CN101845443A

CN101845443A - 番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途

Info

Publication number: CN101845443A
Application number: CN 201010148543
Authority: CN
Inventors: 周雪平; 郭玉双; 吴建祥
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2030-04-16
Also published as: CN101845443B

Abstract

本发明公开了一种番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途。SlGRX1基因是从番茄中分离到的第一个谷氧还蛋白基因，由1003个碱基组成，编码一个受干旱、高盐等环境胁迫诱导的CGFS类谷氧还蛋白，该基因在番茄的根、茎、叶片和花瓣中均表达，参与植物的抗非生物胁迫反应。在番茄中沉默该基因番茄则对干旱、高盐以及氧化胁迫更为敏感，而在拟南芥中超量表达该基因则能提高转基因拟南芥对干旱、高盐以及氧化胁迫的抗性。故本发明提供的基因可以提高植物对干旱、高盐以及氧化胁迫的抗性，具有很强的理论研究和应用价值。

Description

番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途

技术领域

本发明涉及分子生物学与基因工程领域，尤其涉及一种番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途。本发明涉及番茄SlGRX1的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白属于CFGS类谷氧还蛋白。

背景技术

活性氧是植物生长发育过程中重要的信号传导因子，对促进植物的生长发育和新陈代谢，以及作物的高产、优质都起着重要的作用。然而，植物体内过多的活性氧积累会对破坏其体内的生物大分子，干扰植物正常的信号传导进而对植物造成严重的伤害，容易造成植物的萎蔫甚至死亡。植物生长的各种逆境环境如干旱、盐害、冷害、重金属、紫外辐射、臭氧、机械伤害、营养缺乏、病原体入侵、高光强等均导致光合电子传递链及呼吸链产生过量活性氧，严重影响植物的生长发育，从而降低植物的产量与品质。

为了抵抗环境的活性氧胁迫，植物在长期的进化的过程中形成了清除活性氧的复杂基因调控网络，包括mRNA的降解与选择性剪切、蛋白质的磷酸化与去磷酸化、糖基化、泛素化等。其中谷氧还蛋白基因在植物的抗氧化胁迫中起重要作用，该类蛋白其能够还原生物体内蛋白质间或者蛋白质内部的二硫键而形成巯基，维持蛋白的氧化还原状态，从而调控蛋白的活性。近年来，蛋白质的可逆氧化还原修饰日益受到重视，这种修饰可能是信号转导调控中的一种新的分子机制，成为除磷酸化修饰、糖基化修饰及泛素化修饰外的重要方式。通过获得新的谷氧还蛋白基因，研究其分子功能，对于研究植物抗逆的分子机理有重要价值，也为植物的基因工程研究提供新的基因资源。

发明内容

本发明的目的是针对目前对植物抗逆反应分子机制、抗逆植物基因资源匮乏等问题，提供一种番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途。

植物谷氧还蛋白基因SlGRX1是具有如SEQ ID NO：1所示1003个碱基DNA序列，编码具有抗氧化、干旱及盐碱能力的CGFS类的谷氧还蛋白。

植物谷氧还蛋白基因SlGRX1的克隆方法包括下列步骤：

1)根据拟南芥和水稻的CGFS类谷氧还蛋白基因，对其进行多序列比对，根据保守的同源序列设计了一对简并引物，上游引物T1为5’-SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3’，下游引物T2为5’-ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3’，其中，W代表T或者A，S代表G或者C，M代表A或者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T；

2)用上述引物经RT-PCR扩增基因片段，经测序后与NCBI等网上数据库进行同源性比对，证明得到的片段为为番茄的谷氧还蛋白基因的片段；

3)以上述扩增的基因片段为种子序列，采用电子克隆的方法，在番茄的EST数据库中进行电子延伸拼接，根据延伸的序列设计引物，上游引物YGS2为5’-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3’，下游引物YGAS为5’-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3’，利用RT-PCR克隆获得到1003bp的基因片段，将该片段克隆到PGEM-T easy载体上测序，得到的基因命名为SlGRX1；

番茄CGFS类蛋白是具有权利要求1所述植物谷氧还蛋白基因SlGRX1编码的如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与其氨基酸序列至少60％同源性。

