CN116254294A - 一种增强番茄干旱抗性的培育方法 - Google Patents

一种增强番茄干旱抗性的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强番茄干旱抗性的培育方法，属于生物技术领域。本发明提供了番茄ERF101基因在提高番茄干旱抗性中的应用，所述应用包括：利用生物学技术手段使得番茄ERF101基因功能沉默或缺失，增强番茄植株对干旱胁迫的抗性；所述番茄ERF101基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次公开番茄ERF101基因在调控番茄对抗干旱胁迫方面的用途，通过基因编辑技术缺失ERF101基因功能，可显著增强番茄的干旱抗性，可用于抗旱番茄品种的创制和选育。

Description

一种增强番茄干旱抗性的培育方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种增强番茄干旱抗性的培育方法。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicumL.)是茄科番茄属一年生或多年生草本植物，在全球蔬菜作物栽培中有重要的地位。番茄植株茎叶繁茂，蒸腾作用强，生长所需要的水分多。由于土壤水分供应不足而引起的干旱胁迫直接影响番茄的生长发育和果实产量，严重时甚至生长停滞。伴随着近年来全球气温升高和南方季节性缺水频发，干旱成为制约番茄产量和品质的重要逆境因子之一(王新军等.干旱胁迫对番茄幼苗生理特性的影响.中国瓜菜,2022,6:76-80)。因此，发掘干旱胁迫应答功能基因和解析其分子调控通路对改良番茄抗旱性有重要指导意义。
乙烯响应因子ERF是AP2/ERF家族中的一个亚家族，AP2/ERF家族是根据AP2结构域中六十多个保守的氨基酸残基所定义的转录因子家族，根据核苷酸外显子及氨基酸结构域分析可以进一步划分为AP2、ERF、RAV、Soloist亚家族(Nakano等.Genome-wide analysisof the ERF gene family in Arabidopsis and rice.Plant Physiology,2006,140:411-432)。AP2/ERF转录因子参与植物一系列生长发育过程，并且在生物及非生物胁迫中也发挥重要作用。
前人研究表明ERF转录因子亚家族在多种物种中都可以对环境刺激的胁迫信号做出响应。例如，在马铃薯中沉默StERF3基因可以提高植物对盐胁迫的耐受性，同时增强叶片对稻瘟病的抗性(Tian等.The potato ERF transcription factor StERF3 negativelyregulates resistance to phytophthora infestans and salt tolerance inpotato.Plant and Cell Physiology,2015,56:992-1005)；在拟南芥中AtERF53基因正调控植株对干旱胁迫和盐胁迫的抗性(Hsieh等.Functional characterization of anabiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsisthaliana.Plant Molecular Biology,2013,82:223-237)；在水稻中过表达OsERF48能通过调节下游基因促进根系的生长，从而提高水稻对干旱胁迫的抗性(Jung等.Overexpressionof OsERF48 causes regulation of OsCML16，acalmodulin-like protein gene thatenhancesroot growth and drought tolerance.Plant Biotechnology Journal,2017,15:1295-1308)；在苹果中，过表达MdERF72能提高植株对盐胁迫和低温胁迫的抗性(王佳慧等.苹果乙烯响应因子MdERF72对非生物胁迫的响应.中国农业科学,2019,52:4374-4385)。
AP2/ERF转录因子家族在干旱胁迫中的研究较多，但其研究结果多以正调控为主，AP2/ERF转录因子家族中的负调控因子鲜有报导。探索AP2/ERF转录因子家族中干旱胁迫的负调控因子，并通过CRISPR技术对番茄植株进行基因编辑育种，在不引入外源基因的前提下获得耐旱植株，具有重要的理论和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可调控番茄对抗干旱胁迫的基因，通过基因改造达到提高番茄抗旱性的目的，为培育抗旱番茄品种提供依据。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了番茄ERF101基因在提高番茄干旱抗性中的应用，所述应用包括：利用生物学技术手段使得番茄ERF101基因功能沉默或缺失，增强番茄植株对干旱胁迫的抗性。
