CN115820659A - C2h2型锌指蛋白基因hstl在调控水稻抽穗时间中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，尤其涉及C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻抽穗时间和培育高效高质水稻中的应用。C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻抽穗时间和培育高效高质水稻中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明利用CRISPR/Cas9技术构建了hstl单突变体和hstl/hst双突变体，通过敲除HSTL基因，得到了一种高效高质的水稻新品种，不仅提高了水稻产量，同时还加快了水稻的抽穗时间，进一步提高了水稻的培育效率。

Description

C2H2型锌指蛋白基因HSTL在调控水稻抽穗时间中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻抽穗时间和培育高效高质水稻中的应用。

背景技术

对于人类来说农作物在维系生命，提高生活品质和质量方面是不可或缺的主要来源。随着人类的不断进化，农作物也伴随着人类的发展进程。随着世界人口的持续增长，粮食需求日益扩大，很显然提高产量仍是目前世界农业的重中之重。面对全球有限的土地和资源，如何充分利用现有资源并使得产量提高成为了育种家们关注的焦点。对于各类农作物育种来说，如何充分利用各地的光照和温度条件来培育适应性较强的品种是目前面对的共同问题。

世界上主要的谷类作物有水稻、玉米、小麦、大麦等。抽穗期作为水稻生长发育过程中的重要的农艺性状，而控制水稻的开花时间或开花期是粮食生产成功的关键步骤。近十几年来，水稻中广泛的数量性状位点(QTL)研究已经确定了与光周期开花时间有关的基因，并揭示了开花时间调控的一些分子机制。随着这些基因功能方面的研究越来越深入透彻，使得水稻无论是在产量还是在品质上都有了很大改观。但是，由于我国地域差异显著，现有的水稻品种是否达到了最大产量潜力尚未可知。通过研究抽穗期基因及其调控机理，来保证水稻在不同地区的高产稳产，以及在高纬度地区的水稻育种都有着重要的作用。

恰当的抽穗期是平衡营养生长和生殖生长的关键，对水稻产量的高低有着决定性的作用。水稻抽穗时间过早时，由于光照与温度水平均未达要求，水稻还未生长到一定的营养生长水平就转为了生殖生长，会导致植株矮小早熟，穗小结实少，抽穗不整齐，造成经济性状差，水稻减产(苗昌泽，2001)；抽穗时间过晚时，水稻极易受低温等自然条件的影响导致无法完成授粉，灌浆、成熟等过程均会受到影响，导致水稻空瘪粒、减产甚至绝收。因此，水稻只有在适宜的时间抽穗才能达到最优的产量状态。

发明内容

为了改善水稻的抽穗时间，同时保持较优的产量质量，为培育高效高质的水稻品种提供基础，本发明提供了C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL在调控水稻抽穗时间和培育高效高质水稻品种中的应用。本申请利用CRISPR/Cas9技术构建了hstl单突变体和hstl/hst双突变体，通过敲除HSTL基因，得到了一种高效高质的水稻新品种，不仅提高了水稻产量，同时还加快了水稻的抽穗时间，进一步提高了水稻的培育效率。

为了实现上述的发明目的，本发明采用了以下的技术方案：

C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻抽穗时间和培育高效高质水稻中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

作为优选，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过负调控作用影响水稻的抽穗时间。

作为优选，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过调控OsCKX2的表达来影响水稻的分枝数和每穗粒数。

作为优选，所述高效高质水稻为通过CRISPR/Cas9技术，在HSTL基因内选取靶位点将该基因敲除所获得的水稻突变体；作为优选，所述的水稻突变体为hstl单突变体或hstl/hst双突变体；最优选hstl单突变体为hstl 3-1和hstl 12-1，hstl/hst双突变体为hstl/hst 15-2和hstl/hst 3-2。