植物谷氧还蛋白基因SlGRX1用于经转基因或杂交育种改良植物的抗氧化、干旱及盐碱的能力。

本发明与现有技术相比具有的优点：

1)采用同源克隆及电子克隆的方法从番茄中克隆到一个新的谷氧还蛋白基因，克隆方法简单、高效。

2)通过利用基因的下调和上调表达2种方法分析基因的功能，数据更为确凿可信，通过2种方法均证明该基因具有抗氧化、干旱及盐碱的功能，具有很强的理论研究及应用研究价值。可以通过外源基因导入技术过量表达SlGRX1基因来提高植物对氧化、干旱及盐碱的能力，从而增强作物对逆境的抗性，提高作物的产量与品质。

附图说明

图1是SlGRX1基因的组织表达特异性；

图2是SlGRX1蛋白的亚细胞定位；

图3是SlGRX1基因沉默番茄与对照植株对氧化胁迫的反应。A：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株叶盘在H₂O₂胁迫下0d和5d时的症状表现；B：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株叶盘的相对叶绿素含量随时间变化；C：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株中SlGRX1基因的表达情况；

图4是SlGRX1基因沉默番茄与对照植株对干旱的反应。A：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株在干旱处理0d和6d时的表型；B：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株叶片的相对含水量；C：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株中SlGRX1基因的表达情况；

图5是SlGRX1基因沉默番茄与对照植株对盐碱的反应。A：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株在NaCl处理0d和10d时的表型；B：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株叶盘的相对叶绿素含量；C：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株中SlGRX1基因的表达情况；

图6是转SlGRX1基因拟南芥及对照对氧化、干旱及盐碱的抗性。A：转基因拟南芥及对照对氧化、干旱及盐碱胁迫的反应；B：转基因拟南芥及对照在各种胁迫条件下的根长。

具体实施方式

实施例1番茄谷氧还蛋白基因的克隆

根据拟南芥和水稻的CGFS类谷氧还蛋白基因，根据保守的同源序列设计了一对简并引物，上游引物T1为：5’-SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3’，下游引物T2为：5’-ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3’，其中，W代表T或者A，S代表G或者C，M代表A或者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T。经RT-PCR扩增、测序，通过与NCBI等网上数据库进行同源性比对证明得到的片段为为番茄的谷氧还蛋白基因。以该片段为种子序列，采用电子克隆的方法，在番茄的EST数据库中进行延伸拼接，根据延伸的序列设计引物，上游引物YGS2为：5’-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3’，下游引物YGAS为：5’-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3’。利用RT-PCR技术获得到1003bp的片段，序列如SEQ ID NO：1所示。序列分析表明该基因是一个新的谷氧还蛋白基因，具有完整的开放阅读框，编码如SEQ ID NO：2所示292个氨基酸。该基因是第一个从番茄中克隆到的谷氧还蛋白基因，将该基因命名为SlGRX1。将基因序列提交到Genbank进行BLAST比对表明SlGRX1是一种新的谷氧还蛋白基因。由SlGRX1编码的蛋白质的剩余部分与任何已知序列无高度同源。

实施例2SlGRX1基因的特性及功能分析和应用：

1.SlGRX1基因的组织表达特性分析

为了分析该基因在番茄体内的表达情况，分别用TRIzol试剂提取番茄的叶片、根、茎及花瓣中的总RNA，反转录成cDNA，利用quantitative real time RT-PCR分析SlGRX1在番茄体内不同组织的表达情况，引物5’-ATGCGAGCATCGTTGTTGC-3’/5’-TCTATCTGGCTCCTCAACCACAC-3’用来扩增目标SlGRX1基因；引物5’-CACGAGGTATAATCTAGGGTTTG-3’/5’-ATTTTGTCAGGGTTGTATCCTAC-3’用来扩增番茄的内参基因EF-1-α。分析结果表明，在检测的组织中，均检测到了该基因的表达，其中叶片中的表达量最高，根中的表达量最低(见图1).

2.SlGRX1蛋白的亚细胞定位

将SlGRX1基因构建到植物表达载体pCHF3并融合到GFP的C端，将该质粒转化到农杆菌菌株EHA105中。用PCR技术筛选阳性克隆，将阳性的农杆菌活化至OD₆₀₀为0.2-0.8，浸润4叶期的本氏烟叶片，48小时后在共聚焦显微镜下观察GFP的表达情况。结果表明，空载体中的GFP蛋白多在细胞质和细胞核的周围，并没有进到细胞核内，而GFP:SlGRX1的融合蛋白则分布在细胞质和细胞核中，因此可以断定SlGRX1蛋白能定位在植物的细胞核和细胞质中(见图2)。