所述番茄ERF101基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为933bp，其全基因DNA序列如SEQ ID NO.3所示。所述番茄ERF101基因编码的蛋白为乙烯响应转录因子，由310个氨基酸组成，其序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明研究表明，通过缺失番茄ERF101基因功能，可显著增强番茄植株对干旱胁迫的抗性，可应用到耐旱植株育种当中。
进一步的，所述应用包括：利用基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默技术导致所述番茄ERF101基因的表达降低或缺失，从而获得抗旱性增强的突变体植株。
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得两个突变体株系，突变体中ERF101基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
进一步机理研究表明，所述番茄ERF101基因通过影响植物叶表皮气孔的开闭，调控番茄对干旱胁迫的抗性。所述番茄ERF101基因功能沉默或缺失后，促进番茄植株叶表皮中气孔的关闭，改变植物体内水分的利用，进而降低干旱对细胞的损伤，增强植物对干旱胁迫的抗性。
本发明提供了一种增强番茄干旱抗性的培育方法，包括以下步骤：
(1)在番茄ERF101基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以靶标片段PAM结构前20个碱基为依据，进行引物设计，构建CRISPR/Cas9载体；所述番茄ERF101基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)构建含步骤(1)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；
(3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源Cas9蛋白、且靶标序列发生变异的稳定遗传的纯合突变体株系。
上述方法中，通过对番茄ERF101(基因编号：Solyc12g056590)查找PAM序列，将NGG前的20bp的序列定义为sgRNA，选定位于基因蛋白编码区上且具有高度特异性的sgRNA序列。通过基因编辑技术和组培技术，构建了ERF101基因的CRISPR/Cas9载体，并筛选获得了遗传稳定并且不含外源Cas9蛋白的纯合突变体株系。
进一步地，所述靶标片段PAM结构前20个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述PAM结构为NGG，N代表任意碱基。
进一步地，构建所述CRISPR/Cas9载体的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述番茄的品种可以为并不限于Condine Red。
进一步地，步骤(2)中，构建基因工程菌的宿主菌可以为并不限于GV3101农杆菌。
本发明具备的有益效果：
本发明首次公开番茄ERF101基因在调控番茄对抗干旱胁迫方面的用途，通过基因编辑技术缺失ERF101基因功能，可显著增强番茄的干旱抗性，可用于抗旱番茄品种的创制和选育。
附图说明
图1为实施例2中获得的T1代突变体植株的基因编辑位点；
其中，A为编辑位点示意图；B为测序结果；C为翻译结果；
与未经过基因编辑的普通番茄相比，基因编辑突变体在sgRNA的位置发生碱基缺失。以下将未经过基因编辑的普通番茄称为对照。
erf101#2相较对照缺失两个碱基，erf101#6相较对照缺失一个碱基，均在翻译区提前形成了终止密码，引起了翻译的提前终止。
图2为实施例3中erf101突变体和野生型番茄植株自然干旱处理10d后的植株表型图；
其中，叶片萎蔫程度越高，表示受干旱胁迫损伤越严重。
图3为实施例4中erf101突变体和野生型番茄植株自然干旱处理10d后叶片的相对电导率柱形图；
其中，受干旱胁迫越严重，相对电导率数值越高；对照植株叶片的相对电导率显著高于突变体植株；小写字母a、b、c代表不同植株相对电导率数值之间在5％水平上的差异显著。
图4为实施例5中erf101突变体和野生型番茄植株的叶表皮气孔在含有ABA的气孔缓冲液中处理15min后的变化，气孔表型图及气孔导度的变化；