进一步，本申请提供了一种基因敲除载体，为C2H2型锌指蛋白基因HSTL的CRISPR/Cas9基因敲除载体，包含SEQ ID NO：3-6所示的核苷酸序列。

进一步，本申请提供了一种重组菌和/或转基因细胞系，包含所述的基因敲除载体。

进一步，本申请提供了所述的基因敲除载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控水稻抽穗时间中的应用。

进一步，本申请提供了所述高效高质水稻的培育方法，包括以下步骤：通过CRISPR/Cas9技术，设计特异性靶向HSTL基因编码序列的sgRNA，构建得到基因敲除载体，将其转化入水稻，对获得的植株进行鉴定以获得水稻突变体。

作为优选，所述sgRNA表达框的引物序列如SEQ ID NO：7-10所示。

作为优选，所述水稻突变体鉴定的引物序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。

附图说明

图1：采用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除载体的流程图；

图2：基因敲除载体的电泳图；

图3：基因敲除载体的测序结果；

图4：CRISPR/Cas9突变位点序列比对；

图5：HSTL在野生型水稻不同时期不同器官的表达特征；

图6：OsCKXs在野生型WT、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst的表达特征；

图7：野生型WT、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst的20d苗期表型；

图8：野生型WT、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst 15-2的20d苗期的株高、根长、鲜重和最大叶宽(n＝20)；

图9：野生型WT、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst的70d苗龄的表型(n＝9)；

图10：野生型WT、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst的70d苗龄的株高和总节间长(n＝9)；

图11：野生型WT、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst成熟期的表型(n＝12)；

图12：野生型WT、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst成熟期的株高、穗长度、分枝数、每穗粒数和抽穗时间(n＝12)。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1实验材料及其获得过程：

实验材料：野生型水稻中花11(OryzasativaL.ssp.Japonicacv.ZH11)、突变体hst、hstl3-1、hstl12-1、双突变体hstl/hst3-2、hstl/hst15-2。

获得过程：hstl单突变体和hstl/hst双突变体的构建和鉴定

从NCBI中下载HSTL基因(LOC_Os12g42250)cDNA序列，设计CDS序列特异性引物。引物均采用Primer5.0软件设计。引物合成与纯化PCR产物及阳性克隆菌液测序由上海生物工程有限公司完成。

CRISPR/Cas9敲除载体构建的具体操作步骤为：

(1)CRISPR-Plant(www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)设计HSTL靶位点引物。

(2)靶点接头制备(U3和U6a分开)。将靶标引物稀释到100μM，方法如下：U3-F和U3-R(U6a-F和U6a-R)各取1μL加入到98μL dH₂O混合稀释到1μM，90℃处理30s，立即放置在冰上，备用。

(3)边切边连(第一次)。配制10μl酶切连接反应液(U3和U6a分开)。体系如表1所示，PCR程序：37℃5min；20℃5min，共进行4个循环。

表1酶切连接反应体系(10μL体系)

(4)两轮PCR扩增gRNA表达盒

Ⅰ：第一轮PCR扩增(每个gRNA表达盒共进行2个PCR反应，共4个反应)，反应体系如表2，PCR程序如表3。扩增反应完成后取4μl电泳检查。

表2第一轮PCR反应体系(20μL体系)

表3PCR反应程序

Ⅱ：第二轮PCR扩增：预先将两对位置特异引物混合成工作液，每对1.5μM：B1’+B2(PT1)；B2’+BL(PT2)。其中，PT1扩增U3-gRNA表达盒，PT2扩增U6a-gRNA表达盒。反应体系如表4，反应程序如表3。反应完成后取2-3μl电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度。

表4第二轮PCR反应体系(50μL体系)

(5)将第二轮PCR反应液的U3-gRNA表达盒和U6a-gRNA表达盒混合在一起，使用Magen HiPure Gel Pure DNA Mini Kit回收目的片段，具体步骤参照说明书。

