CN108715903A

CN108715903A - 水稻α-异丙基苹果酸合酶基因的应用

Info

Publication number: CN108715903A
Application number: CN201810416551.4A
Authority: CN
Inventors: 张红生; 王州飞; 程金平; 何永奇; 唐海娟
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2018-10-30

Abstract

本发明公开了水稻α‑异丙基苹果酸合酶基因的应用。所述的基因OsIPMS1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及编码相应的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明在水稻中首次报道了OsIPMS1基因能调控水稻种子活力，通过试验表明突变该基因影响正常条件种子发芽速度、幼苗生长。证明本发明OsIPMS1基因调控了水稻种子活力，利用该基因有助于筛选和培育高种子活力水稻品种，有利于直播稻生产。

Description

水稻α-异丙基苹果酸合酶基因的应用

技术领域

本发明属于种子生物技术领域，涉及水稻α-异丙基苹果酸合酶基因的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一。近年来，随着经济的发展，农村劳动力日益短缺，直播稻生产变得越来越普遍，高活力水稻品种培育具有重要意义。在水稻直播生产中，播种期间往往会遇到低温、洪涝、干旱等不利条件，低活力种子在田间往往表现为种子发芽速度缓慢、出苗率低和抗性差等，最终引起田间幼苗腐烂、坏死及杂草丛生等现象，对直播稻生产带来不利。选育高活力水稻品种，不仅可以提高田间种子发芽速度和整齐度，增强幼苗抵御不良环境条件能力，减少田间杂草，同时可以减少用种量，节约种子费用，对提高直播稻产量和品质具有重要意义。

为培育高活力水稻品种，目前已有不少学者通过构建不同的遗传群体，定位了多个控制种子萌发相关的QTLs，克隆了一些与种子萌发相关基因，如：qLTG3-1、Sdr4、OsVP1、OsGA20ox1、OsFbx352及GD1等，但促进水稻种子发芽速度和幼苗生长的相关基因鲜有报道。利用水稻种子活力基因，鉴定具有高活力水稻品种或资源的应用较少。因此，利用水稻高活力基因α-异丙基苹果酸合酶OsIPMS1，为筛选、鉴定或培育高活力水稻品种提供技术支撑，对直播稻生产发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一个控制水稻种子活力α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1的分离克隆、功能验证和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明的一个来自水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的水稻OsIPMS1基因在筛选、鉴定或培育高活力水稻品种中的应用。

本发明所述的水稻OsIPMS1蛋白在筛选、鉴定或培育高活力水稻品种中的应用。

本发明所述的水稻OsIPMS1基因突变体获得和基因功能验证，包括如下步骤：

(1)获得水稻OsIPMS1基因的核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)用PCR技术获得OsIPMS1基因的目标片段，将基因的目标片段构建到CH载体中；

(3)将步骤(2)得到的带有OsIPMS1基因的目标片段的CH载体构建到pCAMBIA1300载体上，获得p1300-CH-Target载体；

(4)将步骤(3)得到的带有OsIPMS1基因目标片段的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化水稻；

(5)水稻突变体筛选与鉴定，并在正常条件下鉴定种子活力。

进一步的，在步骤(1)中利用从水稻cDNA为模板PCR克隆出该基因的cDNA序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

进一步的，在步骤(2)中克隆OsIPMS1基因第一个外显子特异的20bp的目标片段，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示，将该片段与CH载体相连，获得CH-Target重组载体。

在步骤(3)中，用EcoRI HF和Hind III分别酶切pCAMBIA1300和CH-target载体，酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶检测，分别切胶回收载体pCAMBIA1300和片段CH-target；利用T4Ligase获得p1300-CH-Target载体。

在步骤(5)中构建的水稻OsIPMS1CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列如序列表SEQ IDNO.7所示；筛选纯合突变体所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.8所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.9所示。水稻种子活力鉴定包括正常条件下种子发芽速度、幼苗生长。

本发明所述的一种检测种子萌发期OsIPMS1基因表达水平的方法，包括如下步骤：

(1)取不同萌发期水稻种子；

(2)用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA；

(3)用II Reverse Transcriptase system(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒反转录形成cDNA，以其为模板；

(4)用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR检测基因表达，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.10所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.11所示。

进一步的，在步骤(1)中水稻种子在含10mL蒸馏水的培养皿(直径＝9cm)中30℃条件下培养，分别在吸胀发芽4、8、12、18、24、36、48h后取样；所取的种子样品经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，贮存于-80℃，每个时间点取样三份。