其中，A：erf101突变体和野生型番茄经处理后的气孔表型图，保卫细胞间的距离越近，气孔导度越低，表示气孔关闭程度越高；B：erf101突变体和野生型番茄经处理后气孔导度的变化，对ABA反应越敏感，气孔导度数值越小；小写字母a、b、c代表不同植株气孔导度数值之间在5％水平上的差异显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种Condine Red，将未经基因编辑的普通番茄作为对照。
实施例1：含特异sgRNA的CRISPR/Cas9载体的构建
在Sol Genomics Network网站https://solgenomics.net/上找到ERF101(Solyc12g056590)基因的DNA序列，其序列如SEQ ID NO.3所示，输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR网站，找出onscore得分高，且GC含量>40％，位于蛋白编码区的一段PAM结构前的20bp碱基序列GCTTATTCTTCGTCCAGCTC(SEQ IDNO.4)。
设计CRISPR引物，如下所示：
CRISPR前引物：gcGGTCTCTATTGaacaaagcaccagtggtctagtg(SEQ IDNO.5)；
CRISPR后引物：
gcGGTCTCTAAACGAGCTGGACGAAGAATAAGCtgcaccagccgggaatcg(SEQ ID NO.6)；
上述引物分别以pBAtC-tRNA质粒为模板进行PCR扩增，产物经普通DNA纯化试剂盒纯化后，用BsaI酶将扩增片段与pHEE401质粒连接，产物42℃转化大肠杆菌涂板，抗性为卡那霉素。
挑单克隆菌落，用pHEE401载体通用前引物M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ IDNO.7)和通用后引物M13-R：GGTATTGGTTTATCTCATCGGAACTGCA(SEQ ID NO.8)，进行PCR验证。
将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含1个sgRNA序列，提质粒后电击入农杆菌GV3101感受态，28℃培养两天后挑斑进行PCR验证，获得可用于构建其CRISPR/Cas9基因编辑材料的农杆菌菌株。
实施例2：erf101突变体材料制备与鉴定
在播种培养基播种已消毒的番茄种子，7天后切子叶。农杆菌侵染法将实施例1制备的最终质粒转化入子叶中，利用植物细胞全能性，获得T0代基因编辑番茄。
T0代基因编辑番茄苗检测：利用CTAB法提取T0代植株的基因组DNA，并以其为模板，在包含sgRNA的DNA序列前后约150-200bp处设计如下引物，进行PCR扩增测序验证：
验苗前引物：ATGTCGGAGATGGTGACGGAG(SEQ ID NO.9)；
验苗后引物：AAGTCAATTCAAACAAACACTAAGT(SEQ IDNO.10)；
所得PCR产物送测序公司测序。测序结果与该段基因原序列利用Snapgene软件进行比对，选取sgRNA序列发生碱基缺失、且测序显示单峰的植株，进行自交繁种，获得T0代的种子。
上述T0代种子种植于生长室中，获得T1代植株。利用上述同样方法检测T1代植株的sgRNA序列碱基编辑情况。同时，利用Cas9基因引物对T1代植株的DNA进行PCR扩增，检测是否含有Cas9序列。选取sgRNA发生变异，且不含Cas9蛋白的T1代植株，确定为基因编辑植株的两个株系，分别命名为erf101#2和erf101#6，其基因编辑位点如图1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。
erf101#2相较对照植株缺失两个碱基，erf101#6相较对照植株缺失一个碱基。均在翻译区提前形成了终止密码，引起了翻译的提前终止。
上述两个株系T1代种子播种后，获得不含外源基因Cas9，且sgRNA发生变异的稳定遗传的T2代植株。
以下实施例均以上述两个纯合株系T2代植株作为材料进行实验。
实施例3：erf101突变体的抗旱性研究
番茄种子经55℃温汤浸种15min后置于28℃，200rpm摇床催芽2-3d，每12h换一次水。露白后播种于36孔穴盘中，置于人工气候室培养。人工气候室温度为25/20℃(昼/夜)，光周期为12h光照/12h黑暗，光强为200μmol m-2s-1。在番茄幼苗长出一片真叶时，将幼苗移栽到种植钵中，每3d浇灌适量Hoagland营养液。
在番茄幼苗生长至四叶一心时，挑选健康且大小相近的植株，随机分为2组。对照组正常浇水，实验组开始控水以进行自然干旱处理，并置于人工气候室处理10d后观察植株干旱损伤情况。
结果如图2所示，对比野生型番茄，erf101突变体的干旱抗性显著提高。番茄植株在自然干旱10d后，erf101突变体植株叶片的萎蔫程度显著低于野生型，表示其受干旱胁迫损伤低于野生型。
