CN111218434B

CN111218434B - 小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用

Info

Publication number: CN111218434B
Application number: CN202010156514.1A
Authority: CN
Inventors: 翟胜男; 刘建军; 李豪圣; 宋健民; 刘爱峰; 曹新有; 程敦公; 赵振东; 刘成; 郭军; 韩冉; 訾妍; 李法计; 汪晓璐
Original assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-09
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2040-03-09
Also published as: CN111218434A

Abstract

本发明公开了小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用。本发明提供了如下蛋白质：将Ppo‑D1蛋白的第299位的甘氨酸替换为精氨酸后得到的蛋白质，和/或将Ppo‑A1蛋白的第251位的脯氨酸替换为亮氨酸后得到的蛋白质，或将其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的衍生蛋白质，或与其所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或在其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明获得的M091098和M091507突变体可用于低籽粒PPO活性小麦新品种的选育，为面制品颜色遗传改良提供重要种质资源。

Description

小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用。

背景技术

色泽是小麦面粉及面制品品质评价的重要感官指标(Mares和Campcell，2001；张立平等，2005)。小麦籽粒多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)是造成面粉及其制品颜色褐变的最主要原因(Fuerst等，2006；Morris，2018)，可以解释面粉及面制品加工和储藏过程中50％-70％的色泽褐变(Kruger等，1994；Martin等，2011)。PPO催化酚类物质发生氧化还原反应产生醌类物质或催化多酚类变为氧合醌，后者发生自身非酶促聚合或与蛋白质氨基酸残基或糖类发生反应，产生褐色或黑色的沉积物，从而导致面制品褐变(Jukanti等，2004；Parveen等，2010)。由此可见，PPO不仅影响面制品表观色泽，还影响食品特性及营养价值(Akond等，2010)，因而倍受面粉加工业和育种家关注。培育籽粒低PPO活性小麦品种，降低面粉及其制品的酶促褐变，已成为小麦育种工作的重要目标。

小麦籽粒PPO活性受基因型、环境及其互作的影响，其中基因型是最主要决定因素(葛秀秀等，2003)，表明遗传途径降低小麦籽粒PPO活性是可行的。诸多研究结果发现，小麦籽粒PPO活性主要受第二同源染色体上主效基因Ppo1的调控，尤其是Ppo-A1和Ppo-D1(Mares和Campbell，2001；Raman等，2005；张立平等，2005；Sadeque和Turner，2010；Zhai等，2016)。同时，在1A、1B、3B、3D、4A、4B、6B和7A等染色体上也检测到一些微效QTL(Demeke等，2001；张立平等，2005；Sadeque和Turner，2010；Zhai等，2016)。

Demeke和Morris(2002)根据物种间PPO蛋白核苷酸序列的保守性，同源克隆获得了第一条普通小麦Ppo基因序列(GenBank登录号AF507945)。Jukanti等(2004)利用该基因序列为探针，筛选GenBank小麦EST数据库，获得其它5个普通小麦Ppo基因，并通过序列同源比对将已有的6条Ppo基因分为两类，一类在籽粒中表达，另一类在其它组织中表达。利用电子克隆和PCR验证相结合的研究策略，He等(2007)克隆获得2A和2D染色体上小麦籽粒Ppo基因的序列全长。随着小麦Ppo基因的不断克隆，其分子功能标记也得到快速开发。Sun等(2005)根据小麦Ppo基因序列(AF507945)开发了一个位于2A染色体上的共显性功能标记PPO18，在具有高、低PPO活性的品种中分别扩增出685bp和876bp的片段。He等(2007)针对Ppo-D1基因的等位变异Ppo-D1a和Ppo-D1b分别开发了互补显性标记PPO16和PPO29，PPO16所扩增的713bp条带与低PPO活性相关，而PPO29扩增的490bp条带与高PPO活性相关。此外，根据Ppo-A1a和Ppo-A1b两等位变异的序列差异，He等(2007)和Wang等(2009)也分别设计了共显性标记PPO33和PPO05；王晓波等(2008)开发了用于检测Ppo-D1位点的显性分子标记STS01。Ppo1基因分子功能标记的开发及应用，有效地加快了低籽粒PPO活性小麦新品种的选育进程。

