CN107699574A - 一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法 - Google Patents

一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107699574A
CN107699574A CN201610651825.9A CN201610651825A CN107699574A CN 107699574 A CN107699574 A CN 107699574A CN 201610651825 A CN201610651825 A CN 201610651825A CN 107699574 A CN107699574 A CN 107699574A
Authority
CN
China
Prior art keywords
celery
agdreb3
dreb
transcription factors
transcription factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610651825.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107699574B (zh
Inventor
熊爱生
李梦瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201610651825.9A priority Critical patent/CN107699574B/zh
Publication of CN107699574A publication Critical patent/CN107699574A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107699574B publication Critical patent/CN107699574B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了芹菜品种‘津南实芹’中一个抗逆DREB转录因子及其制备方法和用途。所述的芹菜抗逆DREB类转录因子是AgDREB3，核苷酸序列为SEQ ID No 1。本发明利用聚合酶扩增技术从芹菜中克隆的DREB转录因子的基因序列，所获得的DREB转录因子具有转录激活活性，并响应芹菜的逆境胁迫。AgDREB3转录因子可用于植物转化，培育植物抗逆性提高的植物材料。

Description

一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及芹菜DREB类转录因子及其应用。本发明从芹菜中获得一个响应逆境胁迫的基因AgDREB3，该基因能够用于植物转化，培育抗逆性提高的植物。
背景技术
芹菜(Apium graveolens L.)是伞形科(Apiaceae)一年或多年生草本植物，是一种重要的蔬菜作物。芹菜含有丰富的营养成分，具有很高的食用价值和药用价值，特别是芹菜素、黄酮等生物活性物质能有效降低血压、调节血脂和血糖。‘津南实芹’是天津津南区选育的优良地方品种，株高90厘米左右，颜色淡绿，抗逆性强，生长速度快，我国南北四季均可栽培。
植物的生长和发育受各种非生物胁迫的影响，如高温或低温极端天气、干旱、土壤盐渍化和重金属例子影响。不断变化的全球气候可能会加剧这些逆境环境。植物自身已经进化出多种策略来应对这些逆境环境得以生存(Singh et al.，Curr Opin Plant Biol2002，5：430-436；Zhu，Annu Rev Plant Biol 2002，53：247-273；Katagiri，Curr OpinPlant Biol 2004，7：506-511)。因此，了解植物应对多种胁迫的反应模式是非常需要的。转录因子广泛参与植物的逆境调控网络(Chinnusamy et al.，J Exp Bot 2004，55：225-236；Mizoi et al.，BBA-Gene Regul Mech 2012，1819：86-96)。转录因子不仅可以直接参与逆境调控，还可以调节下游基因的表达(Shinozaki et al.，Curr Opin Plant Biol 2003，3：410-417)。AP2/ERF家族转录因子家族成员含有由60～70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域。主要分为AP2、RAV、DREB/CBF、ERF和其它类别，其中ERF亚族又分B1～B6六个组，DREB亚族又分A1～A6六个组。近些年研究表明该家族成员参与多种生物学过程，包括植物生长、果实成熟、种子发育、响应各种逆境胁迫等(Jofuku et al.，Plant Cell 1994，6：1211-1225；Mizoi J，et al.，Biochim Biophys Acta 2012，1819：86-96)。
发明内容
本发明提供了一种芹菜转录因子AgDREB3基因其制备方法和用途。该基因具有典型的AP2/ERF保守结构域，并能够响应逆境胁迫。所获得的基因有利于深入了解芹菜逆境下的响应机制，同时也能用于植物转化，提高植物的抗逆性。
附图说明
图1.芹菜AgDREB3蛋白序列与拟南芥AP2/ERF家族的进化树分析。
图2.芹菜AgDREB3基因在不同逆境胁迫下的表达分析。
图3.酵母单杂交验证AgDREB3蛋白结合DRE元件。
图4 β-半乳糖苷酶活性测定芹菜AgDREB3蛋白结合能力。
具体实施方式
1.芹菜总RNA的提取及cDNA的合成：采用RNA simple Total RNAKit(北京天根生化科技有限公司)分别从‘津南实芹’成熟叶片中分别提取总RNA。用Prime Script RTreagent Kit(大连宝生物工程有限公司)将提取的总RNA反转录成cDNA。