3.SlGRX1基因的功能分析及应用

利用中国番茄黄花曲叶病毒即TYLCCNV的卫星DNAmβ沉默载体及其辅助病毒TYLCCNV在番茄中沉默了SlGRX1基因，在番茄中沉默了SlGRX1基因，用接种空载体的番茄作为对照，对沉默的植株及对照进行抗逆性分析，包括其对氧化、干旱及盐碱的抗性测定。采用叶盘法检测番茄沉默SlGRX1基因后对氧化胁迫的抗性，将SlGRX1基因沉默的植株及对照的叶盘剪下，放在添加20mM的H₂O₂的MS培养基中，5天后观察SlGRX1基因沉默的植株与对照的差异，检测结果表明：SlGRX1基因沉默的番茄叶绿素降解的更快，叶盘很快由绿色变成黄色，而对照叶盘表现出更强的保持叶绿素的能力(见图3A)，相对叶绿素含量测定表明，SlGRX1基因沉默的植株的叶绿素明显低于对照处理(见图3B)，表明SlGRX1基因对于植物抗氧化胁迫是必须的。

干旱处理将SlGRX1基因沉默的植株及对照植株浇透水后停止浇水进行干旱处理，干旱6天后SlGRX1基因沉默的植株叶片表现出萎蔫症状，而对照植株仍然正常生长(见图4A)，植物相对含水量(RWC)测定表明SlGRX1基因沉默的植株明显低于对照植株(见图4B)。这些分析表明SlGRX1基因对植物的抗旱反应有重要的调控作用。

高盐胁迫是在番茄SlGRX1基因沉默后，用400mM的NaCl浇灌SlGRX1基因沉默的番茄及对照植株，每3天一次，在胁迫处理的第10天，SlGRX1基因沉默的植株叶片开始萎蔫变黄，植株停止生长，表现出典型的盐胁迫症状，对照植株在10天后依然正常生长，叶片表现为绿色(见图5A)。盐胁迫改变了植物叶片的叶绿素含量，经盐处理后SlGRX1基因沉默的植株叶片的叶绿素含量明显低于对照(见图5B)。这些结果表明，SlGRX1基因对于植物的抗盐胁迫是必须的，在抗盐过程中起重要的调控作用。

为了进一步分析SlGRX1基因的功能以及在植物基因工程中的应用，我们将该基因转化到拟南芥中，分析异源表达该基因是否能提高其他植物的抗氧化、干旱及盐碱的能力。转基因的和对照拟南芥种子用双蒸水浸泡30分钟后用95％乙醇浸泡5分钟，再用20％次氯酸钠漂白7分钟，最后用双蒸水洗涤5次。种子于4℃春化处理48小时后放到25度培养箱中发芽培养。培养7天等拟南芥全部发芽后将发芽的苗转移到带有抗性的培养基中进行根的生长胁迫实验，结果见图6，在正常的情况下，转基因的拟南芥和对照的根长的并无明显差异，在胁迫条件下，转基因拟南芥的根长明显高于对照拟南芥，说明外源SlGRX1基因的表达能够增强拟南芥对氧化、干旱及盐碱的抗性。

由这些结果表明，我们克隆的番茄SlGRX1基因具有很高的应用价值。我们可以通过利用该基因对其他作物如拟南芥进行转基因改造，如通过外源导入过表达SlGRX1基因来提高植物对氧化、干旱及盐碱的能力，从而增强作物对逆境的抗性，提高作物的产量与品质。