种质资源是育种工作的基础，缺乏突破性低籽粒PPO活性的种质资源，严重影响了低PPO活性小麦新品种的培育和面制品颜色遗传改良。甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate，EMS)诱变仅需要较小的群体便可获得大量的等位变异，且在后代稳定遗传，由于不涉及转基因操作，获得的优异突变体可以直接用于育种实践(侯彩玲等，2008；Slade等，2012)。

发明内容

本发明的目的是提供小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。

本发明所要求保护的蛋白质，可为蛋白质A或/和蛋白质B。

所述蛋白质A可为如下任一：

(A1)将Ppo-D1蛋白(具体为Ppo-D1b蛋白)的第299位的甘氨酸替换为精氨酸后得到的(G299R)；

(A2)将(A1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的由(A1)衍生的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述蛋白质B可为如下任一：

(B1)将Ppo-A1蛋白(具体为Ppo-A1b蛋白)的第251位的脯氨酸替换为亮氨酸后得到的(P251L)；

(B2)将(B1)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同能力的由(B1)衍生的蛋白质；

(B3)与(B1)-(B2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

进一步地，所述(A1)所示蛋白质为由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述(B1)所示蛋白质为由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

第二方面，本发明要求保护编码前文第一方面所述蛋白质的核酸分子。

进一步地，所述核酸分子可为编码前文第一方面所述蛋白质的基因，所述基因可为基因A或/和基因B。

所述基因A可为如下任一所示的DNA分子：

(a1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码前文所述蛋白质A的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质A的DNA分子。

所述基因B可为如下任一所示的DNA分子：

(b1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码前文所述蛋白质B的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质B的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

第四方面，本发明要求保护前文所述的蛋白质或所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用：

(C1)下调小麦Ppo1基因总表达量；或制备用于下调小麦Ppo1基因总表达量的产品；

(C2)下调小麦Ppo-A1和/或Ppo-B1基因和/或Ppo-D1基因表达量；或制备用于下调小麦Ppo-A1和/或Ppo-B1基因和/或Ppo-D1基因表达量的产品；

(C3)降低小麦籽粒PPO活性；或制备用于降低小麦籽粒PPO活性的产品。

在本发明的具体实施方式中，所述(C1)中下调小麦Ppo1基因总表达量和所述(C2)中下调小麦Ppo-A1和/或Ppo-B1基因和/或Ppo-D1基因表达量具体体现在RNA水平。所述下调小麦Ppo1基因总表达量为下调小麦籽粒中Ppo1基因总表达量；所述下调小麦Ppo-A1和/或Ppo-B1基因和/或Ppo-D1基因表达量为下调小麦籽粒中Ppo-A1、Ppo-B1基因和/或Ppo-D1基因表达量。

第五方面，本发明要求保护一种降低小麦籽粒PPO活性的方法。

本发明要求保护的降低小麦籽粒PPO活性的方法，可包括如下步骤(D1)或/和(D2)：

(D1)仅将受体小麦基因组中编码Ppo-D1蛋白(具体为Ppo-D1b蛋白)的第299位的甘氨酸的密码子替换为编码精氨酸的密码子(优选纯合突变)；

(D2)仅将受体小麦基因组中编码Ppo-A1蛋白(具体为Ppo-A1b蛋白)的第251位的脯氨酸的密码子替换为编码亮氨酸的密码子(优选纯合突变)。

进一步地，所述(D1)中，所述将受体小麦基因组中编码Ppo-D1蛋白(具体为Ppo-D1b蛋白)的第299位的甘氨酸的密码子替换为编码精氨酸的密码子可为将所述受体小麦基因组中编码Ppo-D1蛋白的基因替换为编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。所述(D2)中，所述将受体小麦基因组中编码Ppo-A1蛋白(具体为Ppo-A1b蛋白)的第251位的脯氨酸的密码子替换为编码亮氨酸的密码子可为将所述受体小麦基因组中编码Ppo-A1蛋白的基因替换为编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

更进一步地，所述(D1)中，所述编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因具体可为SEQ ID No.3所示DNA分子。所述(D2)中，所述编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因具体可为SEQ ID No.4所示DNA分子。

第六方面，本发明要求保护如下任一应用：

(D1)前文所述的蛋白质或前文所述的核酸分子或前文所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或前文所述应用或前文所述方法在小麦面粉或面制品颜色改良中的应用；