在步骤(4)中，采用水稻内参基因18sRNA引物，所述上游引物的序列如序列表SEQID NO.12所示，所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.13所示。

有益效果：本发明从水稻中分离克隆了OsIPMS1基因，并鉴定了该基因在种子活力调控方面的功能，对于高活力水稻品种筛选、鉴定和培育具有重要意义。

本发明具有如下优点：

(1)本发明从水稻中分离、克隆获得OsIPMS1基因，通过构建CRISPR/Cas9突变体首次证明了该基因参与水稻种子活力的调控。

(2)本发明为筛选高种子活力水稻品种提供了基础，也为改良提高水稻种子活力提供了重要的基因资源，对直播稻生产具有重要意义。

附图说明

图1：水稻OsIPMS1突变体在正常条件下的种子活力表现

图2：水稻OsIPMS1基因在种子萌发过程中的表达情况

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，实施例中所用方法无特别说明均为常规方法，所用引物、测序由南京思普金生物科技有限公司完成；实验中用到的各种限制性内切酶、连接酶、DNA Marker、Tag DNA聚合酶、dNTPs等购自宝日医生物技术(北京)有限公司；反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及基因组提取试剂盒购于美基生物科技有限公司，方法均参照说明书进行。

实施例1：基因克隆

利用粳稻品种日本晴cDNA为模板PCR克隆出OsIPMS1基因的序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.4所示。获得水稻OsIPMS1基因的核苷酸序列及氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。

实施例2：突变体构建

分析目标基因，在该基因的CDs区序列中找到NGG(N为A,T,C或G)，最好是AGG，取NGG前面的20bp作为target序列，克隆该目标片段，所述上游引物序列如序列表SEQ IDNO.5所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示。利用T4连接酶将上述OsIPMS1基因中20bp的目标片段与CH载体相连，获得CH-Target重组载体。用EcoRI HF和Hind III分别酶切pCAMBIA1300和CH-target载体，酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶检测，分别切胶回收载体pCAMBIA1300和片段CH-target；利用T4Ligase获得p1300-CH-Target重组载体。

构建的水稻OsIPMS1CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列如序列表SEQ ID NO.7所示；得到的含有p1300-CH-Target载体的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化野生型的粳稻品种日本晴；筛选纯合突变体所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.8所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.9所示。

实施例3：基因突变体表型分析

利用构建的OsIPMS1CRISPR/Cas9突变体osipms1a、osipms1b种子，以及野生型日本晴(WT)水稻品种，进行种子发芽试验。具体方法如下：每次重复挑选健康饱满的种子50粒，用0.1％的氯化汞溶液表面消毒5min，蒸馏水冲洗3次，将种子表面擦干，置于垫有两层滤纸的培养皿(直径9cm)中，加入10mL蒸馏水，放置30℃条件下光照/黑暗各12h培养5d后，最后统计成苗率。试验重复3次。结果表明，与对照种子比较，突变体种子发芽速度变慢，参差不齐，幼苗生长显著变弱(图1)。可见，该基因对提高种子发芽速度、整齐度及幼苗生长具有重要作用。

实施例4：种子萌发期基因表达分析

利用粳稻品种日本晴，每次重复挑选健康饱满的种子50粒，用0.1％的氯化汞溶液表面消毒5min，蒸馏水冲洗3次，将种子表面擦干，置于垫有两层滤纸的培养皿(直径9cm)中，加入10mL蒸馏水，放置30℃黑暗培养箱中分别吸胀4、8、12、18、24、36、48h后，分别取样。种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃。试验重复3次。

用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA；用II Reverse Transcriptase system(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒反转录形成cDNA，以其为模板；用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR检测OsIPMS1的引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.10所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.11所示。采用水稻内参基因18sRNA引物，所述上游引物的序列如序列表SEQ ID NO.12所示，所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.13所示。

结果表明，在种子萌发过程中OsIPMS1基因的表达量存在先上升后下降再上升的变化趋势(图2)。在种子吸胀8h时，OsIPMS1基因出现第1次高诱导表达；在种子吸胀18-36h时，OsIPMS1基因表达基本保持不变；当种子出现发芽时，即吸胀48h时，OsIPMS1基因出现第2次高诱导表达。可见，该基因在种子萌发过程中得到诱导表达，基因表达对种子发芽具有重要作用。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水稻α-异丙基苹果酸合酶基因的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1908