(6)边切边连(第二次)。配置15μL酶切连接反应体系，反应体系如表5，PCR反应程序如表6。

表5酶切连接反应体系(15μL体系)

表6酶切连接反应程序

(7)转化。操作如下：将6μL连接产物与60μL大肠杆菌DH5α感受态细胞在离心管中混匀，冰浴30min；42℃水浴热激60s，立即置于冰上2min；加入500μL无抗LB液体培养基，混匀，37℃，220rpm/min摇1h；用移液枪吸取200μL，将其均匀涂布在含卡那霉素的LB固体培养基上，至菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h。

(8)挑取单克隆菌落及菌液PCR鉴定。镊子夹取枪头挑取单克隆菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇3h后进行菌液PCR反应，共3个PCR反应，引物分别为SP-ML/U3-R(U3)，U3-F/SP-R(U6a)和SP-ML/SP-R(U3+U6a)。引物序列如下，反应体系如表7，反应程序如表8。反应完成后取8μL进行电泳验证产物长度是否符合。

载体构建相关引物序列：

U-F：5'-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'；

gRNA-R：5'-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3'；

B1：5'-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；

B2：5'-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；

B2’：5'-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；

BL：5'-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；

SP-ML：5'-GCGCGGTGTCATCTATGTTACTA-3'；

SP-R：5'-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3'；

U3-F：5'-ggcATCGACCTCTCGCTGACGCT-3'；

U3-R：5'-aaacAGCGTCAGCGAGAGGTCGA-3'；

U6a-F：5'-gccGAAGCCGTCTTCGTCGACGA-3'；

U6a-R：5'-aaacTCGTCGACGAAGACGGCTT–3'。

表7菌液PCR反应体系(20μL体系)

表8菌液PCR反应程序

(9)菌液测序及质粒提取。取1ml菌液送测序，菌液测序由杭州尚亚生物技术有限公司完成。测序结果比对成功后，取200μl原始菌液置于8ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇12-16h。质粒提取使用Magen HiPure Plasmid Micro Kit C，具体操作步骤参考说明书。

(10)使用MEGA 6.0对测序结果与目标序列进行比对。

CRISPR/Cas9编辑系统的突变效率高且操作简单，在植物基因的功能研究中得到了广泛运用。构建流程图如图1所示，在HSTL的CRISPR/Cas9敲除载体构建过程中，在目标编辑区插入了U3和U6a两个启动子，有助于提高打靶效率。构建过程中的电泳图如图2所示，PCR结果与预期相符。测序结果如图3，证明已将设计的两个靶位点序列插入到表达盒中，且保证了靶位点序列的高保真性。

将构建成功的HSTL基因敲除载体转化至水稻野生型ZH11和突变体hst中获得hstl单突变体和hstl/hst双突变体。

水稻HSTLCRISPR/Cas9转基因植株的阳性鉴定：

CRISPR/Cas9敲除载体在水稻野生型ZH11和突变体hst中的转化完成后，获得T0代水稻转基因苗。以T0代水稻叶片为材料提取DNA，进行PCR阳性鉴定。获得的阳性植株经突变鉴定以及测序结果显示，无纯合突变体植株存在，因此需获得T1代种子后才能进行突变鉴定。从T1代种子中进行突变鉴定，通过测序分析获得了纯合突变体，从中选择4种纯合突变体作为材料。

CRISPR/Cas9阳性植株突变鉴定：

(1)CRISPR/Cas9阳性植株突变鉴定引物：

HSTL-F：5'-CCATTTCTCATCACTGAGCT-3'

HSTL-R：5'-ATTCTGGTGTCCCCCTAGCGC-3'

(2)在获得的阳性植株的T1代种子中选了4个株系的种子进行突变鉴定，经过苗期的初步表型分析，选择了hstl3-1和hstl12-1单突变体，hstl/hst3-2和hstl/hst15-2双突变体进行后续实验。

