CN114907465A - 水稻孕穗期耐冷性相关的OsLEA9蛋白及其相关生物材料与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供调控基因表达的物质在调控水稻孕穗期耐冷性中的应用或在制备调控水稻孕穗期耐冷性产品中的应用，所述基因编码OsLEA9蛋白。本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除了水稻OsLEA9基因，获得了孕穗期耐冷性明显提高的水稻新种质。本发明提高了水稻孕穗期耐冷性，创新了水稻耐冷种质资源，对新品种培育、环境卫生和粮食安全具有重要意义，具有重大的应用推广价值。

Description

水稻孕穗期耐冷性相关的OsLEA9蛋白及其相关生物材料与 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中水稻孕穗期耐冷性相关的OsLEA9蛋白及其相关生物材料与应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)起源于热带和亚热带地区，是世界上超过一半人口的主要粮食作物，在其整个发展过程中对冷胁迫很敏感。低温不仅影响水稻植株的生长发育，也是限制水稻生产和地理分布的主要环境因素之一。在全球极端天气事件频繁发生的背景下，种植在高纬度和高海拔等低温地区的水稻在生殖阶段将更频繁的遭遇低温冷害。因此，尤其是在高纬度和高海拔地区，生殖阶段的低温胁迫已成为水稻生产的主要限制因素。

水稻低温冷害主要指水稻遭遇连续或短期低温最低临界温度以下的低温影响，从而使水稻生育延迟，严重时还造成营养或生殖器官遭到破坏，从而导致水稻不能正常发育而减产的现象。水稻在全生育期都容易遭遇低温冷害。根据低温发生的时期，可以分为营养生长期(萌发期和幼苗期)冷害、生殖生长期(孕穗期和开花期)冷害。营养生长期的冷胁迫往往导致幼苗成活率低，幼苗生长缓慢，分蘖减少；生殖生长期冷害是指水稻从生殖生长开始到开花期间受到外界环境的低温胁迫，最终导致花粉发育不正常、花药不能正常裂开散粉、散落到柱头上的花粉不能正常地萌发受精继而影响正常开花授粉形成空粒的现象。由于孕穗期和开花期冷害的发生时期十分接近，生产实际中有时较难将两者严格分开来，常将两者合称为孕穗开花期冷害。这其中因孕穗期时遭遇的冷害将会对产量造成不可逆的损失而显得尤为重要。

因此，孕穗期冷害是影响水稻产量最严重的时期，对水稻孕穗期耐冷性研究具有十分重要的意义。但是利用传统育种方法培育耐冷水稻品种周期长，进展比较缓慢，而利用基因工程技术可以直接在基因水平上改造植物的遗传背景，定向改造植物的遗传性状。发掘水稻孕穗期耐冷基因对培育耐冷水稻新品种具有十分重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控水稻孕穗期耐冷性。

本发明提供了调控基因表达的物质在调控水稻孕穗期耐冷性中的应用或在制备调控水稻孕穗期耐冷性产品中的应用，所述基因编码OsLEA9蛋白，所述OsLEA9蛋白是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有75％以上的同一性且具有调控水稻孕穗期耐冷性活性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由93个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可来源于水稻。

上述应用中，蛋白质的同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，蛋白质所述75％以上的同一性可为至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。

上述应用中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等，部分可用标签的氨基酸序列见表1。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述应用中，所述基因为编码OsLEA9蛋白的核酸分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述应用中，所述基因可为编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。

上述应用中，所述调控基因表达的物质为下述F1、F2或F3中的任一种：

F1、靶向所述基因的sgRNA、siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA；

F2、产生靶向所述基因的sgRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的siRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的shRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的miRNA的DNA分子或产生靶向所述基因的反义RNA的DNA分子；

F3、产生靶向所述基因的sgRNA的表达载体、产生靶向所述基因的siRNA的表达载体、产生靶向所述基因的shRNA的表达载体、产生靶向所述基因的miRNA的表达载体或产生靶向所述基因的反义RNA的表达载体。

为了解决上述技术问题，本发明提供了提高水稻孕穗期耐冷性的试剂，所述试剂的活性成分为上述调控基因表达的物质。

上述试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据水稻孕穗期的耐冷效果确定。

为了解决上述技术问题，本发明的还提供一种提高水稻孕穗期的耐冷性的方法，包括如下步骤：抑制受体水稻中所述OsLEA9蛋白的表达、降低所述OsLEA9蛋白的丰度、和/或敲除编码所述OsLEA9蛋白的基因，得到孕穗期的耐冷性高于所述受体水稻的目的水稻。