(D2)利用前文所述方法培育得到的籽粒PPO活性降低的小麦品种在小麦育种中的应用。

本发明利用定向诱导基因组局部突变技术(Targeting induced local lesionsin genomes，TILLING)筛选普通小麦EMS突变体库，获得一系列Ppo1基因等位变异突变体，通过基因表达和表型分析，分析不同等位基因对籽粒PPO活性的影响。在2491份M₂代EMS诱变群体中共检测到32个Ppo1基因的点突变，包含8个错义突变，16个同义突变和8个内含子突变，推测Ppo1基因在该群体中的突变频率为1/187.5kb。对8个错义突变构建的F₂群体进行基因表达和籽粒PPO活性分析显示，M091098(G1160A)和M091507(C1045T)突变位点显著降低了Ppo1基因表达(10.1％-54.4％和6.7％-37.1％)和籽粒PPO活性(28.2％和29.7％)，表明这些突变位点对PPO功能产生重要影响。M091098和M091507突变体可用于低籽粒PPO活性小麦新品种的选育，为面制品颜色遗传改良提供重要种质资源。

附图说明

图1为Ppo1的突变类型。

图2为F₂群体中不同基因型植株籽粒Ppo1及其同源基因的相对表达水平。*和**分别代表0.05显著水平和0.01显著水平。(a)M091098，(b)M091507。

图3为F₂群体中不种基因型植株籽粒PPO相对活性。*和**分别代表0.05显著水平和0.01显著水平。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体筛选与分析

一、材料与方法

1、EMS突变体群体构建

EMS诱变群体的构建参照Slade等人(2005)方法。选用一批稳定纯合的济麦20(马少康等.不同水氮处理对济麦20蛋白组分和加工品种的影响.麦类作物学报,2010,30(3):477-481)和济麦22(刘佳等.高产小麦品种济麦22旗叶叶绿素和活性氧清除系统酶活性的变化.山东农业科学,2012,44(8)：31-34)种子，利用1.2％EMS(Solarbio，E8150)诱变处理，温室种植获得M₁代突变植株；M₁代种子大田种植获得2491份M₂代植株(济麦20：1251份；济麦22：1240份)，籽粒单株收获保存。

2、利用TILLING技术筛选Ppo1突变体

EMS突变体的筛选参照Till等人(2006)方法，具体步骤为：(1)分别提取每个M₂代植株的基因组总DNA，将其置于96孔板中保存，并将8个样本DNA进行等量混合，形成8样本DNA池，4℃保存备用。(2)分子标记检测分析显示，济麦20和济麦22的Ppo1基因型分别为Ppo-A1b/Ppo-B1a/Ppo-D1a和Ppo-A1b/Ppo-B1a/Ppo-D1b。根据上述小麦Ppo1同源基因序列信息，设计A、B和D基因组特异性引物。利用中国春缺体-四体及PCR产物克隆测序的方法，进行引物基因组特异性验证，最终获得5对Ppo1特异性引物用于突变体库筛选(表1)。(3)以DNA池为模板进行PCR扩增，扩增产物经过反复变性、复性，从而形成野生型和突变体的异源双链。反应体系：DNA 50ng，SuperMix(全式金，AS111-01)7.5μL，上、下游引物(10μmol·L^-1)各1μL，用ddH₂O补足至15μL；反应程序：首先95℃5min；然后95℃30 s，退火温度从66℃开始，每个循环降低0.3℃，45s，72℃1.5 min，重复35个循环；72℃10 min；然后99℃ 10min，85℃ 1min，退火温度从85℃开始，每个循环降低0.5℃，30s，共99个循环；最后10℃保温备用。(4)用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶CEL I对异源双链进行切割。酶切反应体系：10×消化缓冲液2μL、CEL I(Transgenomics，706025)1μL、异源双链DNA15μL，ddH₂O补足至20μL；45℃反应20min，随后加入EDTA(0.25M，生工生物工程股份有限公司，ET0895)5μL终止酶切反应。(5)酶切产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选含有突变位点的DNA池。(6)对阳性DNA池进行单株筛选(每个单株DNA和野生型DNA等量混合)，获得突变单株。(7)对突变单株进行克隆测序，获得序列变异信息。