(3)CRISPR/Cas9突变位点序列比对如图4所示。

表8突变体hstl和双突变体hstl/hst水稻植株突变类型统计表

实施例2实验方法

水稻培养方法：

1)水稻种子破休眠：挑选籽粒饱满的水稻种子，置于30℃恒温培养箱，用0.1％稀硝酸浸泡12-16h，对水稻进行破休眠处理。

2)水稻种子消毒：用5％的次氯酸钠溶液浸泡20min对水稻进行消毒处理。用清水冲洗数遍以后，置于30℃恒温培养箱中黑暗催芽浸种培养。早晚换水。

3)水稻培养：培养至种子露白后，用镊子将种子移至网格上，在植物人工智能气候箱中用清水培养。一周后换为半营养液继续培养。一周后将长势一致的水稻幼苗换成全营养液，并每周换一次营养液。人工智能气候箱培养调节：白天13h，温度28℃，光照30000Lx；夜间11h，23℃，光照0。水稻营养液按照木村B营养液(表10)的配方进行配置，pH调在5.2-5.8。

表10木村B营养液

基因表达检测：

水稻总RNA的提取：利用康为世纪RNA提取试剂盒提取在高温处理不同时间点下的野生型水稻叶和根中的总RNA，具体实验操作步骤参考试剂盒说明书。RNA易降解，实验前需用75％乙醇擦拭实验台。提取的RNA应立即在超微量分光光度计上测定RNA浓度和纯度，确定所提取的RNA样品合格后，利用逆转录试剂盒进行逆转录。剩下的RNA置于-80℃超低温冰箱保存。

水稻花药总RNA的提取：利用LC Sciences Total RNA purification kit提取野生型在高温处理不同时间点下的花药总RNA，具体实验操作步骤参照试剂盒说明书。然后在超微量分光光度计上测定RNA的浓度和纯度，确定RNA样品合格后，立即进行逆转录反应。剩下的RNA置于-80℃超低温冰箱保存。

RNA样品的逆转录：利用Takara逆转录试剂盒对所提的RNA进行逆转录，实验步骤参考试剂盒说明书。RNA逆转录的反应程序：37℃，15min；85℃，5s；4℃，恒温保存。逆转录完成后，-20℃保存cDNA样品，写好标签。用于qRT-PCR的cDNA需稀释3倍后才能使用。

取苗期、拔节期、花期野生型ZH11水稻植株根、茎、叶、节、花药作为材料，利用Takara Mini BEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，采用TaKaRa第一链cDNA合成试剂盒Prime Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行总RNA逆转录；利用实时荧光定量法PCR分析HSTL在野生型ZH11不同器官中的表达特征，对每个cDNA样品做3次生物学重复实验。

qRT-PCR反应体系(10μL体系)为：SYBR/TB-Green 5μL，PrimerF 0.4μL，PrimerR0.4μL，ddH₂O 3.2μL，cDNA1μL。反应程序为：变性95℃1min，热变性94℃10s，退火55℃15s，延伸72℃15s(共45个循环)。内参β-actin-F序列为5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3，β-actin-R序列为5'-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3，HSTL-F序列为5'-CCCTTCTCTTTCCATCGTC-3，HSTL-R序列为5'-CTCTGTTGTTGTCACCACC-3。定量数据采用2^-ΔΔCt方法进行分析。

数据处理与分析：

所有实验均选取3个生物学重复。使用Excel及Spss19.0软件进行数据分析，数据均以平均值±方差(Mean±SD)表示，方差采用(P<0.05)；作图使用GraphpadPrism8.0。

实施例3荧光定量PCR分析水稻中HSTL和OsCKXs的表达情况

HSTL在不同时期水稻不同器官的表达特征分析：

我们采用实时荧光定量PCR技术对HSTL在水稻不同时期不同器官的表达特征进行分析。如图5所示，在苗期，HSTL在叶中表达的比较多，在根和茎中表达的相对较少。在拔节期，HSTL在叶和节中表达的比较多，在根和茎中表达的比较少。在花期，HSTL在茎中表达的最多，在叶中也有较多的表达，在根和节中表达的比较少，在花药中表达的最少。