上述方法中，所述抑制受体水稻所述OsLEA9蛋白的表达、降低所述OsLEA9蛋白的丰度、和/或敲除编码所述OsLEA9蛋白的基因可通过CRISPR/Cas9系统实现，所述CRISPR/Cas9系统包括表达含有Cas9和sgRNA质粒，所述sgRNA的靶序列可为序列表中SEQ ID No.2的第180-200位(共21bp)。

本发明还提供所述OsLEA9蛋白。

本发明还提供与所述OsLEA9蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

本发明提供调控基因表达的物质在调控水稻孕穗期耐冷性中的应用或在制备调控水稻孕穗期耐冷性产品中的应用，所述基因编码OsLEA9蛋白。本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除了水稻OsLEA9基因，获得了孕穗期耐冷性明显提高的水稻新种质。本发明提高了水稻孕穗期耐冷性，创新了水稻耐冷种质资源，对新品种培育、环境卫生和粮食安全具有重要意义，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为本发明实施例中孕穗期材料处理的三个环境示意图。

图2为本发明实施例1中4个粳稻品种昆明小白谷(KMXBG)、丽江小黑谷(LJXHG)、十和田(Towada)及日本晴(Nip)低温处理4d穗部表型和花粉育性及对应的统计结果。图2的a图为低温处理(右侧)和正常对照(左侧)后4个材料的穗部照片。图2的b图为低温处理(下方)和正常对照(上方)后4个材料的花粉碘染照片。图2的c、d图分别为为结实率和花粉育性柱状图，图中不同小写字母表明不同品种的结实率间存在差异显著，CS-HAA为高海拔地区冷处理、CS-PT为人工气候室冷处理、CS-DW为深冷水灌溉处理。

图3为本发明实施例1中OsLEA9的关联分析区间结果、区间内候选基因的转录组数据(Log2FC)及组织表达热图。

图4为本发明实施例1中OsLEA9在Nip不同组织中的表达模式分析图，内参为OsActin1基因。幼穗1、3、5、7、10、15分别表示长度为1cm、3cm、5cm、7cm、10cm、15cm的穗子。

图5为本发明实施例1中OsLEA9在KMXBG和Nip穗部冷诱导下表达模式分析图，内参为OsActin1基因。

图6为本发明实施例2中测序鉴定T0代OsLEA9敲除植株示意图。

图7为本发明实施例2中OsLEA9敲除纯合植株及对照植株在冷水灌溉处理、人工气候室冷处理后表型和相对结实率统计图。图7的a图为表型照片，图的b图为相对结实率统计图。图中不同小写字母表明不同品种的结实率间存在差异显著，CS-PT为人工气候室冷处理、CS-DW为冷水灌溉处理。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的水稻品种昆明小白谷(KMXBG)、丽江小黑谷(LJXHG)、十和田(Towada)均记载于非专利文献“戴陆园等.云南稻种昆明小白谷耐冷性指标性状的遗传分析.中国水稻科学,1999,13(2):73-76.”，公众可以从中国农业大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的根癌农杆菌EHA105菌株记载于非专利文献“高世武等.影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究.热带生物学报.2012年3月第3卷第1期”，公众可以从中国农业大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

下述实施例采用Excel统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Duncant’s检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

实施例1、OsLEA9基因的获得

1、OsLEA9基因的获得

本研究中，挑选了4份在孕穗期耐冷存在显著差异的粳稻材料，具体为昆明小白谷(以下简称KMXBG)、丽江小黑谷(以下简称LJXHG)、十和田(以下简称Towada)和日本晴(以下简称Nip)。