表1利用TILLING技术筛选Ppo1突变体的引物信息

注：^a济麦20突变体筛选；^b济麦22突变体筛选。

3、F₂群体构建与基因型检测

为了减小其他突变背景影响，将含有Ppo1基因错义突变位点的纯合M₃植株与野生型植株进行杂交，构建F₂群体(将8个含有Ppo1基因错义突变位点的M₂代植株收获籽粒大田种植，克隆测序鉴定M₃植株基因型，分别选取3株纯合突变型植株与对应野生型植株杂交，构建F₂群体。三个杂交穗收获籽粒为F₀，F₀自交收获籽粒F₁，F₁再播种获得F₂群体)，用于分析突变位点对基因表达和籽粒PPO活性的影响。F₂群体于2014-2015年度种植于北京，行长2m，行距25cm，每行20株，每个群体种25行，田间管理采用常规方法。

利用克隆测序的方法，鉴定F₂群体中每个株系Ppo1基因型(纯合突变型、杂合突变型和野生型)。每种基因型各选取10株农艺性状、生长发育进程一致的植株，调查并记载各植株的开花生育期，分别于花后7、14、21和28天采集籽粒，立即置于液氮中，–80℃保存，用于后续RNA提取和Ppo1基因表达水平分析。单株收获，成熟籽粒于–20℃保存，用于籽粒PPO活性测定。

4、突变体Ppo1基因表达分析

应用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN Biotech，DP441)分别提取花后7、14、21和28天籽粒总RNA，每个F₂群体中纯合突变型、杂合突变型和野生型植株各提取3个生物学重复；利用PrimeScript^TMRT Reagent试剂盒(Takara Bio Inc.，RR047A)将其反转成cDNA，置于–20℃保存备用。基于小麦Ppo1同源基因cDNA序列间的保守性和差异性，分别设计Ppo1基因的保守性引物和A、B、D基因组特异性引物(表2)，对其进行溶解曲线分析和qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)产物克隆测序，验证引物保守性和特异性，普通小麦β-actin基因(AB181991)作为内参基因。利用qRT-PCR技术，检测F₂群体中纯合突变型、杂合突变型和野生型植株籽粒不同发育时期Ppo1基因表达量，每个样本3次技术重复，基因相对表达量用平均值±标准误差(Standard error，SE)表示。反应体系：LightCyclerFastStart DNA Master SYBR Green(Roche Applied Sciences，No.03003230001)10μL，上、下游引物0.5μM，cDNA 50ng，ddH₂O补充至20μL。反应程序：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃20s和72℃ 20s，共40个循环。应用公式2^-ΔΔCT计算目标基因相对表达量(Livak和Schmittgen，2001)。首先，利用同一样本中β-actin基因转录水平来校正目标基因相对表达水平；其次将野生型植株花后7天籽粒目标基因相对表达量设为1，计算不同基因型植株的籽粒不同发育时期目标基因的相对表达量。

表2 Ppo1基因的qRT-PCR引物信息

注：^a济麦20分析；^b济麦22分析。

5、突变体籽粒PPO活性测定

每个F₂群体中分别对5株纯合突变型、杂合突变型与野生型植株进行籽粒PPO活性测定，分析突变位点对PPO蛋白功能的影响。PPO活性测定参照Anderson和Morris(2001)的方法，并作稍微改动。具体步骤如下：(1)称取1g全面粉放入50mL离心管中，加入7.5ml 50mMMOPS(Sigma，1132-61-2)缓冲液配制的酚底物10mM L-DOPA(pH 6.5，Sigma,53587-29-4)，室温振荡反应30min。(2)将反应液迅速转移至预冷的10mL离心管，4℃ 5,000rpm离心10min。(3)L-DOPA为空白对照，用分光光度计测定475nm处的吸收值，并进行PPO活性(U.g^- ¹.min^-1)计算。每个样品3次技术重复，PPO活性用平均值±SE表示。

6、数据分析

用DNAMAN(version 5.1，Lynnon Biosoft，Quebec，Canada)软件进行序列分析；应用Student’s t检验对F₂群体中纯合突变型、杂合突变型和野生型植株籽粒Ppo1基因表达差异和PPO活性进行显著性分析。

二、结果与分析

1、Ppo1突变体筛选

应用TILLING技术，在2491份M₂代EMS诱变群体中共检测到32个Ppo1基因突变体(表3)，推断Ppo1基因在该EMS诱变群体中的突变密度为1/187.5kb。根据突变位点在基因中的位置分类，24个位于外显子区，8个分布于内含子区。外显子区的点突变又分为8个错义突变和16个同义突变(图1)。突变体Ppo1基因序列分析显示，核苷酸从C到T的突变频率为43.8％，G到A的突变频率为53.1％，此外，还检测到1个A到G的特异突变位点(表3)。

