CN116515893A - OsbHLH6基因及其蛋白质在提高作物耐冷性的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体提供一种OsbHLH6基因及其蛋白质在提高作物耐冷性的应用。OsbHLH6基因在提高作物耐冷性中的应用，OsbHLH6基因的CDS区序列如序列表SEQ ID NO.1所示；OsbHLH6基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。通过敲除所述OsbHLH6基因，或者降低所述OsbHLH6基因编码的蛋白质在所述作物中的表达量和/或活性，以提高作物耐冷性。耐冷水稻的培育方法，是通过选定OsbHLH6基因敲除靶点，构建所述OsbHLH6基因的Crispr‑Cas9敲除载体，通过农杆菌介导转化获得突变体，经筛选、培育得到耐冷水稻株系。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种OsbHLH6基因及其蛋白质在提高作物耐冷性的应用。
背景技术
水稻是世界第三大主粮作物，为全世界近一半的人口提供口粮。因其起源于热带和亚热带地区，与其他谷类作物相比，水稻对寒冷胁迫更为敏感。水稻的最适生长温度为25-30℃。当环境温度低于0℃或处于1-15℃时会使水稻发生冻害或冷害。低温胁迫会使水稻的生长发育受抑制、产量减少以及种植区域受限。因此，为了国家的粮食安全和农业可持续发展，水稻对冷胁迫响应的分子基础值得关注与研究。
为了抵御低温胁迫，植物会产生相应的低温响应机制增强低温耐受性。植物响应低温会伴随着一系列的转录过程，导致生理和分子的变化，进而增强植物对低温的抗性。低温胁迫下，转录因子往往可以调控一类或多类关键基因来增强植物抗性。OsDREB1/CBFs是拟南芥低温响应的关键转录因子。OsCBF转录因子在低温胁迫下能结合脱水应答元件，转录激活OsCORs正调控拟南芥抗寒。OsCBF基因也受到上游转录因子OsICE1的调控，共同调控植物的低温响应。OsICE1基因受到上游转录因子的调控，拟南芥和蔷薇中发现R2R2-MYB型转录因子OsMYB108可以转录激活OsICE1、OsCBF3和OsCOR47A基因，可增强植物体内的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性使植株耐寒。OsbHLH家族对于植物响应环境胁迫、增强环境适应能力有重要的作用。OsbHLH002可以通过正调控低温响应因子OsDREB1B和OsHsfA3的表达，并且与OsMAPK2和OsTPP1形成复合调控网络，共同参与调控水稻耐低温胁迫抗性。
水稻耐冷性是由多基因控制的数量性状，遗传基础复杂。但是，目前鉴定到的水稻耐冷关键基因较少，耐冷性调控的分子机制尚不清楚，这成为耐冷水稻分子育种的巨大瓶颈。水稻耐冷基因的鉴定和耐冷机制的解析有利于培育水稻耐冷品系和品种。因此，有必要进一步挖掘水稻耐冷关键基因，解析耐冷性调控的分子机制，为培育耐冷水稻提供理论基础和潜在遗传操作靶点。另外，利用传统育种方法改良水稻耐冷性往往费时费力，而利用基因工程方法通过对水稻耐冷关键主效基因进行利用则有望加快水稻耐冷新品种的培育进程。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供一种OsbHLH6基因及其蛋白质在提高作物耐冷性的应用。
本发明第一目的在于提供一种OsbHLH6基因在提高作物耐冷性中的应用，所述的OsbHLH6基因的CDS区序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明第二目的在于提供一种OsbHLH6基因编码的蛋白质在提高作物耐冷性中的应用，所述蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
优选的，通过敲除所述OsbHLH6基因，或者降低所述OsbHLH6基因编码的蛋白质在所述作物中的表达量和/或活性，以提高作物耐冷性。
优选的，作物为水稻，耐冷性为苗期耐冷性。
优选的，敲除是通过Crispr-Cas9方法靶向敲除所述OsbHLH6基因，获得敲除突变体植株。
优选的，所述靶向敲除的靶位点序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明第三目的在于提供一种耐冷水稻的培育方法，选定OsbHLH6基因敲除靶点，构建所述OsbHLH6基因的Crispr-Cas9敲除载体，通过农杆菌介导转化获得突变体，经筛选、培育得到耐冷水稻株系。
