CN118086338A - 一种玉米基因Zmereb211及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玉米基因Zmereb211及其应用，涉及植物基因工程技术领域，该Zmereb211基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过构建重组质粒并将玉米基因Zmere b211作为目的基因导入十字花科植物基因组中，发现玉米基因Zmereb211过表达可延缓十字花科植物花期的同时引起十字花科植物的卷叶，表明玉米基因Zmereb211参与了十字花科植物花期和叶片形态的调控，该发现可为作物育种提供基因资源。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玉米基因Zmereb211及其应用。
背景技术
对大部分植物来说，开花是完成其自身繁衍和传递的重要生命时期，是从营养生长转向生殖生长的重要标志，开花时间是否正确对植物的繁殖至关重要，开花过晚可能会使得植物无法在最佳生长环境结束之前完成繁殖过程，而开花过早可能会导致植物没有积累够充足的养分来支撑其完成繁殖过程，而叶片形态是植物株型的重要组成部分，直接影响光合速率、干物质积累等，进而影响生长发育。动态株型是植物适应环境变化的基础，而动态卷叶是一种常见的可逆的水分胁迫响应。因此研究植物开花及卷叶基因并对其进行编辑具有重要的理论意义和应用价值。
AP2/ERF转录因子均含有AP2/ERF结构域，根据AP2/ERF结构域的数量以及是否含有其他结构域，将其分为AP2、乙烯响应因子(ERF)、脱水响应元件结合蛋白(DREB)、RAV和Soloist五个亚家族。AP2家族成员主要参与植物开花、侧根形成等过程的调控。其中，ERF亚家族可以与乙烯响应元件GCC-box结合，参与调控乙烯应答和非生物胁迫响应。CBF/DREB亚家族可以与干旱、低温响应元件DRE/CRT结合，进而诱导相关基因的表达，对植物应对非生物胁迫有很大的帮助。该家族在植物生长发育以及响应生物胁迫和非生物胁迫等方面起重要作用。近年来AP2/ERF家族蛋白参与植物生长发育以及对逆境响应等方面的研究越来越多，本研究主要涉及玉米基因Zmereb211延缓十字花科植物花期品种的获得方法，培育获得转基因晚花型和卷叶型十字花科植物品种，为该类转录因子今后的研究提供帮助。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种玉米基因Zmereb211及其应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种玉米基因Zmereb211，所述玉米基因Zmereb211的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的进一步优化方案，所述玉米品种为B73玉米自交系。
一种玉米基因Zmereb211在调控十字花科植物花期和叶片形态中的应用。
作为本发明的进一步优化方案，所述玉米基因Zmereb211过表达可延缓十字花科植物花期的同时引起十字花科植物的卷叶。
作为本发明的进一步优化方案，所述十字花科植物为拟南芥。
一种重组质粒，所述重组质粒为通过在pCAMBIA 2300载体上转入玉米基因Zmereb211而获得。
一种转基因晚花期卷叶型十字花科植物品种的获得方法，将玉米基因Zmereb211作为目的基因导入十字花科植物基因组中进行过表达，培育获得转基因晚花期卷叶型十字花科植物品种。
本发明的有益效果在于：
本发明通过构建重组质粒并将玉米基因Zmereb211作为目的基因导入十字花科植物基因组中，发现玉米基因Zmereb211过表达可延缓十字花科植物花期的同时引起十字花科植物的卷叶，表明玉米基因Zmereb211参与了十字花科植物花期和叶片形态的调控，该发现可为作物育种提供基因资源，为利用Zmereb211基因培育出延迟开花时间和卷叶的十字花科植物提供了参考依据。
附图说明
图1为玉米基因Zmereb211克隆图；
图2为pCAMBIA 2300载体结构示意图；
图3为Zmereb211转基因过表达植株WB检测图；
图4为Zmereb211转基因过表达植株(Zmereb211-83、Zmereb211-42)和野生型植株(CK)的表型图(1周、2周、3周)；
图5为Zmereb211转基因过表达植株(Zmereb211-83、Zmereb211-42)和野生型植株(CK)的延缓花期表型分析图。
图6为Zmereb211转基因过表达植株(Zmereb211-83、Zmereb211-42)和野生型植株(CK)的卷叶表型分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1提取总RNA