表3利用TILLING技术筛选获得Ppo1突变体信息

注：Hom纯合突变型；Het杂合突变型。表中的各突变体，对于Ppo1基因而言，仅存在对应的一处突变，即一个突变体不存在Ppo1基因内的多处突变。错义突变体M091098(G1160A)中突变后的Ppo-D1基因的基因组序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3编码SEQID No.1所示的突变后Ppo-D1蛋白。错义突变体M091507(C1045T)中突变后的Ppo-A1基因的基因组序列如SEQ ID No.4所示，SEQ ID No.4编码SEQ ID No.2所示的突变后Ppo-A1蛋白。

2、突变体Ppo1基因表达分析

为了减小其他突变背景影响，将8个含有Ppo1基因错义突变位点的纯合M₃植株与野生型植株进行杂交，构建F₂群体，用于分析突变位点对基因表达水平的影响。如图2所示：

M091098(G1160A)突变体构建的F₂群体中，花后14-28天，纯合突变型和杂合突变型植株籽粒Ppo1基因总表达量显著低于野生型植株，分别降低了14.3％-54.4％和10.1％-22.4％，而花后7天各基因型间Ppo1表达水平差异不显著。花后14-28天，纯合突变型和杂合突变型植株籽粒Ppo-A1和Ppo-B1基因表达比野生型植株显著降低，降低了19.9％-66.4％和37.0％-61.3％，而花后7天时，其表达水平在突变植株中有所上升。在籽粒发育各时期，纯合突变型植株Ppo-D1基因表达显著低于野生型植株，降低了19.5％-60.7％。

M091507(C1045T)突变体构建的F₂群体中，在籽粒发育各时期，纯合突变型和杂合突变型植株Ppo1基因总表达量显著低于野生型植株，降低了14.1％-37.1％和6.7％-35.9％。除了花后28天，纯合突变型植株和杂合突变型植株籽粒发育各时期Ppo-A1基因表达显著低于野生型植株，降低了15.5％-41.9％和4.1％-33.9％。在花后14-28天，纯合突变型植株籽粒Ppo-B1和Ppo-D1基因表达比野生型植株显著降低，而花后7天表达差异不显著。

3、突变体籽粒PPO活性分析

如图3所示，在突变体M091098和M091507构建的F₂群体中，纯合突变型植株籽粒PPO活性显著低于杂合突变型和野生型植株，分别降低至野生型植株的71.8％和70.3％。而杂合突变型植株与野生型植株相比，籽粒PPO活性差异不显著。

三、讨论

1、Ppo基因组织特异性

多酚氧化酶活性与面制食品的酶促褐变、植物生长发育和抗病性密切相关(胡瑞波和田纪春，2004；杨雪等，2014)。在小麦品质育种中，人们希望降低籽粒PPO活性，以减少面制食品的酶促褐变；而植株PPO活性高的品种一般抗病性较强。前人研究表明，小麦Ppo基因属于多基因家族，至少存在15种基因，分为3大类(Jukanti等，2004；Massa等，2007；司红起，2008)。第I类为组织特异表达基因，与组织生理发育相关；第II类为种子储藏基因，参与种子萌发；第III类为抗耐性基因，与抗病抗逆有关。不同Ppo基因表达具有时空差异和组织特异性(Jukanti等，2006；陈锋等，2011)。因此，可以对不同组织器官的Ppo基因进行特异性调控，抑制籽粒Ppo1基因表达，降低籽粒PPO活性；增强其他营养器官Ppo基因的表达，提高其抗病抗逆性和促进植株生长发育。

小麦籽粒PPO活性主要受第二同源染色体上Ppo1基因的调控，尤其是Ppo-A1和Ppo-D1(Chang等，2006；王欣等，2011)。因此，本发明根据小麦Ppo1基因A、B和D同源基因间序列，设计特异性引物用于EMS突变体库的筛选，以期获得籽粒PPO活性显著降低而生理和农艺性状未受影响的突变体，为面制品颜色遗传改良育种提供重要种质资源。

2、Ppo1突变体筛选

TILLING技术有效结合了化学诱变的高频率点突变及快速简便的突变体检测技术，能够快速有效地从突变群体中检测到目的基因的点突变，逐渐成为植物功能基因组学、作物遗传育种以及自然资源遗传多样性评估等研究的重要手段(Till等，2018)，已被广泛应用于水稻(Till等，2007)、小麦(Acevedo-Garcia等，2017)等20多种植物。