优选的，靶点的序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
与现有技术相比，本发明能够取得如下有益效果：
（1）提供了一种具有调控水稻苗期耐冷性功能的基因OsbHLH6；
（2）应用所述OsbHLH6或其转基因生物材料可以调控苗期耐冷性，并给出了具体的调控方法，所述基因突变时，水稻耐冷性提高；
（3）本发明为改良水稻品种在不同地域的适应能力和提高作物耐冷性提供了清晰简单、推广性强的技术方案。
附图说明
图1为本发明实施例提供的水稻品种日本晴（Nip）和明恢63（MH63）经6℃处理后OsbHLH6的相对表达量结果。
图2为本发明实施例提供的OsbHLH6超表达载体图谱PJH599。
图3为本发明实施例提供的OsbHLH6突变体载体图谱PJH596。
图4为本发明实施例提供的OsbHLH6突变体载体图谱PJH595。
图5为本发明实施例提供的经6℃低温处理前后OsbHLH6超表达植株、野生型植株和突变体植株表型；其中，A代表处理前，B代表处理后；WT为野生型，cr（cr-1、cr-2）为敲除材料，OE为超表达材料。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
本发明通过对公开数据库比较OsbHLH6家族转录因子在低温下的诱导表达谱发现，与其他成员相比，OsbHLH6对低温响应更加显著，说明OsbHLH6可能在水稻低温响应过程中发挥作用；实验表明，珍汕97（ZS97）品种中的bHLH6转录本对冷胁迫的敏感性高。OsbHLH6基因在珍汕97中的CDS区序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在珍汕97中的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2。
实施例1
OsbHLH6基因冷胁迫诱导实验，具体方法及结果如下：
提取水稻高质量RNA，由一步法反转录获得cDNA，同时去除模板中的gDNA，用于基因表达量的检测。按照试剂盒说明书20微升体系加样，42℃孵育30min，85℃加热5s得到cDNA母液；稀释10倍后作为定量模板工作液使用。
选取籼稻品种明恢63（MH63）和粳稻品种日本晴（Nip），对其分别进行6℃的冷处理，处理时间为24h。采用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）方法用于检测基因相对表达量。体系方法为SYBR Premix Ex TaqII，用荧光定量PCR仪器测定，参数设计如下：95℃，2min；95℃，5s，60℃，30s，40cycles；溶解曲线60℃-95℃（每5s增加0.3℃），95℃，15s；25℃，1min，用2-ΔΔCT方法处理数据。实验中使用的内参基因为（LOC_Os09g39500）。
结果如图1所示，图中“**”表示极显著（pvalue<0.05），即在籼稻品种明恢63（MH63）和粳稻品种日本晴（Nip）中，随着冷处理时间的增加，OsbHLH6表达量显著提高，表明受冷胁迫诱导。
实施例2
OsbHLH6基因超表达载体构建，具体如下：
OsbHLH6_OE是利用Ubi强启动子驱动OsbHLH6表达，在粳稻品种中花11（ZH11）背景下创建的超表达植株。
根据OsbHLH6CDS序列，使用Oligo7软件设计扩增引物：
F：5′-ATGGACGCCGAGATGG-3′；
R：5′-TTAAGCGCAAGAAAGCTTGAGA-3′；
进入载体，在克隆正向引物和反向引物5′端前加入BsaI酶切识别位点和保护碱基agGGTCTCActta和agGGTCTCAggta获得克隆引物。改造载体：利用Gateway体系pDONR207入门载体，在attL1和attL2位点之间加上BsaI酶切位点，得到载体PJG001。基因克隆：以NipcDNA为模板，利用克隆引物进行PCR，纯化后产物通过Golden gate酶切酶连的方式进入PJG001构建成为入门载体。通过与表达载体PJE046做LR反应，获得超表达载体PJH599/PJE046/pH2GW7_Pubi/Os04g23550-1.CDS_NIP（PJH599）。
实施例3
Osbhlh6突变体载体（敲除载体）构建，具体如下：
