CN112626045A

CN112626045A - 水稻苹果酸合酶基因在调控粒型中的应用

Info

Publication number: CN112626045A
Application number: CN202011393060.6A
Authority: CN
Inventors: 何永奇; 王州飞; 赵佳
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-04-09

Abstract

本发明公开了水稻苹果酸合酶基因在调控粒型中的应用。所述的基因OsIPMS1、OsIPMS2核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，以及编码相应的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。本发明在水稻中首次报道了OsIPMS1、OsIPMS2基因能调控水稻种子籽粒大小，通过试验表明突变该基因提高种子粒长、粒宽和千粒重。证明本发明OsIPMS1、OsIPMS2基因调控了水稻种子粒型，利用该基因有助于筛选和培育大粒水稻品种。

Description

水稻苹果酸合酶基因在调控粒型中的应用

技术领域

本发明公开了两种水稻粒型相关蛋白，属于水稻基因工程领域，涉及两个控制水稻粒型α-异丙基苹果酸合酶基因的分离克隆、功能验证和应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国最重要的粮食作物之一。水稻产量是由植株穗数、每穗粒数、粒重三大因素决定，其中粒重是影响产量最重要的因素。粒重主要受籽粒大小影响，包括粒长、粒宽、粒厚，以及灌浆程度。改良籽粒大小是提高水稻产量、品质的最有效途径之一，是当前水稻遗传育种改良的重要目标。

发明内容

本发明的目的是提供两种水稻粒型相关蛋白基因的分离克隆、功能验证和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明的两个来自水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1、OsIPMS2，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1、OsIPMS2编码的蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

本发明所述的水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因或蛋白在筛选或培育大粒水稻品种中的应用。

本发明所述的水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因突变体获得和基因功能验证，包括如下步骤：

(1)获得水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因的核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)用PCR获得OsIPMS1、OsIPMS2基因的目标片段，将基因的目标片段构建到CH载体中；

(3)将步骤(2)得到的带有OsIPMS1、OsIPMS2基因的目标片段的CH载体构建到pCAMBIA1300载体上，获得p1300-CH-Target载体；

(4)将步骤(3)得到的带有OsIPMS1、OsIPMS2基因目标片段的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化水稻；

(5)水稻突变体筛选与鉴定，并对种子粒型进行鉴定。

进一步的，在步骤(1)中利用从水稻cDNA为模板PCR克隆出该基因的引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

进一步的，在步骤(2)中将OsIPMS1、OsIPMS2基因中20bp的目标片段与CH载体相连，获得CH-Target重组载体。

在步骤(3)中，用EcoRI HF和Hind III分别酶切pCAMBIA1300和CH-target载体，酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶检测，分别切胶回收载体pCAMBIA1300和片段CH-target；利用T4 Ligase获得p1300-CH-Target载体。

在步骤(5)中构建的水稻OsIPMS1、OsIPMS2 CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列如序列表SEQ ID NO.7所示；筛选纯合突变体所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。水稻种子粒型鉴定包括粒长、粒宽、粒厚和千粒重。

本发明所述的一种检测种子灌浆过程OsIPMS1、OsIPMS2基因表达水平的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)取不同灌浆期水稻种子；

(2)用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA；

(3)用

II Reverse Transcriptase system(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒反转录形成cDNA，以其为模板；

(4)用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR检测引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15所示。

进一步的，在步骤(1)中水稻种子分别在开花后0、7、14、21、28、35、42d后取样；种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃，每个时间点取样三份。

在步骤(4)中，采用水稻内参基因18sRNA引物，所述上游引物的序列如序列表SEQID NO.16所示，所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.17所示。

有益效果：

本发明从水稻中分离克隆了OsIPMS1、OsIPMS2基因，并鉴定了该基因在种子粒型调控方面的功能，对于改良水稻籽粒大小具有重要意义。

本发明具有如下优点：

(1)本发明从水稻中分离、克隆获得OsIPMS1、OsIPMS2基因，通过构建CRISPR/Cas9突变体首次证明了该基因参与水稻种子粒型调控。

(2)本发明为改良水稻品种籽粒大小提供了基础，也为改良提高水稻产量重要的基因资源，对生产具有重要意义。

附图说明

图1：水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因在种子灌浆过程中的表达情况

图2：水稻OsIPMS1、OsIPMS2突变体籽粒大小表型

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，实施例中所用方法无特别说明均为常规方法，所用引物、测序由广州天一辉远基因科技有限公司完成；实验中用到的各种限制性内切酶、连接酶、DNA Marker、Tag DNA聚合酶、dNTPs等购自宝日医生物技术(北京)有限公司；反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及基因组提取试剂盒购于美基生物科技有限公司，方法均参照说明书进行。