2.芹菜转录因子AgDREB1基因的克隆：基于芹菜转录组测序信息，以拟南芥AP2/ERF转录因子家族为信息探针，进行检索分析，获得芹菜AgDREB3的基因序列。根据该序列设计一对引物，正向：5’，ATGAAAAACTCCATAAAGAC-3’，反向5’，TCAGTAATTCCATAAAGCCATGCC-3’。以‘津南实芹’cDNA为模板进行扩增，PCR反应体系(20μL)：cDNA(2.5ng/μL)1μL，Ex TaqDNA聚合酶10μL，引物(10pmol/μL)各1μL，ddH2O7μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经质量体积分数1.2％琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，连接到pMD18-T(大连宝生物工程有限公司)载体上并转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经PCR鉴定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
3.序列分析：通过核苷酸序列测定，获得了芹菜转录因子AgDREB3基因的序列，对其编码的氨基酸序列进行分析。氨基酸组成与多序列比对采用Clustal X软件，进化树分析使用MEGA4.0软件。
4.实时定量PCR反应：对生长期‘津南实芹’幼苗分别进行4种逆境胁迫处理：4℃低温处理，干旱处理(200g·L-1的PEG6000)、盐胁迫处理(200mmol·L-1的NaCl)、ABA激素(0.1mmol·L-1)处理。分别于处理后0、1、3、6、12、24和48h取叶片样本并立即用液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中。根据‘津南实芹’中扩增的AgDREB3基因序列设计表达检测引物，正向为5’，CCATCATCAACCAATGCCAAGGAT，3’，反向为5’-GTGCCATCTCCGCTATC AACTGT，3’。实时定量PCR使用宝生物工程(大连)有限公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒，按照操作说明进行。采用芹菜的TUB-B基因作为参考基因(Li et al.，Frontiers Plant Sci 2016，7：313)，与目标基因一起扩增，引物序列为正向5’，TGGTGGCACTGGATCTGGTATGG-3’，反向为5’-ACTTTCGGAGGAGGGAAG ACTGAA-3’。相对定量使用参照基因的ΔΔCt法，表达差异水平为2-ΔΔCt，ΔCt＝Ct目标基因-Ctactin。
5.酵母单杂交体系和X-gal活性的测定：酵母菌株为EGY48，鱼饵质粒G222(G221质粒载体插入3拷贝的DRE顺式元件后构建成)载体由本实验室保存构建。将扩增好的AgDREB3基因片段克隆在酵母系统pPC86载体的BamH I-Sac I位点上。同时将重组质粒转化菌株EGY48，均匀涂于SD/-Trp/-His双缺陷平板，30℃培养箱培养2～3d后，将转化子影印到无菌硝酸纤维素膜上，平铺于含有X-gal的SD培养基上，1d后观察是否显蓝色。并以ONPG(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)(美国Sigma公司)为底物，进行β-半乳糖苷酶活性检测。
6.试验结果：
1).从芹菜中克隆的AgDREB3基因编码的蛋白序列具有典型的AP2/ERF保守结构域，与拟南芥AP2/ERF蛋白构建同源进化树，分析结果显示该基因属于AP2/ERF转录因子中的DREB-A1亚族(图1)。
2).荧光定量PCR结果显示AgDREB3基因在逆境胁迫下表达量变化，在冷胁迫和ABA处理下反映迅速，冷处理下3h表达量达到峰值，ABA处理下1h达到峰值且表达量上升了9倍以上，而在干旱和盐胁迫下6h后表达量才出现明显变化(图2)。
3).酵母转录激活实验证明AgDREB3蛋白可以与DRE顺式作用元件特异结合，并具有转录激活活性(图3和4)。

Claims (5)

1.一种芹菜中获得DREB类转录因子基因AgDREB3。
2.权利要求1所述的芹菜DREB类转录因子AgDREB3的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的芹菜DREB类转录因子，其特征在于所述DREB氨基酸序列含有保守的AP2结构域，该结构域能与启动子结合，并激活下游抗逆相关基因表达。
4.一种制备权利要求1所述的源于芹菜的DREB类转录因子AgDREB3基因的方法。
5.权利要求1所述的芹菜的DREB转录因子AgDREB3基因的应用。
CN201610651825.9A 2016-08-04 2016-08-04 一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法 Active CN107699574B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610651825.9A CN107699574B (zh) 2016-08-04 2016-08-04 一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610651825.9A CN107699574B (zh) 2016-08-04 2016-08-04 一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107699574A true CN107699574A (zh) 2018-02-16
CN107699574B CN107699574B (zh) 2021-05-04

