CN116479007B - 一种芹菜AgDREBA6a基因及其在提高植物耐高温胁迫中的应用 - Google Patents
一种芹菜AgDREBA6a基因及其在提高植物耐高温胁迫中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种芹菜AgDREBA6a基因及其在提高植物耐高温胁迫中的应用，属于基因工程领域。所述AgDREBA6a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明发现了基因AgDREBA6a在植物高温胁迫中发挥重要调控作用，将AgDREBA6a基因转入拟南芥，获得的转基因植株根系生长能力、光合作用以及耐热能力明显提高，证实本发明公开的基因具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种芹菜AgDREBA6a基因及其在提高植物耐高温胁迫中的应用。
背景技术
芹菜(Apium graveolens L.)为伞形科一年或多年生草本植物，原产于地中海沿岸的沼泽地带，世界各国已普遍栽培，是一种重要的蔬菜作物。芹菜富含丰富的胡萝卜素、维生素及挥发性芳香成分，除作为蔬菜外，还具有极好的药用功能。“津南实芹”是天津津南区选育的优良地方品种，抗逆性强，生长速度快，我国南北四季均可栽培。
农作物的生长、发育及产量受到许多生物和非生物胁迫的影响，如干旱、低温或高温等极端天气、土壤盐渍化等。在植物中，许多基因在胁迫下被诱导表达，这些基因不仅自身能产生有抵抗力的功能性蛋白，同时也作为信号传导因子参与胁迫应答。
一些研究已经表明转录因子在基因表达调控中起重要作用，其中AP2/ERF家族转录因子是一类广泛参与各种生物过程的转录因子，如花和种子的发育，果实成熟、抵抗病原菌、参与胁迫应答等。以往研究证明DREB类转录因子能够特异性地结合DRE(Dehyarationresponsive element)顺式元件，DRE元件也在许多非生物胁迫相关的基因的启动子中被发现。
DREB转录因子是一类植物中特有的、可以调控多个与干旱、高盐及低温等非生物胁迫有关功能基因表达的转录因子。为了解决如何提高植株对高温胁迫的抗逆性的问题，本发明从芹菜品种‘津南实芹’中克隆了一个新的DREB基因AgDREBA6a，阐述了其在植物耐热性方面的功能。扩大了AP2/ERF家族转录因子的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种芹菜AgDREBA6a基因及其在提高植物耐高温胁迫中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明发现的芹菜AgDREBA6a基因能够提高植株根系的生长活力以及植株的光合作用，从而提高植株对高温胁迫的抗逆性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种耐热基因AgDREBA6a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述的耐热基因AgDREBA6a编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种利用所述的耐热基因AgDREBA6a培育转基因植物的方法，包括克隆耐热基因AgDREBA6a，并将所述耐热基因AgDREBA6a转入受体植物中培育得到转基因植物。
进一步地，所述克隆耐热基因AgDREBA6a包括以下步骤：
(1)设计引物，正向引物如SEQ ID NO.13所示，反向引物如SEQ ID NO.14所示；
(2)通过PCR方法克隆AgDREBA6a基因，所述PCR方法的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。
本发明还提供所述的耐热基因AgDREBA6a在增加植物根系生长活力中的应用。
本发明还提供所述的耐热基因AgDREBA6a在提高植物对高温胁迫的抗逆性中的应用。
本发明还提供所述的耐热基因AgDREBA6a在培育和改良抗高温植物中的应用。
本发明还提供所述的耐热基因AgDREBA6a在提高植物光合作用中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一种芹菜耐热基因AgDREBA6a及其应用，其中耐热基因AgDREBA6a是利用PCR扩增技术从芹菜‘津南实芹’中克隆的一种新的DREB转录因子，该DREB转录因子能够增强植物对高温的耐性。获得的AgDREBA6a基因有利于深入了解芹菜高温环境下的响应机制，同时也能用于培育抗高温性的植物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的WT拟南芥植株根系与转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株根系在高温处理下的结果图，其中WT表示野生型对照组，OE-AgDREBA6a表示转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株；
图2为本发明实施例提供的WT拟南芥植株与转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株在高温处理下的生长状态对比图，其中WT表示野生型对照组，OE-AgDREBA6a-1和OE-AgDREBA6a-2表示转AgDREBA6a基因拟南芥T2代不同植株；
图3为本发明实施提供的转AgDREBA6a基因拟南芥T2代PCR检测图；