实施例1：基因克隆和突变体构建

利用水稻日本晴cDNA为模板PCR克隆出OsIPMS1、OsIPMS2基因的引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示。获得水稻OsIPMS1、OsIPMS2基因的核苷酸序列及氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

将OsIPMS1、OsIPMS2基因中20bp的目标片段与CH载体相连，获得CH-Target重组载体。用EcoRI HF和Hind III分别酶切pCAMBIA1300和CH-target载体，酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶检测，分别切胶回收载体pCAMBIA1300和片段CH-target；利用T4 Ligase获得p1300-CH-Target载体。

构建的水稻OsIPMS1、OsIPMS2 CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列如序列表SEQ IDNO.7所示；得到的带有OsIPMS1、OsIPMS2基因目标片段的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化水稻；筛选纯合突变体所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。

实施例2：基因突变体表型分析

利用构建的OsIPMS1、OsIPMS2 CRISPR/Cas9突变体osipms1-1、osipms1-2、osipms2-1、osipms2-2种子，以及野生型日本晴(WT)水稻品种，进行种子粒型比较。结果表明，与对照种子比较，突变体种子粒长显著变长，粒宽显著变宽(图1)。可见，突变该基因对提高籽粒大小具有重要作用。

实施例3：种子发育期基因表达分析

利用水稻日本晴品种，分别取开花后0、7、14、21、28、35、42d种子。不同时间样品经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃。用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA；用

II Reverse Transcriptasesystem(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒反转录形成cDNA，以其为模板；用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR检测引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。采用水稻内参基因18sRNA引物，所述上游引物的序列如序列表SEQ ID NO.16所示，所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.17所示。试验重复3次。结果表明，OsIPMS1和OsIPMS2基因主要在种子灌浆早期(7-14d)高表达(图2)。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 水稻苹果酸合酶基因在调控粒型中的应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1908

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggcctcct ccctcctctc ctccccaaaa ccctcctcct tctcctccgc aaaccccacc 60