共设置了三种耐冷性鉴定方法(图1)，具体为：

冷水灌溉处理(CS-DW)：将正常条件下(北京市中国农业大学上庄实验站)在大田生长至孕穗期的水稻以50cm深冷水池(水温16～17℃)灌溉处理7天。

人工气候室冷处理(CS-PT)：将正常条件下(北京市中国农业大学上庄实验站)在大田生长至孕穗期的水稻移至人工气候室16～17℃处理4天。

高海拔地区冷处理(CS-HAA)：将水稻直接种植在高海拔地区(云南昆明)进行自然低温胁迫处理，计算结实率对耐冷行进行评估。

对照：正常条件下在大田生长至孕穗期的水稻不进行低温胁迫。

每个材料每种处理环境下重复15株。

在北京，胁迫结束后，将参试材料复种到(北京市中国农业大学上庄实验站)大田，恢复水稻生长，成熟后考察主穗的结实率，进行表型鉴定，统计相对结实率：

相对结实率＝处理后的结实率/正常条件下结实率×100％

在高海拔低温地区(云南昆明)，分别计算15株单株绝对结实率，求平均值：

绝对结实率＝实粒数/总粒数×100％

表型鉴定结果见图2，表明KMXBG和LJXHG孕穗期耐冷性显著高于Towada和Nip。

将正常条件下生长至孕穗期的4种水稻材料移栽至16～17℃的人工气候室内处理4天，对照为处理0h。随后分别取低温处理0h及4d的穗子进行转录组测序，获得一系列差异表达基因。此外，在之前的研究中，发明人利用580个水稻品种，通过全基因组关联分析(GWAS)鉴定了156个孕穗期耐寒性关联区段。其中1号染色体上的qCTB1e区域在两个群体(HAA-5d-group和HAA-full)中检测到，表明qCTB1e是生殖阶段一个稳定且主要的耐冷相关位点。根据RAP-BD(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)及局部连锁不平衡(LD)分析显示，qCTB1e在HAA-5d和HAA-Full群体中分别对应342kb和365kb的区间，两个区间共包含21个预测基因(不包括转座子和逆转录转座子)(图3)。通过与转录组数据比对，发现21个基因中有10个被低温诱导:Os01g0314000，Os01g0314800，Os01g0315800，Os01g0316100，Os01g0316600，Os01g0318400，Os01g0312800，Os01g0313300，Os01g0316900和Os01g0319000。根据水稻基因组注释，与其他基因相比，Os01g0314800在花药和幼穗中的表达量最高(图3)，其表现出与孕穗期耐冷基因CTB4a、LTT1和CTB2相似的组织表达模式。因此推测Os01g0314800可能是qCTB1e的候选基因。OsLEA9基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2，其编码的蛋白为OsLEA9，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

2、OsLEA9基因的表达模式

正常处理：取Nip正常种植条件下不同组织的样品，包括根、茎、成熟叶、叶鞘、及1cm、3cm、5cm、7cm、10cm、15cm穗。取样后用液氮速冻，-80℃保存备用。

低温胁迫处理：将正常条件下生长至孕穗期的KMXBG和Nip移栽至16-18℃的人工气候室内，分别取处理0h、2h、4h、8h、16h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d时的穗部样品，液氮速冻，-80℃保存备用。

提取上述各种处理的样品取总RNA，利用反转录酶M-MLV反转录合成cDNA第一链，以该cDNA第一链为模板，采用引物进行实时定量分析，以OsActin1为内参基因。OsLEA9扩增引物组由qRT-OsLEA9-F和qRT-OsLEA9-R组成，OsActin1扩增引物引物组由Actin1-F和Actin1-R组成。序列如下：

OsLEA9扩增引物：

qRT-OsLEA9-F:5’-GAGGGCGGACGAGAAGAAG-3’；

qRT-OsLEA9-R:5’-ATCCTCTTGGAGTTGGAGAGC-3’。

OsActin1扩增引物：

Actin1-F:5’-CACAGGTATTGTGTTGGACTCTG-3’；

Actin1-R:5’-AGTAACCACGCTCCGTCAGG-3’。

实验设三次重复。

OsLEA9组织表达模式如图4，可以看出，OsLEA9基因是一个在不同组织中均表达的基因，尤其在根、成熟叶片、叶鞘以及10-15cm穗中表达丰度较高。

OsLEA9冷诱导表达分析如图5，可以看出，在KMXBG和Nip中均受到低温诱导，说明OsLEA9基因是一个与低温胁迫相关的基因，且在孕穗期低温敏感材料Nip中受低温诱导显著高于耐冷亲本KMXBG。

实施例二、OsLEA9基因的功能验证

1、OsLEA9敲除载体构建

通过网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html得到设计靶点，具体靶点序列为SEQ ID No.2的第180-200bp位核苷酸序列(共21bp)。

sgRNA的编码DNA为GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAG

GCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC

以稀释100倍的载体pCBC-MT1T2为模板进行四引物PCR扩增。所用引物如下：

OsLEA9-MT1-BsF:5’-ATATATGGTCTCTGGCGGGTGACCGGGTACTACCGGCGTT-3’；

OsLEA9-MT1-F0:5’-TGGGTGACCGGGTACTACCGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；

