CN116286877A - 一种油菜基因BnNAC022及其应用 - Google Patents

一种油菜基因BnNAC022及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种油菜基因BnNAC022及其应用，涉及植物基因工程技术领域，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，本发明通过构建重组质粒并将油菜基因BnNAC022作为目的基因导入十字花科植物基因组中，发现过量表达该基因可提高十字花科植物的抗虫性，表明油菜基因BnNAC022参与了十字花科植物的抗虫性调控，本发明基因的发现可为作物育种提供基因资源。

Description

一种油菜基因BnNAC022及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种油菜基因BnNAC022及其应用。
背景技术
目前虫害是影响菜籽产量的重大问题之一，给农业生产带来巨大经济损失，而应对虫害的防治方法主要分为化学防治、生物防治、物理防治和农业防治等传统方法，其中，农业防治因其以农业生态系统的总体观念为出发点，是目前重要的虫害防治手段，它的目标是作物增产、改善农田环境、选择合适农作物品种、创造适宜农作物生长而不利于害虫生存生长的环境，从而把害虫密度控制在经济损失允许的范围内，在与害虫长期的“竞赛和对抗”中，植物已经进化出多种多样的手段和机制来抵御虫害，在生产实际中，利用抗虫品种以及加强植物防御体系是最环保、最经济可行的防虫方法之一。
NAC转录因子是一个复杂的植物特异性家族，是植物中第四大转录因子家族，广泛存在于多种物种中，NAC转录因子可参与调控植物生长发育的许多生物学过程，包括对外界胁迫的响应、花器官形成、器官边界和植物形态的建立、次生细胞壁增厚、茎根顶端分生组织形成、侧根发育、纤维发育、衰老调控和果实发育，此外，越来越多的研究表明，NAC转录因子在果实成熟过程中也起着重要的调节作用，尽管NAC转录因子最初是因其在植物发育中的功能而被发现的，但其在植物应对各种胁迫(包括非生物和生物胁迫)中的作用也受到越来越多的关注，然而，目前油菜中鲜有NAC转录因子响应虫害胁迫并参与抗虫的机制报道，NAC转录因子调控油菜抗虫的分子途径和工作机制是什么仍有待深入探究。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种油菜基因BnNAC022及其应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种油菜基因BnNAC022，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种油菜基因BnNAC022在调控十字花科植物抗虫性中的应用。
作为本发明的进一步优化方案，所述油菜基因BnNAC022过量表达可提高十字花科植物的抗虫性。
作为本发明的进一步优化方案，所述十字花科植物为拟南芥、油菜。
作为本发明的进一步优化方案，所述虫为蚜虫。
一种重组质粒，通过在载体上转入油菜基因BnNAC022获得。
作为本发明的进一步优化方案，所述载体为pCAMBIA 1301a。
一种转基因高抗虫型十字花科植物品种的获得方法，将油菜基因BnNAC022作为目的基因导入十字花科植物基因组中进行过量表达，培育获得转基因高抗虫型十字花科植物品种。
本发明的有益效果在于：
本发明通过构建重组质粒并将油菜基因BnNAC022作为目的基因导入十字花科植物基因组中，发现该基因的过量表达可提高十字花科植物的抗虫性，表明油菜基因BnNAC022参与了十字花科植物的抗虫性调控，本发明基因的发现可为作物育种提供基因资源。
附图说明
图1为油菜基因BnNAC022克隆图；
图2为pCAMBIA 1301a载体结构示意图；
图3为BnNAC022转基因植株和野生型植株(CK)的表型图；
图4为BnNAC022转基因植株和野生型植株(CK)抗蚜虫表型分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1总RNA的提取(Trizol法)
(1)、准备RNase-free EP管(2.0mL)，4℃离心机预冷；
(2)、液氮预冷研钵，研杵，将适量的甘蓝型油菜品种核优202的叶片组织放入研钵中，加入液氮，待液氮挥发完，迅速充分研磨，再加入液氮，继续研磨，重复一次后，至样品呈细粉末状，颜色越白越好，再用预冷后的1mL RNase-free枪头的粗头端将200-300mg的粉末移至预冷后的2.0mL RNase-free EP管中；