(1)、准备好磨样所需的研钵及研磨棒，转移至干热烘箱中180℃干热灭菌8h备用；准备好无酶无菌的2mL和1.5mL的离心管、蓝枪头和黄枪头；将冷冻离心机设置为4℃预冷，并将Trizol、氯仿：异戊醇(24：1)、异丙醇和DEPC水配制的75％乙醇置于冰上预冷；
(2)、研钵用液氮预冷后，将适量B73玉米自交系的玉米叶片转移至研钵中，充分快速研磨，至叶片泛白绿色，快速转移到2mL的离心管中(约占管容积的1/4～1/3)，加入1mL的Trizol溶液，用涡旋振荡仪充分振荡混匀(约30sec)，冰上静置10min；
(3)、在通风橱中向经步骤(2)处理获得的样品中加入250μL预冷后的氯仿：异戊醇(24：1)，用涡旋振荡仪剧烈振荡30sec，充分混匀，冰上静置8min；
(4)、经步骤(3)处理获得的样品转移至预冷的4℃冷冻离心机，12000r/min高速离心12min；
(5)、取经步骤(4)处理获得的样品的上层水相400-500μL(一般取400μL，切勿取到中层杂质)转移到一个新的1.5mL离心管内，然后向其加入等体积(一般为400μL)预冷过的异丙醇，上下颠倒充分混匀，冰上静置8min，从而使RNA充分沉淀；再转移至预冷的4℃冷冻离心机，12000r/min高速离心10min；
(6)、在通风橱中弃上清，加入1mL提前预冷好的75％乙醇(步骤(1)处理获得的)，涡旋振荡混匀，12000r/min高速离心5min；
(7)、重复步骤(6)一次；
(8)、弃上清，在4℃离心机12000r/min离心2min，转移至提前灭好菌的超净工作台，用RNase-free的黄枪头吸尽残留的乙醇溶液；
(9)、在超净工作台晾干(约5min)，晾干过程中切勿开风；干燥后加入50μL RNase-Free水，用枪头吹打混匀使RNA充分溶解，将RNA保存于-80℃冰箱中备用。
2.2RNA反转录获得cDNA
使用诺唯赞生物科技有限公司反转录试剂盒(323)进行反转录反应，严格按照实际说明书依次操作，具体步骤如下：
2.2.1、基因组DNA去除
在RNase-free离心管中配制反应液(组分如表1所示)，用移液器轻轻吹打混匀，42℃，2min：
表1反应液各组分及用量
| 试剂名称 | 用量 |
| RNase-freeddH2O | 16μl |
| 4×gDNAwiperMix | 4μl |
| 模板RNA(TotalRNA) | 1pg-1μg |
2.2.2、配制反转录反应体系，进行反转录反应
取步骤2.2.1中所获得的反应液16μl，添加4μl的5×HiScript III qRT SuperMix，并用移液器轻轻吹打混匀，进行反转录反应，关于反转录反应的温度具体如表2：
表2反转录反应温度及时间
| 反应温度 | 时间 |
| (*)37℃ | 45min |
| 85℃ | 5sec |
注：如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度(*)提高至50℃，有助于提高产量。
反转录反应完成后产物即cDNA，产物在-20℃保存，但需要在半年内使用；如果长期(超过半年)存放应分装后在-80℃保存，另外，cDNA应避免反复冻融，避免降解。
2.3构建重组质粒
将数据库中已公布的玉米基因Zmereb211 CDS序列(如SEQ ID NO.1所示，序列来源：基因号为Zm00001eb100800)采用同源重组的方法设计引物并进行PCR扩增反应，PCR反应体系如表3，PCR反应程序如表4，如图1所示，PCR产物(扩增出的玉米基因Zm ereb211序列)经0.1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR反应引物序列如下：
SEQ ID NO.2：Zmereb211-F：ATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATGACCAAGAAGCTCATCTCCATC；
SEQ ID NO.3：Zmereb211-R：TAAAGCAGGGCATGCCTGCAGAAAACTAGACG CGGCGC
将克隆获得的玉米基因Zmereb211 CDS序列插入如图2所示的载体pCAMBIA 2300，以获得重组质粒(pCAMBIA 2300-Zmereb211)，而后便可将其转化至大肠杆菌中。
表3目的基因扩增的PCR反应体系
| 试剂名称 | 用量 |
| 2×PhantaMaxMasterMix(DyePlus) | 25μl |
| SEQ ID NO.2：上游引物F(10μM) | 2μl |
| SEQ ID NO.3：下游引物R(10μM) | 2μl |
| cDNA | 2μl |
| GCenhance | 5μl |
| ddH2O | 14μl |