本发明采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测CEL I酶切产物，既不使用荧光标记引物，又不使用昂贵的变性凝胶电泳成像系统，有效地简化了实验流程，降低了实验成本，在一定程度上扩大TILLING的应用范围和工作效率。在2491份M₂代EMS诱变群体中共检测到32个Ppo1基因的突变植株，由于扩增片段150bp内的错配超出非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的检测范围，无法被检测到，因此推测Ppo1基因在该EMS诱变群体中的突变密度为1/187.5kb。

大量研究表明，小麦籽粒PPO活性高低与Ppo1基因表达量呈正相关(Jukanti等，2006；Anderson等，2006；Sun等，2011)。前人利用RNA干扰技术抑制Ppo基因表达，得到了无褐变的马铃薯品系(Halterman等，2016)。抑制Ppo1基因的表达，降低籽粒PPO活性，减少面粉及其制品的酶促褐变，是小麦品质育种的重要目标。本发明中，qRT-PCR分析结果显示，M091098(G1160A)和M091507(C1045T)突变位点显著降低了Ppo1基因表达，与野生型植株相比，纯合突变型植株分别降低了14.3％-54.4％和14.1％-37.1％(图2)，进而导致籽粒PPO活性的显著下降，降低了28.8％和29.7％(图3)。

3、籽粒PPO活性遗传改良的重要种质资源

我国面制食品以面条、馒头、水饺等蒸煮类食品为主，细腻洁白的面制品备受消费者青睐。加工与储藏过程中的褐变不仅影响面制品的表观色泽，还直接影响其食品特性和营养价值。因此，降低小麦籽粒PPO活性是我国小麦品质改良的重要目标。缺乏突破性低籽粒PPO活性的种质资源成为培育低籽粒PPO活性小麦新品种的重要瓶颈，严重制约了我国小麦面制品颜色的遗传改良。

TILLING技术仅需要较小的群体，便可创制并检测出大量的目标基因变异位点，获得多个不同类型的突变体。由于不涉及转基因操作，获得的优异突变体可以直接用于育种实践，为作物育种提供新材料、新种质，成为作物功能基因组和遗传改良研究的重要手段(侯彩玲等，2008；Slade等，2012)。

小麦籽粒PPO活性主要受Ppo-A1和Ppo-D1两个主效基因调控(张立平等，2005；Singh等，2009)。大量研究表明，不同基因组合类型PPO活性高低顺序为Ppo-A1a/Ppo-D1b﹥Ppo-A1a/Ppo-D1a﹥Ppo-A1b/Ppo-D1b﹥Ppo-A1b/Ppo-D1a(陈杰等，2013；王黎明等，2017)。本研究中的EMS突变体源于济麦20和济麦22两个综合性状优良的小麦品种，两者籽粒PPO活性较低，基因型分别为低PPO活性组合Ppo-A1b/Ppo-D1a和Ppo-A1b/Ppo-D1b。因此，本发明利用TILLING技术筛选获得的两个籽粒PPO活性显著降低而农艺性状无明显影响的突变体M091098和M091507，可用于低籽粒PPO活性小麦新品种的选育，以加快小麦面制品颜色遗传改良。

四、结论

小麦籽粒PPO活性是造成面制品颜色褐变的最主要原因。本发明以济麦20和济麦22的EMS诱变群体为材料，利用TILLING技术筛选小麦籽粒PPO活性主效基因Ppo1的突变体。共获得32个Ppo1基因的突变体，包含8个错义突变，16个同义突变和8个内含子突变。籽粒Ppo1基因表达水平和PPO活性检测分析显示，M091098(G1160A)和M091507(C1045T)突变位点显著降低了Ppo1基因表达(10.1％-54.4％和6.7％-37.1％)和籽粒PPO活性(28.2％和29.7％)，表明这些突变位点对PPO功能产生重要影响。M091098和M091507突变体作为重要种质资源用于低籽粒PPO活性小麦新品种的选育，加快面制品颜色性状的遗传改良。

<110> 山东省农业科学院作物研究所

<120> 小麦籽粒多酚氧化酶基因Ppo1突变体及其应用

<130> GNCLN200631

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 577

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Glu Ser Ser Arg Met Pro Leu Ser Ala Thr Ser Arg Met Ser Cys