(3)、加入1mL已预冷的Trizol溶液，盖上盖子，在涡旋震荡仪上快速震荡30-60s，充分混匀，放于冰上，避光，静置10min；
(4)、加入500μl氯仿，充分颠倒混匀，放于冰上，避光，静置约5min；
(5)、将样品取出，放入已预冷的离心机中，4℃，13000rpm，离心6min；
(6)、离心结束后，取上清约600μl(上清的量可根据实际情况决定)于新的1.5mLRNase-free EP管中，此过程一定要避免吸出沉淀，再加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，不宜剧烈；
(7)、将步骤(6)所获得的混合溶液，4℃，13000rpm，离心10min；
(8)、弃上清，加入1mL 75％乙醇(用DEPC水配制而成)，充分混匀，可在震荡仪上震荡数秒；再在4℃，13000rpm条件下，离心5min，去上清；
(9)、重复步骤(8)，去掉上清，再离心一次，用RNase-free枪头吸掉残留的75％乙醇溶液，在通风橱晾干10min；
(10)、加入50μl DEPC水溶解RNA，用移液器轻轻吹打混匀，再用核酸检测仪测量已提取RNA的纯度和浓度，并可用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，剩余RNA 放置-80℃保存。
2.2RNA反转录获得cDNA
使用诺唯赞生物科技有限公司反转录试剂盒(323)进行反转录反应，严格按照实际说明书依次操作，具体步骤如下：
(1)、基因组DNA去除
在RNase-free离心管中配制反应液(组份如表1所示)，用移液器轻轻吹打混匀，42℃，2min：
表1反应液各组份用量
试剂名称 用量
RNase-free ddH2O 16μl
4×gDNA wiper Mix 4μl
模板RNA(Total RNA) 1pg–1μg
(2)、配制反转录反应体系，进行反转录反应
取步骤(1)中所获得的反应液16μl，添加4μl的5×HiScript III qRT Super Mix，并用移液器轻轻吹打混匀，进行反转录反应，关于反转录反应的温度具体如表2：
表2反转录反应温度及时间
反应温度 时间
(*)37℃ 45min
85℃ 5sec
注：如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度(*)提高至50℃，有助于提高产量。
反转录反应完成后产物即是cDNA，产物在-20℃保存，但需要在半年内使用；如果长期(超过半年)存放应分装后在-80℃保存，另外，cDNA应避免反复冻融，避免降解。
2.3构建重组质粒
将数据库中已公布的油菜基因BnNAC022 CDS序列(如SEQ ID NO.1所示，序列来源：基因号为GSBRNA2T00087539001)采用同源重组的方法设计引物并进行PCR扩增反应，PCR反应体系如表3，PCR反应程序如表4，如图1所示，PCR产物(扩增出的油菜基因BnNAC022序列)经0.1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
将克隆获得的油菜基因BnNAC022 CDS序列插入如图2所示的载体pCAMBIA 1301a(pCAMBIA 1301a载体为pCAMBIA 1301的MCS处通过EcoRI与SacI双酶切插入CaMv35S启动子序列，该启动子用于启动目的序列，达到过表达的目的)的多克隆位点(BAMHI酶切位点)，以获得重组质粒(pCAMBIA1301a-BnNAC022)，而后便可将其转化至大肠杆菌中。
表3目的基因扩增的PCR反应体系
试剂名称 用量
2×Phanta Max Master Mix(DyePlus) 25μl
SEQ ID NO.2：上游引物F(10μM) 2μl
SEQ ID NO.3：下游引物R(10μM) 2μl
cDNA 2μl
ddH2O 19μl
Total(总体系) 50μl
表4目的基因扩增的PCR反应程序
Figure BDA0004217767570000051
关于大肠农杆菌质粒的提取，具体如下：
(1)、将培养过夜浑浊的菌液，加入到2ml离心管中，12000r/min离心1min，弃上清；再次加入菌液，离心1次，富集菌液，弃培养基，倒扣于吸水纸上吸尽残液；
(2)、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer P1(Buffer P1已经加入RNase A)，用移液器或涡旋振荡混匀，充分分散菌体沉淀；