序列表

SEQ ID NO：1

<110>浙江大学

周，雪平

郭，玉双

吴，建祥

<120>番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1

<130>无

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1003

<212>DNA

<213>Solanum lycopersicum

<400>1

catggcgacc ttcaacatct catttctcac acaacctgcc attttctctt cccaaaatac 60

cccttctttc tcctcatatt cacttcccaa aacctccttt cgcttccctt ccattactct 120

ccgtcccaaa accagaacca ccactcgcca ccatgcgagc atcgttgttg ctgctctgaa 180

aaagctttct gaaacagacc ctttaaccgt gcctctgcag tctgatgaaa tcgctggaag 240

cttcccgaag gaatctggtg tatatgcggt gtatgatact aatggtgatc tccaatttgt 300

tggcatatca cacaacatcg ccgccagtgt tatttcccat aagaattccg cacctcagct 360

ctgctcttcc gttaaggttg gtgtggttga ggagccagat agaaccgcct taactgaatc 420

ttggaaatca tggatggaag aacatattac gaccaatgga aaggtaccac cgggtaatga 480

acctggaaat tcaacatggg tacgtcagcc tccaaagaag aaggctgatc taaggttaac 540

accaggccgt aacgtacagt tgacagtgcc cttgcaggac cttattgacc ggctagtgaa 600

ggaaaacaag gtggttgctt tcattaaagg gtcaagaagt gcaccacaat gcgggttctc 660

acagagagtg gtatccattc tcgaaagtga aggtgttgat tatgaaagta tcgatgtcct 720

tgatgaagag tacaactccg gattgaggga aacgttgaag aactatagta actggcctac 780

atttccacaa atttttgtga agggtgagtt ggttggtgga tgtgatatct tgacttccat 840

gtatgagaag ggtgaacttg ccagcttgtt caaaagctaa aaatgtttta attagcagta 900

aaaagtgtaa gctttattgt gagaattaca tttctttgaa cttatttact catcagtgta 960

ttggtattgt ggaaatagtg caatagtttg aagaaaattc att 1003

SEQ ID NO：2

<130>无

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>292

<212>PRT

<213>Solanum lycopersicum

<400>1

Met Ala Thr Phe Asn Ile Ser Phe Leu Thr Gln Pro Ala Ile Phe Ser

1 5 10 15

Ser Gln Asn Thr Pro Ser Phe Ser Ser Tyr Ser Leu Pro Lys Thr Ser

20 25 30

Phe Arg Phe Pro Ser Ile Thr Leu Arg Pro Lys Thr Arg Thr Thr Thr

35 40 45

Arg His His Ala Ser Ile Val Val Ala Ala Leu Lys Lys Leu Ser Glu

50 55 60

Thr Asp Pro Leu Thr Val Pro Leu Gln Ser Asp Glu Ile Ala Gly Ser

65 70 75 80

Phe Pro Lys Glu Ser Gly Val Tyr Ala Val Tyr Asp Thr Asn Gly Asp

85 90 95

Leu Gln Phe Val Gly Ile Ser His Asn Ile Ala Ala Ser Val Ile Ser

100 105 110

His Lys Asn Ser Ala Pro Gln Leu Cys Ser Ser Val Lys Val Gly Val

115 120 125

Val Glu Glu Pro Asp Arg Thr Ala Leu Thr Glu Ser Trp Lys Ser Trp

130 135 140

Met Glu Glu His Ile Thr Thr Asn Gly Lys Val Pro Pro Gly Asn Glu

145 150 155 160

Pro Gly Asn Ser Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Lys Lys Lys Ala Asp

165 170 175

Leu Arg Leu Thr Pro Gly Arg Asn Val Gln Leu Thr Val Pro Leu Gln

180 185 190

Asp Leu Ile Asp Arg Leu Val Lys Glu Asn Lys Val Val Ala Phe Ile

195 200 205

Lys Gly Ser Arg Ser Ala Pro Gln Cys Gly Phe Ser Gln Arg Val Val

210 215 220

Ser Ile Leu Glu Ser Glu Gly Val Asp Tyr Glu Ser Ile Asp Val Leu

225 230 235 240

Asp Glu Glu Tyr Asn Ser Gly Leu Arg Glu Thr Leu Lys Asn Tyr Ser

245 250 255

Asn Trp Pro Thr Phe Pro Gln Ile Phe Val Lys Gly Glu Leu Val Gly

260 265 270

Gly Cys Asp Ile Leu Thr Ser Met Tyr Glu Lys Gly Glu Leu Ala Ser

275 280 285

Leu Phe Lys Ser

290

Claims

1.一种植物谷氧还蛋白基因SlGRX1，其特征在于具有如SEQ ID NO：1所示1003个碱基DNA序列，编码具有抗氧化、干旱及盐碱能力的CGFS类的谷氧还蛋白。

2.一种如权利要求1所述植物谷氧还蛋白基因SlGRX1的克隆方法，其特征在于包括下列步骤：

3)以上述扩增的基因片段为种子序列，采用电子克隆的方法，在番茄的EST数据库中进行电子延伸拼接，根据延伸的序列设计引物，上游引物YGS2为5’-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3’，下游引物YGAS为5’-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3’，利用RT-PCR克隆获得到1003bp的基因片段，将该片段克隆到PGEM-T easy载体上测序，得到的基因命名为SlGRX1。

3.一种番茄CGFS类蛋白，其特征在于，具有权利要求1所述植物谷氧还蛋白基因SlGRX1编码的如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与其氨基酸序列至少60％同源性。

4.一种如权利要求1所述植物谷氧还蛋白基因SlGRX1的用途，其特征在于用于经转基因或杂交育种改良植物的抗氧化、干旱及盐碱的能力。