1 5 10 15

Ser Leu Gln Thr Leu Ala Arg Arg Asn Leu Leu Arg Ala Leu His Arg

20 25 30

Arg Lys Asp Ala Arg Gln Pro Arg Arg Leu Ser Ile Ser Cys Glu Ala

35 40 45

Thr Gly Gly Arg Arg Val Asp Arg Arg Glu Val Leu Leu Gly Leu Gly

50 55 60

Gly Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Thr Asp Gln Gly Arg Gly Ala Ile

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ile Gln Ala Pro Asp Leu Ser Asn Cys Gln Thr Pro Ala

85 90 95

Leu Pro Asn Thr Pro Pro Asp Thr Asn Cys Cys Pro Thr Pro Gly Thr

100 105 110

Gly Ile Thr Asp Phe Glu Leu Pro Pro Ala Ser Ser Pro Leu Arg Val

115 120 125

Arg Pro Ala Ala His Leu Val Asp Ala Glu Tyr Leu Ala Lys Tyr Glu

130 135 140

Arg Ala Val Ala Leu Met Lys Gln Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg Ser

145 150 155 160

Phe Glu Gln Gln Trp His Val His Cys Ala Tyr Cys Asp Ala Ala Tyr

165 170 175

Asp Gln Val Gly Phe Pro Asp Leu Glu Leu Gln Ile His Asn Cys Trp

180 185 190

Leu Phe Phe Pro Trp His Arg Phe Tyr Leu Tyr Phe His Glu Arg Ile

195 200 205

Leu Gly Lys Leu Ile Gly Asp Asp Thr Phe Ala Leu Pro Phe Trp Asn

210 215 220

Trp Asp Ala Pro Ala Gly Met Lys Leu Pro Val Ile Tyr Ala Asn Arg

225 230 235 240

Ser Ser Pro Leu Tyr Asp Glu Arg Arg Asp Pro Ala His Gln Pro Pro

245 250 255

Val Leu Val Asp Leu Asp Tyr Ser Gly Thr Asp Ala Asn Ile Pro Arg

260 265 270

Asp Gln Gln Ile Asp Glu Asn Leu Lys Ile Met Tyr Arg Gln Met Ile

275 280 285

Ser Asn Ala Lys Lys Thr Leu Leu Phe Leu Arg Gln Pro Tyr Arg Ala

290 295 300

Gly Asp Gln Pro Asp Pro Gly Ala Gly Ser Val Glu Asn Val Pro His

305 310 315 320

Gly Pro Val His Asn Trp Thr Gly Asp Pro Arg Gln Pro Asn Gly Glu

325 330 335

Asp Met Gly Asn Phe Tyr Ser Ala Ala Arg Asp Pro Ile Phe Phe Ala

340 345 350

His His Gly Asn Ile Asp Arg Leu Trp His Val Trp Arg Gly Leu Arg

355 360 365

Pro Ser Asn Thr Asp Phe Thr Asp Pro Asp Trp Leu Asp Ala Gly Phe

370 375 380

Leu Phe Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Pro Val Arg Val Arg Val Arg Asp

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Cys Leu Asp Pro Ala Ala Leu Arg Tyr Thr Tyr Gln Asp Val Gly Leu

405 410 415

Pro Trp Leu Asn Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ser Gly Gly Thr Pro Ala

420 425 430

Pro Ala Thr Thr Gly Thr Leu Pro Ala Thr Leu Asp Arg Thr Ile Arg

435 440 445

Val Thr Val Thr Arg Pro Arg Val Ser Arg Ser Arg Arg Glu Lys Asp

450 455 460

Glu Glu Glu Glu Val Leu Val Val Glu Gly Ile Glu Ile Ala Asp His

465 470 475 480

Phe Asn Lys Phe Val Lys Phe Asp Val Leu Val Asn Glu Pro Glu Gly

485 490 495

Gly Val Gly Gly Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Tyr Cys Ala Gly Ser