图4为本发明实施例提供的转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株的GUS染色图，其中WT表示野生型对照组，OE-AgDREBA6a表示转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株；
图5为本发明实施提供的WT与转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株在4h高温处理后的叶片解剖结构对比图，其中，WT表示野生型对照组，OE-AgDREBA6a表示转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株；
图6为本发明实施提供的WT与转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株在高温处理后的叶片光合及叶绿素荧光特性对比图，其中，WT表示野生型对照组，OE-AgDREBA6a表示转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株，A不同植株叶绿素含量对比图，B为不同植株光合效率对比图，C为不同植株光合速率对比图，D为不同植株蒸腾速率对比图，E为不同植株叶绿素非光化学猝灭系数对比图，F为不同植株叶绿素光化学猝灭系数对比图；
图7为本发明实施提供的WT与转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株在不同时长高温处理后AtHSP98.7、AtHSP70-1、AtAPX1和AtGOLS14个基因的荧光定量表达验证结果对比图，其中，WT表示野生型对照组，OE-AgDREBA6a表示转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株；
图8为本发明实施提供的WT与转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株在三个不同时长高温处理后的各项生理指标对比图，其中，WT表示野生型对照组，OE-AgDREBA6a表示转AgDREBA6a基因拟南芥T2代植株，A为脯氨酸含量对比图，B为丙二醛含量对比图，C为超氧化物歧化酶活性对比图，D为过氧化酶活性对比图，E为过氧化氢酶活性对比图，F为可溶性蛋白含量对比图，G为根系长度对比图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例
1.芹菜总RNA的提取及cDNA的合成
采用Plant Total RNAIsolation Kit(成都福际生物技术有限公司)分别从芹菜‘津南实芹’成熟叶片中分别提取总RNA。用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Mix Rnasinselected(北京擎科生物科技有限公司)将提取的总RNA反转录成cDNA。
2.芹菜转录因子AgDREBA6a基因的克隆
基于芹菜转录组和基因组信息，获得芹菜AgDREBA6a的基因序列。根据该序列设计一对引物，正向：5’-ATGATGGCAGCAGCATCT-3’(SEQ ID NO.13)，反向5’-TCGGCTATCCGATTGTCG-3’(SEQ ID NO.14)。以‘津南实芹’cDNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经质量体积分数1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，连接到pUCm-T载体(生工生物工程(上海)股份有限公司)上并转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经PCR鉴定后委托北京擎科生物科技有限公司测序。
测序结果显示，芹菜AgDREBA6a基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：
ATGATGGCAGCAGCATCTTTAGATTTTTACAGCAGTTTTACAGATCCTGGTAGTGAAGATCTGATGAAAGCACTTGAGCCTTTTATCAACACTGCTTCTTCAACCCCACCCTCTTCCAGTACTTGTGATTTTTATTACCCTGTTGACTCTTCTTTCTCTACACCACCACCTAGTTTCTTTCCGGGTCACACCCGACCCGAATTCATAACCCGACCCGGCTCTTTGGGCCTTAACCAACTAACCAACTCTCAGATCCATCAGATCCAGGACCAAGTCCAACAACAAAACTACTACTGTCAGAGTCAAACACTGCTTGCTCCTAAACCAGTACAAATGAAACATGCAGGGGCCCCACCAAAGCCCACGAAGCTTTACAGGGGTGTGAGACAAAGACACTGGGGCAAATGGGTAGCTGAGATCCGATTACCCAAGAACCGGACCCGGCTTTGGCTAGGCACTTTTGACACAGCTGAAGAAGCAGCTTTAGCTTATGATAGAGCTGCTTATAAGCTCAGAGGTGACTTTGCTAGACTCAACTTTCCAAATCTTAAATATGATATCGAGTTTTCCACTTTTAGGCCTTTGCATGCGACTGTTGATGCTAAGCTTCAAGCTATTTGTGAAAACTTGCACAACAAGCCACCTAAACAGAGGAAACCAAGAAAACCCAAAACGGAAAGTGTCAAGAAAGTTGTTCCAAAAATGGAAAGTGAGATCAAAACCGGGTCAGTGGAAGATGGGTCGGGCGGGTCATCACCCGAATCCGGGATAAGTTTCATGAACTTCTCAGAGCCTTTGTTTGATGAGTCTGAGAATTTCATGTTGCAGAAGTTTCCTTCTGTGGAGATTGACTGGGAAGCGCTTACGTCATCGCTGATGTCATAA。