OsCKXs在抽穗扬花期的表达特征：

文献报道，OsCKX2是DST的靶向基因，抑制OsCKX2的表达使水稻花序分生组织中细胞分裂素积累，增加水稻穗分枝数，从而增加水稻的籽粒数。因此，我们对OsCKX2在抽穗扬花期的花药中的表达特征研究(图6)，发现OsCKX2在突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst中的表达都低于野生型WT。除了OsCKX2，我们还研究了OsCKXs在花药中的表达特征，发现除了突变体hstl 3-1中的OsCKX6、双突变体hstl/hst 3-2的OsCKX1、OsCKX6和OsCKX9的表达高于野生型外，突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst花药中其他OsCKXs的表达低于野生型WT。表明HSTL基因可以调控OsCKX2的表达，从而调控水稻植株的穗分枝数和产量。

实施例4HSTL单突变体和hstl/hst双突变体的表型分析

水稻植株表型观察：

培养筛选出来的突变体hstl 3-1、hstl 12-1和双突变体hstl/hst 3-2、hstl/hst15-2到20d苗龄后，进行表型观察。如图7所示，相同生长条件下，hstl突变体都可以正常生长。测量野生型和突变体的株高、根长、鲜重和最大叶宽，如图8所示，发现双突变体hstl/hst 3-2和hstl/hst 15-2的株高最高，其次是突变体hstl 3-1和hstl 12-1，再次是突变体hst，野生型ZH11最矮。突变体hst的最大叶宽最大，其次是双突变体hstl/hst，突变体hstl和野生型ZH11的最大叶宽无明显差异。野生型ZH11、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst的根长和鲜重都没有明显的差异。

培养水稻植株到70d苗龄后，如图9A和图10所示，明显观察到突变体hstl和双突变体hstl/hst的株高依旧高于野生型。此外，还明显观察到突变体hstl和双突变体hstl/hst的节间比野生型和突变体hst的节间长，且节也多。(图9B)。

培养水稻植株到成熟期后，进行成熟期表型观察。如图11和图12所示，发现突变体hstl 3-1、hstl 12-1和双突变体hstl/hst 3-2、hstl/hst 15-2的株高最高，其次是突变体hst，野生型ZH11最矮。双突变体hstl/hst 15-2的分枝数最大，其次是突变体hstl 3-1，然后是双突变体hstl/hst 3-2、突变体hstl 12-1、hst和野生型ZH11；双突变体hstl/hst 3-2和hstl/hst 15-2的每穗粒数最多，其次是突变体hstl 3-1、hstl 12-1和hst，最少的是野生型ZH11；双突变体hstl/hst 3-2和hstl/hst 15-2的穗长度最大，其次是突变体hstl 3-1，然后是突变体hstl 12-1、hst和野生型ZH11。如图12所示，研究统计抽穗时间，发现双突变体hstl/hst 15-2和hstl/hst 3-2的抽穗时间最早；其次是突变体hst和突变体hstl 3-1、hstl 12-1；野生型抽穗时间最晚。双突变体hstl/hst 15-2的抽穗时间和野生型的抽穗时间差约为10d。表明HSTL基因突变还可以缩短水稻植株的抽穗时间。