500 505 510

Phe Ala His Thr Pro His Met Val Arg Pro Glu Glu Met Arg Lys Gly

515 520 525

Pro Val Lys Thr Val Ala Arg Phe Gly Val Cys Asp Leu Met Asp Asp

530 535 540

Ile Gly Ala Asp Gly Asp Gln Thr Val Val Val Ser Leu Val Pro Arg

545 550 555 560

Cys Gly Gly Asp Leu Val Thr Ile Gly Gly Val Ser Ile Ser Tyr Val

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Lys

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<211> 577

<212> PRT

<213> Artificial sequence

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Lys

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<211> 1999

<212> DNA

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cttgcgcgcc gcaaccttct ccgtgccctt caccgccgga aggacgcgag gcagccacgg 120

cgtctctcaa tctcatgtga ggcgaccggc ggccgccgcg tcgaccgccg tgaggtgctc 180

ctcggcctcg gcggcgccgc agctgccggg ctggccacgg accaaggtcg aggcgcgatc 240

gccgcgccca tccaggcccc ggacctcagc aactgccaaa cgcccgccct cccgaacacg 300

ccgccggata ccaactgctg cccgacgccc ggcaccggca tcaccgactt cgagctgccg 360

cccgcctcct cgccgctccg cgtgcgtccg gccgcgcacc tggtggacgc ggagtacctg 420

gccaagtacg agagggccgt ggcgctcatg aagcagctgc ccgccgatga cccccgcagc 480

ttcgagcagc agtggcacgt gcactgtgcc tactgcgacg ccgcctacga ccaggtcggg 540

ttcccggacc tggagctcca gatacacaac tgctggctct tcttcccatg gcacaggttc 600

gtatatatgg tcaatgggtt atgggtgaga cgacctgcac ctttctgtgc tgaacctcaa 660

ggagccgtca cttgtccctg cgtgcgtttg ctgaacgtgc aggttctacc tctacttcca 720

cgagaggatc ctcggcaagc tcatcggcga cgacaccttc gcgctgccgt tctggaactg 780

ggacgcgccg gccggcatga agctgccggt catctacgcc aacagatcgt cgccgctcta 840

cgacgagagg cgcgaccccg cccaccagcc gccggtactg gtcgaccttg actacagtgg 900

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ccaggccagt atttctaatt aacaacctca agaatcccta aaaatattta gcaacttcaa 1020

aaatattggg gtttgttttg cgaaacaact tcaaaaacgt tgttacgtaa ccacagaacc 1080

actggtcatt aaattaaata acacaaatgt acatacacat cagatgattt caaacgcgaa 1140

gaagacgctg ctgttcctga gacagccgta ccgcgccggc gaccagccgg acccgggcgc 1200

gggctccgtg gagaacgtgc cgcacggccc ggtgcataac tggacaggcg acccaaggca 1260

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<211> 2152

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cggcggtgag ctggtcaccg taggcggcgt cagcatcagc tacctcaagt ga 2152

Claims

1.蛋白质，为蛋白质A或/和蛋白质B；

所述蛋白质A为如下任一：

(A1)将Ppo-D1蛋白的第299位的甘氨酸替换为精氨酸后得到的SEQ ID No.1所示的蛋白质；

(A2)在(A1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述蛋白质B为如下任一：

(B1)将Ppo-A1蛋白的第251位的脯氨酸替换为亮氨酸后得到的SEQ ID No.2所示的蛋白质；

(B2)在(B1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因为基因A或/和基因B；

所述基因A为SEQ ID No.3所示的DNA分子；

所述基因B为SEQ ID No.4所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用：

6.一种降低小麦籽粒PPO活性的方法，包括如下步骤(D1)或/和(D2)：

(D1)仅将受体小麦基因组中编码Ppo-D1蛋白的第299位的甘氨酸的密码子替换为编码精氨酸的密码子；

将所述受体小麦基因组中编码Ppo-D1蛋白的第299位的甘氨酸的密码子替换为编码精氨酸的密码子为将所述受体小麦基因组中编码Ppo-D1蛋白的基因替换为编码由SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；

(D2)仅将受体小麦基因组中编码Ppo-A1蛋白的第251位的脯氨酸的密码子替换为编码亮氨酸的密码子；

将所述受体小麦基因组中编码Ppo-A1蛋白的第251位的脯氨酸的密码子替换为编码亮氨酸的密码子为将所述受体小麦基因组中编码Ppo-A1蛋白的基因替换为编码由SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述(D1)中，所述编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因为SEQ ID No.3所示DNA分子；

所述(D2)中，所述编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因为SEQID No.4所示DNA分子。

8.如下任一应用：

(D1)权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或权利要求5所述应用或权利要求6或7所述方法在小麦面粉或面制品颜色改良中的应用；

(D2)利用权利要求6或7所述方法培育得到的籽粒PPO活性降低的小麦品种在小麦育种中的应用。