tccactccac gcccacgcgc ccaaactctc tcccccttcc gcgccgccgc cccacgcttc 120

tcccatggcc tcgccaccgc cgccgccgcc gcaaacccta gcgcctcccg ccgctgctac 180

caccgcgcct tcgcccgccc cgtccgggcg tccatggcgc agccgcggcg cccggagtac 240

gtccccaacc gcatcgacga ccccaactac gtccgcatct tcgacaccac cctccgcgac 300

ggggagcagt cccccggggc caccatgacc agcgccgaga agctcgtcgt cgcgcgccag 360

ctcgcccgcc tcggcgtcga catcatcgag gccgggttcc cggcctcctc ccccgacgac 420

ctcgacgccg tgcgctccat cgccatcgag gtcgggaaca cgcccgtcgg ggaggacggc 480

cacgtgccgg tcatctgtgg cctctcgaga tgcaataagc gagacattga tgctgcctgg 540

gaggccgtgc ggcacgcgcg gcggccgcgc atccacacct tcattgccac cagcgagatc 600

catatgcagc acaagctaag gaagacgccc gagcaggtgg tggccattgc caaggaaatg 660

gtggcctacg cccgcagcct aggctgccct gatgtcgagt tcagccctga agacgctggc 720

aggtcaaaca gagagtttct atatcatatt ctagaggaag tcataaaagc tggagcaaca 780

acactcaata tcccagacac tgttggatac actcttcctt atgaatttgg gaagctaatt 840

gctgatataa aagcaaacac tccaggaatt gaaaatgcta ttatttctac tcattgccag 900

aatgaccttg gtctagcaac cgccaataca ttagcgggcg ctcatgcagg agcacggcaa 960

ttagaggtga ctatcaacgg tattggtgaa agggctggaa atgcttcttt ggaagaggtt 1020

gtgatggcaa ttaaatgtcg ccgagagctc ttaggaggtc tgtatactgg aatcaatacc 1080

caacatatca ctatgtcaag caaaatggta caagagcaca gtggacttca tgtacaacca 1140

cataaagcta ttgtcggtgc caatgccttt gcacatgaaa gtggaattca tcaggatggg 1200

atgcttaaat acaaaggaac ttatgaaata atttctcctg atgatattgg tctaacacgt 1260

gcaaacgagt ttggtattgt tcttgggaaa ctcagtggaa ggcatgctgt gagatctaaa 1320

ctagtggagc ttggatatga aatcactgac aaggaatttg aggatttctt taaacgctac 1380

aaagaggttg cagagaagaa aaagcgtgta actgatgaag acattgaggc gctgttgtct 1440

gatgagatat ttcagcccaa ggttttttgg tcccttgctg atgtacaggc aacttgtgga 1500

acacttggtc tgtctacagc aactgtcaaa ctgataggtc cggatggaga ggagaagatt 1560

gcatgtgcag ttggaacagg tccagttgat gcagcttaca aggctgttga tgatataata 1620

cagatcccaa ctgttcttcg agaatatagc atgacatcgg tcacagaagg cattgatgca 1680

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<210> 2

<211> 1908

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

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<210> 3

<211> 635

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

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Met Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Pro Lys Pro Ser Ser Phe Ser Ser

1 5 10 15

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20 25 30

Phe Arg Ala Ala Ala Pro Arg Phe Ser His Gly Leu Ala Thr Ala Ala

35 40 45

Ala Ala Ala Asn Pro Ser Ala Ser Arg Arg Cys Tyr His Arg Ala Phe

50 55 60

Ala Arg Pro Val Arg Ala Ser Met Ala Gln Pro Arg Arg Pro Glu Tyr

65 70 75 80

Val Pro Asn Arg Ile Asp Asp Pro Asn Tyr Val Arg Ile Phe Asp Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Ser Pro Gly Ala Thr Met Thr Ser Ala

100 105 110

Glu Lys Leu Val Val Ala Arg Gln Leu Ala Arg Leu Gly Val Asp Ile

115 120 125

Ile Glu Ala Gly Phe Pro Ala Ser Ser Pro Asp Asp Leu Asp Ala Val

130 135 140

Arg Ser Ile Ala Ile Glu Val Gly Asn Thr Pro Val Gly Glu Asp Gly

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His Val Pro Val Ile Cys Gly Leu Ser Arg Cys Asn Lys Arg Asp Ile

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Asp Ala Ala Trp Glu Ala Val Arg His Ala Arg Arg Pro Arg Ile His

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Thr Phe Ile Ala Thr Ser Glu Ile His Met Gln His Lys Leu Arg Lys

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Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Lys Glu Met Val Ala Tyr Ala

210 215 220

Arg Ser Leu Gly Cys Pro Asp Val Glu Phe Ser Pro Glu Asp Ala Gly

225 230 235 240

Arg Ser Asn Arg Glu Phe Leu Tyr His Ile Leu Glu Glu Val Ile Lys

245 250 255

Ala Gly Ala Thr Thr Leu Asn Ile Pro Asp Thr Val Gly Tyr Thr Leu

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Pro Tyr Glu Phe Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ile Lys Ala Asn Thr Pro

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Gly Ile Glu Asn Ala Ile Ile Ser Thr His Cys Gln Asn Asp Leu Gly

290 295 300

Leu Ala Thr Ala Asn Thr Leu Ala Gly Ala His Ala Gly Ala Arg Gln

305 310 315 320

Leu Glu Val Thr Ile Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Ala Ser

325 330 335

Leu Glu Glu Val Val Met Ala Ile Lys Cys Arg Arg Glu Leu Leu Gly

340 345 350

Gly Leu Tyr Thr Gly Ile Asn Thr Gln His Ile Thr Met Ser Ser Lys

355 360 365

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370 375 380

Val Gly Ala Asn Ala Phe Ala His Glu Ser Gly Ile His Gln Asp Gly

385 390 395 400

Met Leu Lys Tyr Lys Gly Thr Tyr Glu Ile Ile Ser Pro Asp Asp Ile

405 410 415

Gly Leu Thr Arg Ala Asn Glu Phe Gly Ile Val Leu Gly Lys Leu Ser

420 425 430

Gly Arg His Ala Val Arg Ser Lys Leu Val Glu Leu Gly Tyr Glu Ile

435 440 445

Thr Asp Lys Glu Phe Glu Asp Phe Phe Lys Arg Tyr Lys Glu Val Ala

450 455 460

Glu Lys Lys Lys Arg Val Thr Asp Glu Asp Ile Glu Ala Leu Leu Ser

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Asp Glu Ile Phe Gln Pro Lys Val Phe Trp Ser Leu Ala Asp Val Gln