SEQ ID NO.2：
MMAAASLDFYSSFTDPGSEDLMKALEPFINTASSTPPSSSTCDFYYPVDSSFSTPPPSFFPGHTRPEFITRPGSLGLNQLTNSQIHQIQDQVQQQNYYCQSQTLLAPKPVQMKHAGAPPKPTKLYRGVRQRHWGKWVAEIRLPKNRTRLWLGTFDTAEEAALAYDRAAYKLRGDFARLNFPNLKYDIEFSTFRPLHATVDAKLQAICENLHNKPPKQRKP1RKPKTESVKKVVPKMESEIKTGS VEDGSGGSSPESGISFMNFSEPLFDESENFMLQKFPSVEIDWEALTSSLMS*。
3.AgDREBA6a基因的重组表达载体构建
(1)首先利用双酶切BamHI和ScaI(Thermo Scientific)方法获得pCAMBIA1301(购自上海碧云天生物技术有限公司)的线性化载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)纯化获得高纯度的pCAMBIA1301的线性化载体；
(2)将目的片段DNA和线性化载体pCAMBIA1301以3:1的摩尔比加到1.5ml的离心管中进行重组反应，混匀后在室温连接约30min，加入10μl的反应液到50μl的DH5α感受态细胞中，用移液器轻轻混匀，于冰上孵育30min，42℃水浴中热激45秒后快速置冰上冷却2min；
(3)加入300μl LB液体培养基，37℃孵育45-60min。5000rpm离心2min收集菌体，弃掉部分上清，用剩余的培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有Kan抗性的LB固体培养基上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16-24h；
(4)挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落，挑取相应单菌落于含有Kan抗生素的液体LB培养基中37℃、200rpm培养箱中培养过夜，提取质粒或将菌液直接测序以鉴定载体准确性；
(5)鉴定成功后，保存pCAMBIA1301-AgDREBA6a的质粒。
4.重组载体转入农杆菌GV3101
(1)每100μl GV3101农杆菌感受态细胞(购自上海碧云天生物技术有限公司)中加入2μg重组载体pCAMBIA1301-AgDREBA6a，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。加入700μl无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2h；
(2)6000rpm离心1min收集菌体，留取100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，将其均匀地涂布于含有Kan和Rif的YEB固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2天，挑取若干个阳性克隆利用菌落PCR简单验证结果。
5.拟南芥的培养
(1)根据实验需要取一定数量的拟南芥种子装于无菌的1.5mL离心管中，加入1mL75％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，重复3次。加入1ml超纯水，洗涤种子，弃上清，重复3次。在超净工作台用1mL移液器将种子点种于准备好的MS平板上；
(2)将平板封口，黑暗条件下倒置于4℃春化72h，春化结束后，将平板置于光照培养箱中竖直培养，出苗一周后即可移栽；
(3)用镊子将幼苗栽入小盆的土中，先用保鲜膜保湿24h，置于植物生长间中培养直至拟南芥生长抽薹时(约一个月)，用于转化实验。
6.拟南芥遗传转化
(1)农杆菌活化：在20mL的LB液体培养基中分别加入10μLRif和20μL Kan(Sigma公司)，摇匀并接菌，28℃220rpm震荡活化8-10h后，得到农杆菌的活化菌液；
(2)农杆菌扩大培养：在200mL的YEB液体培养基中分别加入100μLRif和200μLKan，再加入5-10mL的活化菌液，28℃220rpm震荡培养14-16h，至OD值1.6-2.0，4500rpm离心10min，沉淀菌体弃上清，自然晾干；
(3)在沉淀菌体中加入100mL 5％蔗糖和20μL SILWETL-77表面活性剂溶液重悬菌体，移液器吹打均匀、重悬菌体；
(4)将离心瓶中菌液加到平皿中，将拟南芥花序合拢，浸入平皿，轻轻晃动15s，转化完后搅匀菌液用黑袋子将植株套好，避光保湿24h。一周后再重复转化一次。
7.T1代阳性植株筛选
种植拟南芥T0代所收获的种子，将T0代种子消毒，接种含30mg/L潮霉素的MS筛选培养基(添加25mg/L头孢霉素抑菌)上22℃光照培养7-10天，筛选获得T1代阳性植株(幼苗和根系都正常生长的植株)。将阳性苗移栽到营养土中，用保鲜膜盖上2-3天后揭膜，然后正常生长。取筛选出的T1代阳性植株的叶片提取DNA，利用PCR方法鉴定其含有AgDREBA6a基因，进行转基因植株的目的基因的分子验证，最终确认基因已经转入T1代阳性植株。
8.转基因植株T2代阳性检测
(1)将T1代阳性植株进行单株收种以获得T1代种子，继续进行潮霉素筛选获得T2代阳性植株，植株生长至10d时，用镊子取出，使用GUS染色试剂盒(北京酷来搏科技有限公司)对T2代阳性植株和WT对照进行染色，结果如图4所示；