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atggcctcct ccctcctctc ctccccaaaa ccctcctcct tctcctccgc aaaccccacc 60

tccactccac gcccacgcgc ccaaactctc tcccccttcc gcgccgccgc cccacgcttc 120

tcccatggcc tcgccaccgc cgccgccgcc gcaaacccta gcgcctcccg ccgctgctac 180

caccgcgcct tcgcccgccc cgtccgggcg tccatggcgc agccgcggcg cccggagtac 240

gtccccaacc gcatcgacga ccccaactac gtccgcatct tcgacaccac cctccgcgac 300

ggggagcagt cccccggggc caccatgacc agcgccgaga agctcgtcgt cgcgcgccag 360

ctcgcccgcc tcggcgtcga catcatcgag gccgggttcc cggcctcctc ccccgacgac 420

ctcgacgccg tgcgctccat cgccatcgag gtcgggaaca cgcccgtcgg ggaggacggc 480

cacgtgccgg tcatctgtgg cctctcgaga tgcaataagc gagacattga tgctgcctgg 540

gaggccgtgc ggcacgcgcg gcggccgcgc atccacacct tcattgccac cagcgagatc 600

catatgcagc acaagctaag gaagacgccc gagcaggtgg tggccattgc caaggaaatg 660

gtggcctacg cccgcagcct aggctgccct gatgtcgagt tcagccctga agacgctggc 720

aggtcaaaca gagagtttct atatcatatt ctagaggaag tcataaaagc tggagcaaca 780

acactcaata tcccagacac tgttggatac actcttcctt atgaatttgg gaagctaatt 840

gctgatataa aagcaaacac tccaggaatt gaaaatgcta ttatttctac tcattgccag 900

aatgaccttg gtctagcaac cgccaataca ttagcgggcg ctcatgcagg agcacggcaa 960

ttagaggtga ctatcaacgg tattggtgaa agggctggaa atgcttcttt ggaagaggtt 1020

gtgatggcaa ttaaatgtcg ccgagagctc ttaggaggtc tgtatactgg aatcaatacc 1080

caacatatca ctatgtcaag caaaatggta caagagcaca gtggacttca tgtacaacca 1140

cataaagcta ttgtcggtgc caatgccttt gcacatgaaa gtggaattca tcaggatggg 1200

atgcttaaat acaaaggaac ttatgaaata atttctcctg atgatattgg tctaacacgt 1260

gcaaacgagt ttggtattgt tcttgggaaa ctcagtggaa ggcatgctgt gagatctaaa 1320

ctagtggagc ttggatatga aatcactgac aaggaatttg aggatttctt taaacgctac 1380

aaagaggttg cagagaagaa aaagcgtgta actgatgaag acattgaggc gctgttgtct 1440

gatgagatat ttcagcccaa ggttttttgg tcccttgctg atgtacaggc aacttgtgga 1500

acacttggtc tgtctacagc aactgtcaaa ctgataggtc cggatggaga ggagaagatt 1560

gcatgtgcag ttggaacagg tccagttgat gcagcttaca aggctgttga tgatataata 1620

cagatcccaa ctgttcttcg agaatatagc atgacatcgg tcacagaagg cattgatgca 1680

attgcaacta ctagagtggt tgtcactgga gatgttagcg actctaaaca tgctttgact 1740

ggtcactcct tcagccgggc attcagtggg agtggtgccg cactggatat tgttgtttcc 1800

agtgtgcgag cttacctgag tgccctgaac aagatgtcca gttttgttgg ggctatcaag 1860

gctagtagtg aagtatctga aagccaaaga gttcaaacca cagaatga 1908

<210> 2

<211> 635

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Pro Lys Pro Ser Ser Phe Ser Ser

1 5 10 15

Ala Asn Pro Thr Ser Thr Pro Arg Pro Arg Ala Gln Thr Leu Ser Pro

20 25 30

Phe Arg Ala Ala Ala Pro Arg Phe Ser His Gly Leu Ala Thr Ala Ala

35 40 45

Ala Ala Ala Asn Pro Ser Ala Ser Arg Arg Cys Tyr His Arg Ala Phe

50 55 60

Ala Arg Pro Val Arg Ala Ser Met Ala Gln Pro Arg Arg Pro Glu Tyr

65 70 75 80

Val Pro Asn Arg Ile Asp Asp Pro Asn Tyr Val Arg Ile Phe Asp Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Ser Pro Gly Ala Thr Met Thr Ser Ala