485 490 495

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500 505 510

Gly Pro Asp Gly Glu Glu Lys Ile Ala Cys Ala Val Gly Thr Gly Pro

515 520 525

Val Asp Ala Ala Tyr Lys Ala Val Asp Asp Ile Ile Gln Ile Pro Thr

530 535 540

Val Leu Arg Glu Tyr Ser Met Thr Ser Val Thr Glu Gly Ile Asp Ala

545 550 555 560

Ile Ala Thr Thr Arg Val Val Val Thr Gly Asp Val Ser Asp Ser Lys

565 570 575

His Ala Leu Thr Gly His Ser Phe Ser Arg Ala Phe Ser Gly Ser Gly

580 585 590

Ala Ala Leu Asp Ile Val Val Ser Ser Val Arg Ala Tyr Leu Ser Ala

595 600 605

Leu Asn Lys Met Ser Ser Phe Val Gly Ala Ile Lys Ala Ser Ser Glu

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Val Ser Glu Ser Gln Arg Val Gln Thr Thr Glu

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<210> 4

<211> 635

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

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Phe Arg Ala Ala Ala Pro Arg Phe Ser His Gly Leu Ala Thr Ala Ala

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Ala Ala Ala Asn Pro Ser Ala Ser Arg Arg Cys Tyr His Arg Ala Phe

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Arg Ser Ile Ala Ile Glu Val Gly Asn Thr Pro Val Gly Glu Asp Gly

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Arg Ser Asn Arg Glu Phe Leu Tyr His Ile Leu Glu Glu Val Ile Lys

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Val Ser Glu Ser Gln Arg Val Gln Thr Thr Glu

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcctcct ccctcctct 19

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<211> 25

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<400> 6

tcattctgtg gtttgaactc tttgg 25

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<211> 22

<212> DNA

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<400> 12

gccgagagct cttaggaggt ct 22

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgtcgagaac tcttaggagg tctgta 26

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttcccaaga acaataccaa actcg 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttcccaaga acaataccaa actca 25

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cctatcaact ttcgatggta gg 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgttaaggga tttagattgt ac 22

Claims

1.两个来自水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1和OsIPMS2，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的水稻α-异丙基苹果酸合酶基因OsIPMS1和OsIPMS2编码的蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1所述的水稻OsIPMS1和OsIPMS2基因或权利要求2中所述的OsIPMS1和OsIPMS2蛋白在筛选或培育大粒水稻品种中的应用。

4.根据权利要求3所述的基因水稻突变体获得和基因功能验证，其特征在于包括如下步骤：

(1)获得水稻OsIPMS1和OsIPMS2基因的核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)用PCR获得OsIPMS1和OsIPMS2基因的目标片段，将基因的目标片段构建到CH载体中；

(3)将步骤(2)得到的带有OsIPMS1和OsIPMS2基因的目标片段的CH载体构建到pCAMBIA1300载体上，获得p1300-CH-Target载体；

(4)将步骤(3)得到的带有OsIPMS1和OsIPMS2基因目标片段的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化水稻；

(5)水稻突变体筛选与鉴定，并鉴定种子粒型。

5.根据权利要求4所述的基因突变体获得方法，其特征在于：利用从水稻cDNA为模板PCR克隆出该基因的引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

进一步的，在步骤(2)中将OsIPMS1和OsIPMS2基因中20bp的目标片段与CH载体相连，获得CH-Target重组载体。

在步骤(3)中，用EcoRI HF和Hind III分别酶切pCAMBIA1300和CH-target载体，酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶检测，分别切胶回收载体pCAMBIA1300和片段CH-target；利用T4Ligase获得p1300-CH-Target载体。

在步骤(5)中构建的水稻OsIPMS1和OsIPMS2 CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列如序列表SEQ ID NO.7所示；筛选纯合突变体所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。水稻种子粒型鉴定包括粒长、粒宽和千粒重。

6.根据权利要求3所述的一种检测种子发育期OsIPMS1和OsIPMS2基因表达水平的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)取不同发育期水稻种子；

(3)用

7.根据权利要求6所述的检测种子发育期OsIPMS1和OsIPMS2基因表达水平的方法，其特征在于：在步骤(1)中水稻种子分别在开花后0、7、14、21、28、35、42d后取样；种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃，每个时间点取样三份。

在步骤(4)中，采用水稻内参基因18sRNA引物，所述上游引物的序列如序列表SEQ IDNO.16所示，所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.17所示。