OsLEA9-MT2-R0:5’-AACACAAAGGAGGGGTTACTCGGCGCTTCTTGGTGCC-3’；

OsLEA9-MT2-BsR:5’-ATTATTGGTCTCTAAACACAAAGGAGGGGTTACTCGGC-3’；

OsLEA9-MT1-BsF/OsLEA9-MT2-BsR为正常引物浓度；OsLEA9-MT1-F0/OsLEA9-MT2-R0稀释20倍。

四引物PCR扩增获得PCR产物，回收纯化。以BsaI为酶切位点，将纯化的PCR产物按以下步骤进行酶切-连接反应：PCR纯化产物2ul，载体pBUE4112 ul，10×NEB T₄ Buffer1.5ul，10×Caster Buffer 1.5ul，BsaI(NEB)2ul，T4 Ligase(NEB)1ul，ddH₂O6ul，经37℃5h，50℃5min，80℃10min进行酶切-连接。经过PCR单克隆检测(以OsU3-FD3和TaU3-RD组成检测引物对，目标条带大小831bp)，并引物OsU3-FD3和TaU3-FD2进行测序。具体引物的序列如下：

OsU3-FD3:5’-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3’；

TaU3-RD:5’-CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC-3’；

TaU3-FD:5’-TTAGTCCCACCTCGCCAGTTTACAG-3’；

TaU3-FD2:5’-TTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTG-3’。

测序结果确定获得的重组载体上存在OsLEA9的敲除靶点，最终获得OsLEA9基因的定点敲除载体，定名为pBUE411-OsLEA9。

2、OsLEA9敲除转基因水稻的获得

将上述制备的带有OsLEA9敲除靶点的重组载体pBUE411-OsLEA9经冻融法转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌EHA105/pBUE411-OsLEA9，用于侵染转基因受体Nip的愈伤。

采取经典的农杆菌介导的愈伤侵染方法侵染Nip，得到转基因水稻，提取其基因组DNA，用由F和R组成对鉴定引物对进行扩增：

F：5’-ATGGAGAGGGTTGCATCGAG-3’；

R：5’-AGAGGATGGCTGCCAACTGA-3’。

扩增得到282bp的PCR产物，与野生型Nip进行序列比对，靶点及附近核苷酸序列有插入、缺失或替换的为阳性T0代转OsLEA9水稻，序列没有变化的植株为阴性。

鉴定阳性T0植株，并种植收种得到T1代种子，连续自交收至得到T3代转OsLEA9水稻株系。提取T3代转OsLEA9水稻株系的基因组DNA，以上述F和R组成对鉴定引物对进行扩增，得到纯合的T3敲除株系，部分样本的鉴定结果如图6所示(oslea9-1、oslea9-2)。

株系oslea9-1为在基因OsLEA9的核苷酸序列SEQ ID No.2中第182位和第183位之间插入了一个核苷酸A或T，导致编码蛋白OsLEA9时发生移码，不能编码蛋白OsLEA9，得到的OsLEA9敲除的纯合株系。

株系oslea9-2为在基因OsLEA9的核苷酸序列SEQ ID No.2中缺失了第194-196位的3个核苷酸CAT，导致编码蛋白OsLEA9时发生移码，不能编码蛋白OsLEA9，得到的OsLEA9敲除的纯合株系。

后续选用纯合的T3代转OsLEA9水稻株系oslea9-1和oslea9-2进行耐冷鉴定实验。

3、转OsLEA9水稻的耐冷性鉴定

共设置了三种耐冷性鉴定方法(图1)，其中OsLEA9耐冷性鉴定采用两种方法，分别是孕穗期大田(CS-DW)50cm深冷水池(16～17℃)7天，孕穗期人工气候室(CS-PT)16～17℃处理7天鉴定OsLEA9的孕穗期耐冷功能。

选取野生型水稻Nip、T3代转OsLEA9水稻敲除株系oslea9-1、T3代转OsLEA9水稻敲除株系oslea9-2处于孕穗期的主穗挂牌，做上记号。分别进行孕穗期大田(CS-DW)50cm深冷水池(16～17℃)处理7天，以及孕穗期人工气候室(CS-PT)16～17℃处理7天。上述每个材料每种胁迫条件下分别处理15株。

胁迫结束后，将参试材料复种到大田，恢复水稻生长，成熟后考察挂牌主穗的结实率，以正常生长的植株结实率为对照，计算相对结实率：

相对结实率＝处理后的结实率/正常条件下结实率×100％

孕穗期大田50cm深冷水池(16～17℃)处理7天结果如图7所示，可以看出，在大田冷水灌溉7天的胁迫下，敲除株系的相对结实率(64.77％和69.89％)均显著高于Nip(48.45％)。