| Total(总体系) | 50μl |
表4目的基因扩增的PCR反应程序
2.4重组质粒转化至农杆菌
(1)、取-80℃保存的GV3101农杆菌感受态细胞于室温片刻待其部分融化，处于冰水混合物状态时，插入冰中。
(2)、用无菌枪头吸取10μL上述步骤2.3所获得的重组质粒加入到50μL感受态细胞中，用手拨打管底混匀，冰上放置5min；
(3)、置于液氮中速冻5min，然后37℃水浴中热激5min，最后置于冰上5min；
(4)、加入350μL无抗YEB液体培养基，28℃，200r/min振荡培养2-3h；
(5)、6000r/min，离心1min收菌，弃部分上清，留取100μL用枪重悬菌块，均匀涂布于LB(50μg/mL Kan，50μg/mL Rlif)固体培养基上，28℃倒置培养2-3d，长出抗性菌落，菌落PCR验证，摇菌，扩繁即获得含有重组质粒的农杆菌菌液，保存以备用。
2.5转基因拟南芥的获得
拟南芥为十字花科，被子植物门，双子叶植物纲，拟南芥的优点是植株小、结子多，拟南芥的基因组是已知植物基因组中最小的，拟南芥是自花授粉植物，基因高度纯合，玉米育种在品种选育过程中，通常会使用与它同科的模式植物拟南芥作为最初的研究对象，因为两者具有相似的形态结构特点，在许多发育过程中的分子调控机制上也大同小异。
2.5.1、拟南芥种子表面灭菌处理
取适量的哥伦比亚野生型拟南芥种子于2.0mL离心管中，在超净工作台中加入12％花王溶液处理10min，期间需不断颠倒晃动离心管，使种子与消毒液充分接触；吸去离心管中的12％花王溶液，再用无菌水洗6-8次，每次充分振荡混匀1-2min；洗干净后加适量无菌水，将拟南芥种子放置4℃，黑暗条件下春化3天。
2.5.2、野生型拟南芥的种植
1)、将春化后的种子均匀播种于1/2MS固体培养基(Ms 2.2g、MES 0.5g、蔗糖10g；NaOH调节pH5.7-5.8)上，垂直放置于人工气候室生长，25℃，16h-light/8h-dark的光照；
2)、将蛭石和高压灭菌后过筛的黑土按体积比为3:1的比例混匀，分装到小方盆(7cm×7cm×10cm)中，将方盆放置于托盘内，向盘底加入自来水，使营养土和蛭石慢慢浸透湿润；
3)、待拟南芥生长至6-8天，根长约为6cm左右时，拆开培养皿，用镊子将拟南芥轻轻移栽到事先准备好的营养土(步骤2)获得)中，注意不要损坏根系，用适量的土压一下拟南芥根部，并附上保鲜膜，防止幼苗水份流失；
4)、一周后(如图4所示)，待幼苗生长稳定时，可将保鲜膜揭掉，使其正常生长，并在适当时候浇水和补肥，注意防止病虫害，等到拟南芥开花时，对其进行浸染。
2.5.3、农杆菌侵染拟南芥
1)、将含有重组质粒的农杆菌菌液(经步骤2.4获得)活化后，取500μl至50mL含有抗生素(卡那霉素、利福平)的液体LB培养基中扩大培养，28℃，220rpm暗培养36-48h；
2)、用50mL离心管收集菌液，3000rpm，室温离心10min，弃上清；
3)、加入15mL拟南芥转化buffer(Ms 0.22g、MES 0.05g、蔗糖5g、silwetl730μl)，充分悬浮菌体并混匀；
4)、用巴氏滴管吸取一定量的悬浮液，依次滴到待浸染拟南芥即将开花的柱头(经步骤2.5.2获得)上，浸染结束后用黑色塑料袋套住浸染过后的植株，24h后摘掉；
5)、侵染后的拟南芥生长状态可能会变差，需适时浇水和补肥，注意防止病虫害；
6)、待浸染的拟南芥大部分角果成熟变黄时，停止浇水，并陆续收获T0代转基因种子。
2.5.4、拟南芥转基因阳性株系的筛选
将T0代转基因拟南芥种子(OE-Zmereb211)和对照组(WT组)拟南芥种子消毒，春化后，均匀播种于含50mg/L卡那的1/2MS固体培养基上，垂直放置于人工气候室生长，25℃，16h-light/8h-dark的光照；温室生长7-10天，平板上能正常生长的拟南芥为转基因阳性苗，并将其移栽至营养土中；待转基因阳性苗拟南芥长到快开花时，依次每株取1-2片叶片，提取DNA进行PCR验证，同时提取蛋白做WB验证。
(一)、关于转基因植物内源总蛋白的提取步骤如下：
1)、取上述转基因拟南芥(OE-Zmereb211)和对照组(WT组)拟南芥的幼嫩叶片，放入2mL离心管中加入钢珠，液氮，速冻；
2)、振荡研磨叶片，至粉末状；
3)、加入80ul Extraction buffer(按1g/ml加入)，继续充分混匀；
4)、加入20ul 5X protein loading buffer，充分混匀后，4℃离心5min，金属浴99℃煮10分钟。
(二)、关于蛋白凝胶电泳实验步骤如下：
用步骤(一)所提取的内源总蛋白，进行蛋白凝胶实验，具体步骤如下：
1)、将洗净且晾干的蛋白胶板的前后板用夹子夹好，保证前后胶板的下沿齐平；
2)、用雅酶PAGE凝胶快速制备试剂盒(10％)货号(PG112)配置分离胶和浓缩胶插入干净晾干的梳子，约30分钟后浓缩胶凝固，此时可拔出梳子上样跑胶；