(2)获得的阳性植株移栽生长，提取叶片基因组DNA进行PCR分子鉴定，确定T2代阳性植株，PCR鉴定结果如图3所示。
9.拟南芥阳性植株表型观测
(1)将野生型WT拟南芥与T1代种子同时播种于消毒后的营养土中，4℃春化72h后，移入植物生长间，待拟南芥叶片开展至5cm时(20d)，进行高温胁迫处理；
(2)将WT、OE-AgDREBA6a-1和OE-AgDREBA6a-2植株同时放入38℃光照培养箱中，保持湿度在60％左右，处理24h，处理结果如图2所示。
10.拟南芥阳性植株根系测定
(1)将野生型WT拟南芥与T1代种子用5.中的方法消毒后，接种于MS平板上，4℃春化72h后，移入光照培养箱竖直培养，25℃培养至根系明显生长；
(2)待拟南芥根系均生长10d时，将光照培养箱温度调至38℃，保持湿度在60％左右，处理24h，处理结果如图1所示。
11.拟南芥阳性植株定量表达验证
(1)对WT、OE-AgDREBA6a-1和OE-AgDREBA6a-2植株进行高温处理：38℃高温分别处理0h、4h、12h、24h，取叶片样本并立即用液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中，根据1.中方法获取RNA和cDNA；
(2)选择拟南芥的4个基因和拟南芥中Actin的转录表达水平为内参序列设计表达检测引物，如表1；
表1
(3)实时定量PCR使用北京擎科生物科技有限公司2×TSINGKETMMaster qPCR Mix(SYBR Green I)试剂盒，按照操作说明进行；
(4)目的基因相对转录表达水平的计算公式为2-ΔΔCt，ΔΔCt＝(Ct目的基因－CtActin)处理组－(Ct目的基因－CtActin)对照组；
(5)对数据进行分析处理，绘制相对表达量水平验证结果图，如图7所示。
12.拟南芥阳性植株叶片结构特性测定
对野生型WT拟南芥植株和转基因植株进行40℃高温处理4h，取叶片样本使用FAA固定液固定，酒精脱水后用二甲苯和无水乙醇进行处理，制作石蜡切片，番红固绿双重对染后封胶，用Nikon Eclipse E100光学显微镜观察拍照，每个样品重复3次。
13.拟南芥阳性植株叶片光合及叶绿素荧光特性测定
对野生型WT拟南芥植株和转基因植株进行高温处理：40℃高温分别处理18h，采用无水乙醇与无水丙酮1∶1混合液浸提法测量叶绿素含量；使用便携式光合仪(Li-6400)测定拟南芥的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)；使用叶绿素荧光仪(PAM-2500)测定PSⅡ光能转化效率(Fv/Fm)、光化学淬灭(qP)、非光化学淬灭(qN)每个株系选取3株，每株选取3个叶片，每个叶片测量3次。上述试验均重复3次。
试验结果：
(1)将本发明克隆获得的芹菜AgDREBA6a基因转入拟南芥植株种获得的T2代阳性植株，在38℃高温胁迫下，生长状态与表型明显优于WT植株(图2)。
(2)荧光定量PCR结果显示OE-AgDREBA6a植株中的4个基因均响应了高温胁迫，随着处理时间增加，表达量也呈上升趋势，且在12小时之后表达量迅速上升，且保持在较高水平(图7)。
(3)根系测定结果表明转基因植株的根系长度和侧根量明显高于野生型拟南芥对照，表明AgDREBA6a基因的表达增加了受体植物的根系生长活力。
(4)叶片解剖结构表明转基因植株的气孔张开数量和张开程度明显高于野生型拟南芥对照，表明AgDREBA6a基因的表达有助于受体植物在高温下的气孔张开(图5)。
(5)叶片光合及叶绿素荧光特性结果表明转基因植株在高温胁迫下光合作用的强度显著强于野生品种拟南芥对照(图6)。
(6)荧光定量表达与生理指标分析结果可证明芹菜AgDREBA6a基因能显著提高受体植株对高温胁迫的抗逆性(图7-8)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种耐热基因AgDREBA6a，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的耐热基因AgDREBA6a编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.利用权利要求1所述的耐热基因AgDREBA6a培育转基因植物的方法，其特征在于，包括克隆耐热基因AgDREBA6a，并将所述耐热基因AgDREBA6a转入受体植物中培育得到转基因植物；所述植物为拟南芥。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述克隆耐热基因AgDREBA6a包括以下步骤：
(1)设计引物，正向引物如SEQ ID NO.13所示，反向引物如SEQ ID NO.14所示；
(2)通过PCR方法克隆AgDREBA6a基因，所述PCR方法的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。
5.过表达权利要求1所述的耐热基因AgDREBA6a在增加拟南芥根系生长活力中的应用。
6.过表达权利要求1所述的耐热基因AgDREBA6a在提高拟南芥对高温胁迫的抗逆性中的应用。
7.过表达权利要求1所述的耐热基因AgDREBA6a在培育和改良抗高温拟南芥中的应用。
8.过表达权利要求1所述的耐热基因AgDREBA6a在提高拟南芥光合作用中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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