(3)、经步骤(2)处理的菌体中加入250μl Buffer P2，温和的上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解；
(4)、经步骤(3)处理的菌体中加入350μl Buffer P3，立即温和的上下颠倒8-10次让溶液彻底中和Buffer P2，此时应出现白色絮状沉淀，12000r/min离心10min；
(5)、将Fast Pure DNA Mini Columns吸附柱置于2ml收集管(Collection Tube)中，将步骤(4)上清用移液器小心转移至吸附柱中，注意不要吸到沉淀，12000r/min离心30-60s，倒掉收集管中的废液，把吸附柱重新放回收集管中；
(6)、加入600μl Buffer PW2(已用无水乙醇稀释)至吸附柱中，12000r/min离心30-60s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(7)、重复步骤(6)；
(8)、将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心1min干燥吸附柱，目的是将吸附柱中残留的漂洗液彻底去除；
(9)、把吸附柱置于一个新的灭菌的1.5ml离心管中，加入30-100μlElutionBuffer至柱吸附柱的膜中央，室温静置2min，12000r/min离心1min洗脱质粒；
(10)、弃吸附柱，所获得大肠农杆菌质粒保存于-20℃，备用，测序比对结果。
2.4重组质粒转化至农杆菌(GV3101)
(1)、将GV3101农杆菌感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上融化，加入2μl重组质粒(pCAMBIA 1301a-BnNAC022)，将混合液加到1.5mLEP管，转化农杆菌；
(2)、冰浴5min，液氮5min，37℃热激5min，冰浴5min；
(3)、往EP管加入700μl无抗性的LB溶液(10g蛋白胨、10g氯化钠、5g酵母浸出物/L)，28℃，220rpm，暗处摇菌3-5h；
(4)、取50μl涂布于含有卡那霉素、利福平抗性的LB板上，28℃暗培养48h；
(5)、待长出菌斑，菌落PCR验证，摇菌，扩繁即获得含有重组质粒的农杆菌菌液，保存备用。
2.5拟南芥种子灭菌处理及种植
拟南芥为十字花科，被子植物门，双子叶植物纲，拟南芥的优点是植株小、结子多，拟南芥的基因组是已知植物基因组中最小的，拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，油菜育种在品种选育过程中，通常会使用与它同科的模式植物拟南芥作为最初的研究对象，因为两者具有相似的形态结构特点，在许多发育过程中的分子调控机制上也大同小异。
2.5.1、拟南芥种子表面灭菌处理
(1)、取适量的拟南芥种子于2.0mL离心管中，在超净工作台中加入12％花王溶液处理10min，期间需不断颠倒晃动离心管，使种子与消毒液充分接触；
(2)、吸去离心管中的12％花王溶液，再用无菌水洗6-8次，每次充分振荡混匀1-2min；
(3)、洗干净后加适量无菌水，将拟南芥种子放置4℃，黑暗条件下春化3天。
2.5.2、野生型拟南芥的种植
(1)、将春化后的种子均匀播种于1/2MS固体培养基(Ms 2.2g、MES 0.5g、蔗糖10g；NaOH调节pH5.7-5.8)上，垂直放置于人工气候室生长，25℃，16h-light/8h-dark的光照；
(2)、将蛭石和高压灭菌后过筛的黑土按体积比为3:1的比例混匀，分装到小方盆(7cm×7cm×10cm)中，将方盆放置于托盘内，向盘底加入自来水，使营养土和蛭石慢慢浸透湿润；
(3)、待拟南芥生长至6-8天，根长约为6cm左右时，拆开培养皿，用镊子将拟南芥轻轻移栽到事先准备好的营养土中，注意不要损坏根系，用适量的土压一下拟南芥根部，并附上保鲜膜，防止幼苗水份流失；
(4)、一周后，待幼苗生长稳定时，可将保鲜膜揭掉，使其正常生长，并在适当时候浇水和补肥，注意防止病虫害，等到拟南芥开花时，对其进行浸染。
2.6农杆菌侵染拟南芥
(1)、将含有重组质粒的农杆菌菌液(经步骤2.4获得)活化后，取500μl至50mL含有抗生素(卡那霉素、利福平)的液体LB培养基中扩大培养，28℃，220rpm暗培养36-48h；
(2)、用50mL离心管收集菌液，3000rpm，室温离心10min，弃上清；
(3)、加入15mL拟南芥转化buffer(Ms 0.22g、MES 0.05g、蔗糖5g、silwetl7 30μl)，充分悬浮菌体并混匀；
