的第一、二、三花序的花数均多于野生型番茄的花朵数，表明干扰番茄SlEBI基因表达后能够得到多花株系。由表2和图9可知，转基因番茄的番茄果数多于非转基因的果数，并且果柄无分离区表型，所以同一花序中结果后番茄不易脱落，从而能够提高番茄的产量。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (9)

1.番茄SlEBI基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.番茄SlEBI基因核心片段，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.干扰权利要求1所述番茄SlEBI基因在培育多花高产番茄品种中的应用。

4. 干扰权利要求1所述番茄SlEBI基因在培育花柄无离区番茄品种中的应用。

5. 含有权利要求2所述SlEBI基因核心片段的RNAi表达载体，其特征在于：所述RNAi表达载体是以pBin19载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接CaMV35S启动子、番茄SlEBI基因核心片段的反向序列、PDK内含子、番茄SlEBI基因核心片段正向序列和Nos终止子的表达框。

6. 含有权利要求5所述RNAi表达载体的微生物转化体。

7. 权利要求5所述RNAi表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.以含SEQ ID No.6的重组质粒为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物进行PCR扩增，将扩增产物纯化后用Cla I和XbaI双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(1)；

b.按步骤a的方法进行PCR扩增，将扩增产物纯化后用Kpn I和XhoI双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(1)连接，获得重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(2)；

c.将步骤b所得重组质粒pHANNIBAL::SlEBI(2) 用Sac I和 Spe I双酶切，再与经Sac I和XbaI双酶切的pBin19载体连接，得RNAi表达载体。

8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述含SEQ ID No.6的重组质粒由如下方法制备，以含SlEBI基因的重组质粒为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物进行扩增，将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接，得含SEQ ID No.6的重组质粒。

9.权利要求5所述RNAi表达载体在培育多花高产番茄品种中的应用。