孕穗期人工气候室16～17℃处理7天结果如图7所示，Nip的相对结实率为37.35％，敲除株系的相对结实率分别为47.81％和54.38％，也是显著高于Nip。

上述结果表明，孕穗期遭遇低温主要影响了结实率的高低，不同方式处理方式下，敲除株系的主穗结实率都显著高于冷敏感亲本Nip，说明基因OsLEA9具有负向调控孕穗期耐性的功能，能够在冷胁迫下降低温度对结实率的影响。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 水稻孕穗期耐冷性相关的OsLEA9蛋白及其相关生物材料与应用

<130> GNCSY220767

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 93

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Glu Arg Val Ala Ser Ser Cys Leu Ser Leu Leu Ala Gln Arg Arg

1 5 10 15

Gly Tyr Ser Val Ala Ala Ala Val Ala Lys Gly Ala Gly Arg Arg Ala

20 25 30

Asp Glu Lys Lys Val Ala Ala Ala Val Ala Lys Arg Thr Met Ala Lys

35 40 45

Ala Ala Glu Glu Lys Thr Ala Trp Val Pro Asp Pro Val Thr Gly Tyr

50 55 60

Tyr Arg Pro Ala Gly Gly Ala Lys Glu Val Asp Ala Ala Glu Leu Arg

65 70 75 80

Ala Lys Leu Leu Ser Asn Ser Lys Arg Met Ala Ala Asn

85 90

<210> 2

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagaggg ttgcatcgag ctgtctcagc cttctggcac aaaggagggg ttactcggtg 60

gcggcggccg tggcgaaggg agccggccgg agggcggacg agaagaaggt ggcggcggcg 120

gtggccaagc gcacgatggc gaaggccgcc gaggagaaga cggcgtgggt gccggacccg 180

gtgaccgggt actaccggcc ggccggcggc gcaaaggagg tggacgcggc ggagctgcgc 240

gccaagctgc tctccaactc caagaggatg gctgccaact ga 282

Claims (9)

1.调控基因表达的物质在调控水稻孕穗期耐冷性中的应用或在制备调控水稻孕穗期耐冷性产品中的应用，其特征在于，所述基因编码OsLEA9蛋白，所述OsLEA9蛋白是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有75％以上的同一性且具有调控水稻孕穗期耐冷性活性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述OsLEA9蛋白来源于水稻。

3.与权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述基因可为编码链的编码序列是SEQID No.2的cDNA分子或DNA分子。

4.与权利要求3所述的应用，其特征在于：权利要求1中所述调控基因表达的物质为下述F1、F2或F3中的任一种：

F1、靶向所述基因的sgRNA、siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA；

F2、产生靶向所述基因的sgRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的siRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的shRNA的DNA分子、产生靶向所述基因的miRNA的DNA分子或产生靶向所述基因的反义RNA的DNA分子；

F3、产生靶向所述基因的sgRNA的表达载体、产生靶向所述基因的siRNA的表达载体、产生靶向所述基因的shRNA的表达载体、产生靶向所述基因的miRNA的表达载体或产生靶向所述基因的反义RNA的表达载体。

5.提高水稻孕穗期耐冷性的试剂，其特征在于：所述试剂的活性成分为权利要求1-4任一中所述的调控基因表达的物质。

6.一种提高水稻孕穗期的耐冷性的方法，其特征在于：包括如下步骤：抑制受体水稻中权利要求1中所述OsLEA9蛋白的表达、降低权利要求1中所述OsLEA9蛋白的丰度、和/或敲除编码权利要求1中所述OsLEA9蛋白的基因，得到孕穗期的耐冷性高于所述受体水稻的目的水稻。

7.根据权利要求6所述的提高水稻孕穗期的耐冷性的方法，其特征在于：所述抑制受体水稻中权利要求1中所述OsLEA9蛋白的表达、降低权利要求1中所述OsLEA9蛋白的丰度、和/或敲除编码权利要求1中所述OsLEA9蛋白的基因通过CRISPR/Cas9系统实现，所述CRISPR/Cas9系统包括表达含有Cas9和sgRNA质粒，所述sgRNA的靶序列为序列表中SEQ ID No.2的第180-200位。

8.权利要求1-4任一中所述的OsLEA9蛋白。

9.与权利要求8所述OsLEA9蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

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