(4)、用巴氏滴管吸取一定量的悬浮液，依次滴到待浸染拟南芥即将开花的柱头(经步骤2.5.2获得)上，浸染结束后用黑色塑料袋套住浸染过后的植株，24h后摘掉；
(5)、一周后，按上述浸染步骤，再浸染一遍，以提高转化效率；
(6)、两次浸染结束后，拟南芥生长状态可能会变差，需适时浇水和补肥，注意防止病虫害；
(7)待浸染的拟南芥大部分角果成熟变黄时，停止浇水，并陆续收获T0代转基因种子。
2.7拟南芥转基因阳性株系的筛选
(1)、将T0代转基因拟南芥种子消毒，春化后，均匀播种于含25mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上，垂直放置于人工气候室生长，25℃，16h-light/8h-dark的光照；
(2)、温室生长7-10天(如图3所示)，平板上能正常生长的拟南芥为转基因阳性苗，并将其移栽至营养土中；
(3)、待转基因阳性苗拟南芥长到快开花时，依次每株取1-2片叶片，提取DNA进行PCR验证。
3实验验证
3.1.1、转基因植物提取DNA
(1)、取上述转基因拟南芥的幼嫩叶片放入2mL离心管中加入钢珠，液氮，速冻；
(2)、震荡研磨叶片，至粉末状；
(3)、加入500μl的2×CTAB提取液(65℃提前预热)，震荡30s，混匀后在65℃水浴1h左右，在此期间上下颠倒；
(4)、取出离心管，加入等体积的氯仿和异戊(氯仿：异戊醇为24:1)，震荡30s，室温12000r/min离心15min；
(5)、取300μl上清，转至新的1.5mL的离心管中，加入2倍等体积的无水乙醇，颠倒混匀，静置15min，室温12000r/min离心15min，弃上清；
(6)、加入1mL 75％酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀，12000r/min离心5min，重复一遍；
(7)、去除洗涤液后，再次12000r/min离心10s，除尽上清，最后置于通风橱中吹干；
(8)、在离心管中加入50μl的无菌水，移液器反复吹打，使其充分溶解，以获得转基因植物的DNA，保存备用。
3.1.2、转基因植物目的片段扩增
以3.1.1所提取的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系如表5所示，PCR反应程序如表6所示，PCR反应结束后，进行电泳检测，大小正确的条带即为转基因阳性苗：
表5转基因植物目的片段扩增用PCR反应体系
模板DNA 2μl
SEQ ID NO.4：F-引物 1μl
SEQ ID NO.5：R-引物 1μl
Taq混合酶 12.5μl
ddH2O 8.5μl
总体积 25μl
表6转基因植物目的片段扩增用PCR反应程序
Figure BDA0004217767570000081
3.1.3、转基因植株抗蚜性室内鉴定实验
待转基因阳性苗(BnNAC022)和野生型(CK)生长至五叶期用于接虫鉴定，转基因阳性苗和野生型各12株，每株接2头，每5天调查1次，记录每株总蚜量(转基因植株和野生型植株分别置于养虫笼)，具体如图4所示。
实验结论：与野生型相比，过量表达油菜基因BnNAC022的转基因拟南芥表现出较强的抗蚜虫表型，可证明油菜基因BnNAC022的过量表达具有提高十字花科植物抗虫性的作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种油菜基因BnNAC022，其特征在于，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种如权利要求1所述的油菜基因BnNAC022在调控十字花科植物抗虫性中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述油菜基因BnNAC022过量表达可提高十字花科植物的抗虫性。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述十字花科植物为拟南芥、油菜。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述虫为蚜虫。
6.一种重组质粒，其特征在于，通过在载体上转入如权利要求1的油菜基因BnN AC022获得。
7.根据权利要求6所述的一种重组质粒，其特征在于，所述载体为pCAMBIA 1301a。
8.一种转基因高抗虫型十字花科植物品种的获得方法，其特征在于，将权利要求1的油菜基因BnNAC022作为目的基因导入十字花科植物基因组中进行过量表达，培育获得转基因高抗虫型十字花科植物品种。
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