实施例4：erf101突变体和野生型番茄叶片相对电导率的测定
erf101突变体和对照番茄自然干旱处理10d后，取相同叶位叶片，混合均匀后剪成均匀条状，称取0.2g置于已加入20ml ddH2O的50ml离心管内，使超纯水完全浸没叶片，每个处理取4个重复。将上述样品置于28℃摇床，200rpm摇晃1-2h，用数显电导仪(DDS-11A数显电导仪，杭州奥立龙仪器有限公司)测定数值EC1。然后将样品放在水浴锅中，95℃水浴15-20min，冷却到室温后测得全电导率数值EC2。按照下列公式计算相对电导率。
REL(％)＝EC1/EC2*100％
结果如图3所示，番茄植株在自然干旱处理10d后，野生型植株和erf101突变体植株叶片的相对电导率均显著高于对照组，说明干旱使植株叶片的细胞膜产生了不同程度的损伤；其中erf101突变体植株叶片的相对电导率显著低于野生型，说明其细胞膜损伤程度显著低于野生型，表现出更强的干旱抗性。
实施例5：erf101突变体和野生型番茄叶表皮气孔导度的测定
配制气孔缓冲液：30mM KCl，10mM MES，pH 6.15。
正常培养在人工气候室的erf101突变体和对照番茄，取相同叶位叶片，用镊子撕取叶背面叶表皮，使其漂浮在气孔缓冲液中，在200μmol m-2s-1PPFD光照强度下孵育1h使气孔完全打开。然后将叶表皮随机分为两组，分别转移到含有和不含10μM ABA的气孔缓冲液中，在200μmol m-2s-1PPFD光照强度下孵育15min。然后用配备数码相机的光学显微镜(Leica，Wetzlar，Germany)和图像分析软件ImageJ测量最终的气孔导度。
结果显示，相比于野生型番茄，erf101突变体植株的叶表皮气孔对ABA的反应更敏感。erf101突变体和野生型番茄的叶表皮气孔经ABA处理后，erf101突变体的气孔关闭程度明显高于野生型(图4A)；经过量化，erf101突变体的气孔导度显著小于野生型(图4B)，说明erf101突变体在干旱胁迫中水分散失更为缓慢。

Claims (10)

1.番茄ERF101基因在提高番茄干旱抗性中的应用，其特征在于，所述应用包括：利用生物学技术手段使得番茄ERF101基因功能沉默或缺失，增强番茄植株对干旱胁迫的抗性；所述番茄ERF101基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述番茄ERF101基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默技术导致所述番茄ERF101基因的表达降低或缺失，从而获得抗旱性增强的突变体植株。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述突变体植株中ERF101基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述番茄ERF101基因功能沉默或缺失后，促进番茄植株叶表皮中气孔的关闭，增强番茄植株对干旱胁迫的抗性。
6.一种增强番茄干旱抗性的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在番茄ERF101基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以靶标片段PAM结构前20个碱基为依据，进行引物设计，构建CRISPR/Cas9载体；所述番茄ERF101基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)构建含步骤(1)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；
(3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源Cas9蛋白、且靶标序列发生变异的稳定遗传的纯合突变体株系。
7.如权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述靶标片段PAM结构前20个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.如权利要求7所述的培育方法，其特征在于，构建所述CRISPR/Cas9载体的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
9.如权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述番茄的品种为Condine Red。
10.如权利要求6所述的培育方法，其特征在于，步骤(2)中，构建基因工程菌的宿主菌为GV3101农杆菌。
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