利用Crispr-Cas9系统在粳稻品种ZH11背景下创建Osbhlh6突变体。
根据OsbHLH6基因cDNA序列设计敲除的靶位点，所用网站为：http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR；靶位点序列为SEQ ID NO.3：5′-gatgatcgacgccttgtcca-3′（SEQ ID NO.3）和SEQ ID NO.4：5′-ggaggagcagcagatgctcc-3′（SEQ ID NO.4）。加入接头，由引物合成公司合成后进行片段扩增，通过Gateway体系LR反应将靶点连接进入实验室载体PJE045_CAS9_QLJ（载体来自瞿礼嘉实验室，记载于论文：JinM，Guo D，Zhang J，et al.Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system[J].Cell Research，2013，23(10)：1233-1236.），将重组载体命名为PJH596/ExC/PJE045/Os04g23550.2_U6a_spacer-2，PJH595/ExC/PJE045/Os04g23550.1_U6_spacer。将构建好的质粒送至擎科测序公司，测序结果用图谱文件比对，连入片段在载体中无碱基突变，证明PJH596和PJH595载体构建成功。
实施例4
用冻融法将超表达载体PJH599和敲除载体PJH596、PJH595分别转入农杆菌EHA105感受态细胞中并以PCR鉴定阳性菌斑。通过含有超表达载体PJH599和敲除载体PJH596、PJH595的农杆菌侵染水稻种子诱导的愈伤组织，以潮霉素抗性筛选愈伤组织，经分化和生根培养获得OsbHLH6转基因植株。
具体的转化过程为：
1、诱导愈伤：剥掉种子颖壳，无菌操作，用75%乙醇浸泡1min，再用0.15% HgCl2浸泡15-25min，用灭菌蒸馏水洗涤5-10次；每瓶培养基接入8-12颗种子，暗培养4-5天诱导愈伤组织的产生。
2、继代：从诱导愈伤组织中，挑淡黄色、颗粒状、干燥且活力强的愈伤组织转入继代培养基中暗培养20d，得到继代愈伤组织。
3、预培养：从继代愈伤组织中，挑取淡黄色、颗粒状、干燥且活力强的愈伤组织转入预培养基中，通常每个皿接种6-8块左右绿豆大小的愈伤，暗培养3d。
4、侵染与共培养：将含有目的基因的农杆菌菌株在含有抗生素的平皿上划线，活化；将划线培养的农杆菌刮入1/2 N6悬浮培养基中，28℃，200rpm摇培30min，直至轻微浑浊（OD600≈0.4）；摇菌同时将预培养的愈伤组织收集到250mL无菌三角瓶中；将农杆菌菌液倒入愈伤组织中，浸泡30min；倒去菌液，先将装有愈伤的三角瓶倒置于无菌的小皿的纸上倒干菌液，再把愈伤铺在无菌大皿的滤纸上，上面盖一张滤纸，用镊子轻压愈伤吸干表面菌液，上下各换四次滤纸，最后在愈伤上盖上一张滤纸，盖好大皿，自然干燥3-4h；将充分干燥的愈伤用勺子均匀的铺到共培养基上，封口胶封口；19℃暗培养3d。
5、水洗、筛选：将共培养后的愈伤组织转移至水洗杯中，倒入灭菌蒸馏水至完全侵没愈伤组织，盖上盖子振荡20-30s，倒掉灭菌蒸馏水。如此重复2-3次。加入灭菌蒸馏水至完全侵没愈伤组织，盖上盖子较剧烈振荡20-30s，静置5min，倒掉灭菌蒸馏水。加入灭菌蒸馏水至完全侵没愈伤组织，盖上盖子较剧烈振荡20-30s，静置10min。倒掉灭菌蒸馏水，加入含500mg/L羧苄青霉素（Carbenicillin，Cn）的灭菌蒸馏水，200rpm摇晃30min。倒去灭菌蒸馏水后，操作同浸染中步骤；干燥愈伤时，每瓶筛选培养基中加入400μL Cn+250μL潮霉素（hygromycin B，Hn）+5mL的50%葡萄糖并倒皿，每瓶培养基倒8个皿，倒皿后应在超净工作台上开盖用无菌风吹1.5-2h，愈伤干燥后，操作同浸染中步骤；暗培养室培养20d（一次筛选S1）；所述的一次筛选S1培养基包括：400μL Cn、250μL Hn、5mL 50%葡萄糖。
6、二次筛选（S2）：从S1培养基上挑选干燥的、没有农杆菌污染的愈伤组织转皿，稀疏地摆放在S2培养基上（每皿接种25到30块愈伤）；暗培养20d，观察是否长出新鲜嫩黄的抗性愈伤，如果还没有抗性愈伤继续转皿做S3。筛选培养基加入的Cn减少到200μL。一般粳稻筛选两次即S2就能长出抗性愈伤；S2筛选培养基包括：200μL Cn、250μL Hn、5mL 50%葡萄糖。