为了明确野生型WT、突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst之间的形态学差异情况，我们对生长了20d苗龄的水稻统计分析了株高、根长、鲜重和最大叶宽。发现突变体hst、突变体hstl和双突变体hstl/hst的平均株高高于野生型WT，突变体hst的平均最大叶宽最大，突变体hst的平均鲜重最重，但野生型和突变体的平均根长没有明显的差异。推测HSTL基因可以影响茎秆伸长，但并不能影响叶宽。当培养到70d时，可以明显观察到突变体hstl和双突变体hstl/hst的茎秆长于突变体hst和野生型WT。当培养到成熟期，发现突变体hstl和双突变体hstl/hst的株高依旧高于突变体hst和野生型WT；发现突变体hstl和双突变体hstl/hst的穗长度以及每穗粒数大于野生型；双突变体hstl/hst的分枝数多于野生型。表明HSTL基因可以影响水稻植株的茎伸长和水稻的每穗粒数及分枝数。有研究发现DST基因突变水稻植株可以通过降低OsCKX2的表达，促进细胞分裂素在花序分生组织中积累，增加水稻的穗枝梗数和每穗粒数，从而提高了水稻的产量。统计研究抽穗时间，发现双突变体hstl/hst的抽穗时间最早，其次是突变体hstl和hst，野生型WT抽穗时间最晚。表明HSTL基因突变还可以缩短水稻植株的抽穗时间。因此我们对OsCKXs在抽穗扬花期的花药中的表达特征分析，发现突变体hst、hstl和双突变体hstl/hst花药中OsCKXs的表达低于野生型WT。表明HSTL基因通过降低OsCKXs的表达来调控水稻的每穗粒数及分枝数。

在禾本科植物中，茎由节和节间组成，节间伸长是由赤霉素(GA)通过激活细胞分裂和刺激细胞伸长来实现的。OsABF1可以直接抑制编码氧化酶的基因SD1的转录，从而降低水稻内源GA水平。过表达OsABF1水稻表现出半矮化和延迟的种子萌发。电泳迁移率变动分析和双荧光素酶报告基因分析表明玉米的一个GA反应基因ZmWRKY114直接与OsGA2ox4启动子中的W-box基序结合，从而参与了水稻株高的调控。过表达ZmWRKY114水稻的GA合成受到抑制，表现出半矮化表型。HSTL在Nagai等人实验室被作为节间伸长减速器1(DEC1)而发现。研究发现DEC1通过调节GA的合成来调节节间分生组织的活性。因此，我们推测HSTL可以通过调控GA的合成来调节节间伸长。

以上为对本发明实验例的描述，通过对所公开的实验例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实验例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实验例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.C2H2型锌指蛋白基因HSTL和/或编码转录因子HSTL在调控水稻抽穗时间和培育高效高质水稻中的应用；所述C2H2型锌指蛋白基因HSTL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码转录因子HSTL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过负调控作用影响水稻的抽穗时间。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，C2H2型锌指蛋白基因HSTL及其编码转录因子HSTL通过调控OsCKX2的表达来影响水稻的分枝数和每穗粒数。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高效高质水稻为通过CRISPR/Cas9技术，在HSTL基因内选取靶位点将该基因敲除所获得的水稻突变体；作为优选，所述的水稻突变体为hstl单突变体或hstl/hst双突变体；最优选hstl单突变体为hstl 3-1和hstl 12-1， hstl/hst双突变体为hstl/hst 15-2和hstl/hst 3-2。

5.一种基因敲除载体，其特征在于，为C2H2型锌指蛋白基因HSTL的CRISPR/Cas9基因敲除载体，包含SEQ ID NO：3-6所示的核苷酸序列。

6.一种重组菌和/或转基因细胞系，其特征在于，包含权利要求5所述的基因敲除载体。

7.权利要求5或6所述的基因敲除载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控水稻抽穗时间中的应用。

8.权利要求1-4任意一项权利要求所述高效高质水稻的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：通过CRISPR/Cas9技术，设计特异性靶向HSTL基因编码序列的sgRNA，构建得到基因敲除载体，将其转化入水稻，对获得的植株进行鉴定以获得水稻突变体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述sgRNA表达框的引物序列如SEQ IDNO：7-10所示。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述水稻突变体鉴定的引物序列如SEQID NO：11和SEQ ID NO：12所示。

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