3)、将蛋白胶夹在电泳槽中，在内外槽中加入1X Tris-Gly buffer，用移液器将样品加入到胶孔中，基本上1.0mm的蛋白胶板每孔加10ul样品；
4)、盖好电泳槽的盖子，将电源线接入到电泳仪中，打开电泳仪，调节电压80V，开始跑胶，等到样品的蓝色loading buffer进入到分离胶后，调节电压为120V；
5)、等电泳结束后，通过western blot(免疫印迹试验或蛋白质印迹法)来观察结果。
(三)、western blot(免疫印迹试验、蛋白质印迹法)实验步骤如下：
1)、依据步骤(二)所获得的胶的大小剪取合适的PDVF膜，将膜和转膜滤纸放在甲醇中浸泡30秒，然后把膜和滤纸放在膜转移缓冲液中浸泡，将跑完的蛋白胶从前后板中剥离出来装配转移蛋白质，用天能SEMI-DRYTRANSFER CELL半干转印槽转膜；
2)、打开VE 386转移电泳槽的安全保护槽盖，并将顶层含有不锈钢板的阴极装置取下；
3)、将1张浸湿膜转移缓冲液的增厚滤纸平铺在阳极装置的铂金板上，将平衡好的膜铺在已铺好的滤纸上，与滤纸边缘对齐，并排除膜与滤纸之间的气泡；
4)、小心地将平衡好的凝胶铺在膜上，与膜边缘对齐，并排除凝胶与膜之间的气泡，最后将一张浸湿的滤纸平铺在凝胶上，与凝胶边缘对齐，并排凝胶与滤纸之间的气泡；盖好电泳槽的盖子，将电源线接入到电泳仪中，打开电泳仪，调节电压80V，开始跑胶，等到样品的蓝色loading buffer进入到分离胶后，调节电压为120V；
5)、将不锈钢阴极板装置上的4个导向孔对准铂金板上的导向柱，保持水平方向小心地放置在三明治上，盖上保护盖，将本装置的电源线插入电泳仪，20v 25min；
6)、转膜结束后，切断电源，取出杂交膜放在抗体孵膜盒中，注意膜的方向，有蛋白的一面朝上，加入20ml牛奶封闭缓冲液，将抗体孵膜盒放置在转膜脱色摇床上慢速摇晃，室温封闭1-2小时；
7)、去除牛奶封闭缓冲液，用TBSTbuffer冲洗2遍杂交膜以去除残留的牛奶封闭缓冲液；
8)、按1：5000稀释flag一抗，加入稀释的一抗6ml，将抗体孵膜盒放置在转膜脱色摇床上缓慢摇晃，4℃孵育过夜；
9)、按1：5000稀释flag二抗，加入合适的二抗6ml，转膜脱色摇床上室温慢速摇晃孵育1-2小时；
10)、去除二抗，加入TBST buffer来洗膜，将抗体孵膜盒放置在转膜脱色摇床上快速摇晃8分钟，然后更换TBSTbuffer；重复此过程共4次；
11)、加入化学发光底物各1ml，混合孵育1分钟后拍照，图3可知，目的基因在植株中成功表达，内参使用GAPDH，蛋白大小为36KDa，OE-PCAMBIA2300-Zmereb211蛋白大小为60.1KDa。
2.6转基因植株晚花和卷叶鉴定实验
将转基因阳性苗(Zmereb211-83、Zmereb211-42)和野生型(CK)按照2.5.2方法培育正常生长，转基因阳性苗和野生型各12株，观察表型，具体如图4-6所示。
实验结论：与野生型(CK)相比，过量表达玉米基因Zmereb211的转基因拟南芥株系(Zmereb211-83、Zmereb211-42)明显是晚花和卷叶表型，可证明玉米基因Zmereb211的过量表达具有使十字花科植物晚花和卷叶的作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种玉米基因Zmereb211，其特征在于，所述玉米基因Zmereb211的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的玉米基因Zmereb211，其特征在于，所述玉米品种为B73玉米自交系。
3.一种如权利要求1-2任一所述的玉米基因Zmereb211在调控十字花科植物花期和叶片形态中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述玉米基因Zmereb211过表达可延缓十字花科植物花期的同时引起十字花科植物的卷叶。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述十字花科植物为拟南芥。
6.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为通过在pCAMBIA 2300载体上转入如权利要求1-2任一所述的玉米基因Zmereb211而获得。
7.一种转基因晚花期卷叶型十字花科植物品种的获得方法，其特征在于，将权利要求1-2任一所述的玉米基因Zmereb211作为目的基因导入十字花科植物基因组中进行过表达，培育获得转基因晚花期卷叶型十字花科植物品种。
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