7、分化：挑取淡黄色、致密、干燥、贴着培养基的抗性愈伤小块，每一团只挑一个抗性愈伤，置于分化培养基中，每瓶分化培养基只放三块抗性愈伤，并且距离要远；光培养40d，分化出幼苗（约5-10cm高）后进行生根。
8、生根：将分化出的苗子从分化培养基中拔出，一块愈伤只取一棵，用剪刀剪去过长的叶子和根，接入生根管内，每根管内接入1-2株幼苗；光培养室培养15-20d，等根生长充分后，进行下一步。
9、炼苗：转化幼苗茁状生长后，揭开生根管封口膜，加入一定量自来水，光培养进行炼苗4-7d；炼苗期间，可取小样阳检。将转化幼苗从生根管中轻轻取出，洗净根上的附着培养基，移栽到大田或准备好的面包盒，完成遗传转化过程。
实施例5
以野生型水稻品种中花11（ZH11）及其来源的突变体和超表达植株为实验材料，进行冷处理表型分析；处理方法包括：
1、浸种：选取饱满表面无霉菌黑斑的种子，置于扎孔的羊皮纸袋中，浸水两天，于37℃培养箱培养，每天换水3次；
2、催芽：待两天后露白，仅留少量水，保持种子湿润，37℃培养箱中催芽一天；
3、点种：将种子点种于96孔小黑盒（12*8）中，每个品系3列；
4、培养：将苗放入培养箱培养。培养箱设置参数：光照3000Lx，温度28℃，湿度60%RH，时间16h；光照0Lx，温度28℃，湿度60%RH，时间8h（光照16h、黑暗8h）。清水培养2天，后以水培液培养，每3天更换一次水培液。在培养第三天时，调整苗位置使每盆苗长势一致；
5、冷处理：正常培养14天左右，苗长至三叶一心期；将培养箱参数改为光照3000Lx，温度6℃，湿度60%RH，时间16h；光照0Lx，温度6℃，湿度60%RH，时间8h；处理48h后，恢复至培养箱正常参数设置。
图5示出了低温处理前后各植株表型，其中cr-1通过PJH596转化，cr-2通过PJH595转化；根据图4的试验结果可见，敲除水稻OsbHLH6基因能够显著提高水稻抵御冷害的能力，而超表达OsbHLH6植株冷敏感。因此，OsbHLH6负调控水稻耐冷性，水稻OsbHLH6基因及其编码蛋白和重组载体能够应用于增强作物的耐冷胁迫能力。
应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发明公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本发明公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，根据设计要求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。
Claims (8)
1.OsbHLH6基因在提高作物耐冷性中的应用，其特征在于：所述的OsbHLH6基因的CDS区序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.OsbHLH6基因编码的蛋白质在提高作物耐冷性中的应用，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过敲除所述OsbHLH6基因，以提高作物耐冷性。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：通过降低所述OsbHLH6基因编码的蛋白质在所述作物中的表达量和/或活性，以提高作物耐冷性。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的作物为水稻，所述的耐冷性为苗期耐冷性。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的敲除是通过Crispr-Cas9方法靶向敲除所述OsbHLH6基因，获得敲除突变体植株。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述靶向敲除的靶位点序列如序列表SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
8. 一种耐冷水稻的培育方法，其特征在于：选定OsbHLH6基因敲除靶点，构建所述OsbHLH6基因的Crispr-Cas9敲除载体，通过农杆菌介导转化获得突变体，经筛选、培育得到耐冷水稻株系；所述靶点的序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
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