100 105 110

Glu Lys Leu Val Val Ala Arg Gln Leu Ala Arg Leu Gly Val Asp Ile

115 120 125

Ile Glu Ala Gly Phe Pro Ala Ser Ser Pro Asp Asp Leu Asp Ala Val

130 135 140

Arg Ser Ile Ala Ile Glu Val Gly Asn Thr Pro Val Gly Glu Asp Gly

145 150 155 160

His Val Pro Val Ile Cys Gly Leu Ser Arg Cys Asn Lys Arg Asp Ile

165 170 175

Asp Ala Ala Trp Glu Ala Val Arg His Ala Arg Arg Pro Arg Ile His

180 185 190

Thr Phe Ile Ala Thr Ser Glu Ile His Met Gln His Lys Leu Arg Lys

195 200 205

Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Lys Glu Met Val Ala Tyr Ala

210 215 220

Arg Ser Leu Gly Cys Pro Asp Val Glu Phe Ser Pro Glu Asp Ala Gly

225 230 235 240

Arg Ser Asn Arg Glu Phe Leu Tyr His Ile Leu Glu Glu Val Ile Lys

245 250 255

Ala Gly Ala Thr Thr Leu Asn Ile Pro Asp Thr Val Gly Tyr Thr Leu

260 265 270

Pro Tyr Glu Phe Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ile Lys Ala Asn Thr Pro

275 280 285

Gly Ile Glu Asn Ala Ile Ile Ser Thr His Cys Gln Asn Asp Leu Gly

290 295 300

Leu Ala Thr Ala Asn Thr Leu Ala Gly Ala His Ala Gly Ala Arg Gln

305 310 315 320

Leu Glu Val Thr Ile Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Ala Ser

325 330 335

Leu Glu Glu Val Val Met Ala Ile Lys Cys Arg Arg Glu Leu Leu Gly

340 345 350

Gly Leu Tyr Thr Gly Ile Asn Thr Gln His Ile Thr Met Ser Ser Lys

355 360 365

Met Val Gln Glu His Ser Gly Leu His Val Gln Pro His Lys Ala Ile

370 375 380

Val Gly Ala Asn Ala Phe Ala His Glu Ser Gly Ile His Gln Asp Gly

385 390 395 400

Met Leu Lys Tyr Lys Gly Thr Tyr Glu Ile Ile Ser Pro Asp Asp Ile

405 410 415

Gly Leu Thr Arg Ala Asn Glu Phe Gly Ile Val Leu Gly Lys Leu Ser

420 425 430

Gly Arg His Ala Val Arg Ser Lys Leu Val Glu Leu Gly Tyr Glu Ile

435 440 445

Thr Asp Lys Glu Phe Glu Asp Phe Phe Lys Arg Tyr Lys Glu Val Ala

450 455 460

Glu Lys Lys Lys Arg Val Thr Asp Glu Asp Ile Glu Ala Leu Leu Ser

465 470 475 480

Asp Glu Ile Phe Gln Pro Lys Val Phe Trp Ser Leu Ala Asp Val Gln

485 490 495

Ala Thr Cys Gly Thr Leu Gly Leu Ser Thr Ala Thr Val Lys Leu Ile

500 505 510

Gly Pro Asp Gly Glu Glu Lys Ile Ala Cys Ala Val Gly Thr Gly Pro

515 520 525

Val Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Val Asp Asp Ile Ile Gln Ile Pro Thr

530 535 540

Val Leu Arg Glu Tyr Ser Met Thr Ser Val Thr Glu Gly Ile Asp Ala

545 550 555 560

Ile Ala Thr Thr Arg Val Val Val Thr Gly Asp Val Ser Asp Ser Lys

565 570 575

His Ala Leu Thr Gly His Ser Phe Ser Arg Ala Phe Ser Gly Ser Gly

580 585 590

Ala Ala Leu Asp Ile Val Val Ser Ser Val Arg Ala Tyr Leu Ser Ala

595 600 605

Leu Asn Lys Met Ser Ser Phe Val Gly Ala Ile Lys Ala Ser Ser Glu

610 615 620

Val Ser Glu Ser Gln Arg Val Gln Thr Thr Glu

625 630 635

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctacgtccct gccctttgta ca 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcattctgtg gtttgaactc tttgg 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggccgggaa cacgcccgtc gggg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacccccga cgggcgtgtt cccg 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggaacacgc ccgtcgggg 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attgctcatg tcatgtggtc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctttgaaacg caggatagaa 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccgagagct cttaggaggt ct 22

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttcccaaga acaataccaa actcg 25

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctatcaact ttcgatggta gg 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgttaaggga tttagattgt ac 22

Claims

1.水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1在筛选或培育高活力水稻品种中的应用。

2.权利要求1所述的水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1基因在提高水稻种子发芽速度以及促进幼苗生长的基因工程中的应用。