Family

ID=61169100

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610651825.9A Active CN107699574B (zh) 2016-08-04 2016-08-04 一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107699574B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591972A (zh) * 2022-03-31 2022-06-07 四川农业大学 一种芹菜耐热基因AgDREBA6c及其应用
CN116479007A (zh) * 2023-03-27 2023-07-25 四川农业大学 一种芹菜AgDREBA6a基因及其在提高植物耐高温胁迫中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2422685A1 (en) * 2002-12-26 2004-06-26 Independent Administrative Institute Japan International Research Center For Agricultural Sciences Stress-induced promoter derived from rice
CN103483436A (zh) * 2013-08-27 2014-01-01 西北农林科技大学 甜荞dreb转录因子

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2422685A1 (en) * 2002-12-26 2004-06-26 Independent Administrative Institute Japan International Research Center For Agricultural Sciences Stress-induced promoter derived from rice
CN103483436A (zh) * 2013-08-27 2014-01-01 西北农林科技大学 甜荞dreb转录因子

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TOSHITSUGU NAKANO 等: "Genome-Wide Analysis of the ERF Gene Family in Arabidopsis and Rice", 《PLANT PHYSIOLOGY》 *
刘文英: "《植物逆境与基因》", 31 May 2015, 北京理工大学出版社 *
邵天恒 等: "芹菜中转录因子基因AgDREB1的分离与表达研究", 《南京农业大学学报》 *
陈金焕 等: "胡杨中两个新DREB类基因的克隆、序列分析及转录激活功能研究", 《北京林业大学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591972A (zh) * 2022-03-31 2022-06-07 四川农业大学 一种芹菜耐热基因AgDREBA6c及其应用
CN114591972B (zh) * 2022-03-31 2022-08-30 四川农业大学 一种芹菜耐热基因AgDREBA6c及其应用
CN116479007A (zh) * 2023-03-27 2023-07-25 四川农业大学 一种芹菜AgDREBA6a基因及其在提高植物耐高温胁迫中的应用
CN116479007B (zh) * 2023-03-27 2024-01-12 四川农业大学 一种芹菜AgDREBA6a基因及其在提高植物耐高温胁迫中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107699574B (zh) 2021-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101671677B (zh) 一种花生水通道蛋白基因AhAQ1及其编码蛋白质及其基因克隆方法
CN110331228B (zh) 珊瑚菜的内参基因及其筛选方法与应用
CN114574518B (zh) 一种促进豆科作物结瘤尤其是耐盐结瘤的方法
CN107937415A (zh) 一种马铃薯gata转录因子及其克隆方法与应用
CN107699574A (zh) 一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法
CN109207634B (zh) 海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用
CN107674872B (zh) 一种与芹菜抗逆性相关的转录因子AgDREB1基因序列及其应用
CN102703465A (zh) 小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79及其应用
CN112626069B (zh) 大豆gma-miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用
CN116904506B (zh) 黑果枸杞LrANT1基因及其编码蛋白的应用
CN113234753A (zh) 玉米微丝解聚因子adf7转基因植株的培育、鉴定及应用
CN101389762B (zh) 可以在植物中使用的基因启动子
CN108707651A (zh) 一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法及其应用
CN107686514B (zh) 一个新的编码芹菜dreb转录因子的基因克隆及功能鉴定
CN111763250B (zh) 基因在提高植物耐盐中的应用
CN111662368B (zh) 橡胶草耐旱基因TkMYC2、蛋白质、引物、载体、宿主菌及其应用
CN108085409A (zh) 不同组织中杉木内参基因的筛选方法和筛选基因作为内参基因的应用
CN101456908B (zh) 一种转录因子蛋白及其编码基因与应用
CN110964729A (zh) 一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法
KR101643050B1 (ko) 단자엽 식물의 화분 특이적 프로모터 및 이의 용도
CN111218434B (zh) 小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用
CN102776205A (zh) 一种植物抗旱基因
CN113637679B (zh) 一种抗逆植物基因及应用
CN107058334A (zh) 一种花生转录因子AhJ11‑FAR1‑5基因的克隆及功能表达方法
KR101673431B1 (ko) 모상체 특이적 프로모터

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 210043 Nanjing Agricultural University, Baguazhou street, Qixia District, Nanjing City, Jiangsu Province

Applicant after: NANJING AGRICULTURAL University

Address before: Nanjing City, Jiangsu Province, Nanjing Agricultural University No. 1 210095 Weigang

Applicant before: NANJING AGRICULTURAL University

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant