CN110540976A

CN110540976A - 一种异丙基苹果酸合成酶及其应用

Info

Publication number: CN110540976A
Application number: CN201910820591.XA
Authority: CN
Inventors: 张成林; 徐庆阳; 李燕军; 张宇; 李英滋; 朱福周; 卢楠; 韩世宝; 董解荣; 王子申; 徐昊; 李子翼
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2039-08-29
Also published as: CN110540976B

Abstract

本发明涉及一个解除L‑亮氨酸反馈抑制的2‑异丙基苹果酸合成酶及其应用，属于代谢工程领域。本发明所述leuA^M基因编码的2‑异丙基苹果酸合成酶具有如下特点：该酶解除了L‑亮氨酸对其的反馈抑制作用，在L‑亮氨酸浓度为0‑15mmol/L条件下，LEUA^M酶活性无显著变化，且其活性较野生型leuA^M编码的2‑异丙基苹果酸合成酶未见明显降低，可应用于L‑亮氨酸中的生产。

Description

一种异丙基苹果酸合成酶及其应用

技术领域：

本发明涉及一个解除L-亮氨酸反馈抑制异丙基苹果酸合成酶及其应用，属于代谢工程领域。

背景技术：

L-亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体和脊椎动物必需的八种氨基酸之一。在生物体内，L-亮氨酸用于蛋白酶、激素等。此外，L-亮氨酸还具有促进肌肉合成等功能。因此，L-亮氨酸被广泛应用于医药、食品、畜牧等领域，具有广阔的市场和应用前景。

现有L-亮氨酸的合成方法包括毛发水解提取法和发酵法，其中发酵法为主要合成方法。然而，L-亮氨酸合成途径中的关键酶异丙基苹果酸合成酶受L-亮氨酸的反馈抑制，从而使得L-亮氨酸难以过量积累。此外，现有L-亮氨酸的工业生产菌种主要由诱变获得，具有营养缺陷、生长慢、遗传性状不稳定等不足，从而引起发酵周期长、发酵性能不稳定、产量和转化率低等问题。

发明内容：

为了克服目前野生型2-异丙基苹果酸合成酶受L-亮氨酸反馈抑制的不足，本发明提供一种解除L-亮氨酸反馈抑制的2-异丙基苹果酸合成酶突变体及其编码基因和应用。

本发明解决述问题的技术方案之一是：提供一个解除L-亮氨酸反馈抑制的2-异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述2-异丙基苹果酸合成酶突变体的编码基因为leuA^M，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

所述2-异丙基苹果酸合成酶突变体来自一株谷氨酸棒杆菌突变株，所述突变株筛选过程如下：以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/L亮氨酸氧肟酸盐的基本培养基上筛选出菌株LEU262；以LEU262为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/Lβ-羟基亮氨酸的基本培养基上筛选出菌株LEU741。

提取LEU741基因组，通过设计引物进行PCR扩增2-异丙基苹果酸合成酶编码基因，将PCR产物回收后进行测序，发现该基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶相对于来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的野生型2-异丙基苹果酸合成酶发生如下氨基酸突变：F7L，I14F，I51S，G127D，I197V，F370L，K380M，R529H，G561D，V596A。

在本发明中采用如下定义：

1、2-异丙基苹果酸合成酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示2-异丙基苹果酸合成酶突变体中突变的氨基酸。如F7L，表示位置7的氨基酸由野生型2-异丙基苹果酸合成酶的Phe替换成Leu，F7表示第7位的氨基酸为Phe，位置的编号对应于SEQ ID NO.3中野生型2-异丙基苹果酸合成酶的氨基酸序列编号。

本发明中，leuA代表野生型2-异丙基苹果酸合成酶编码基因(SEQ ID NO.4所示)，LEUA代表野生型2-异丙基苹果酸合成酶(SEQ ID NO.3所示)；leuA^M为2-异丙基苹果酸合成酶突变体基因(SEQ ID NO.2所示)；LEUA^M为2-异丙基苹果酸合成酶突变体(SEQ ID NO.1所示)。突变前后的氨基酸对照如下表：

所述2-异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M，具有如下酶学特性：在L-亮氨酸浓度为0-15mmol/L条件下，LEUA^M酶活性无明显变化，即该突变体解除了L-亮氨酸对其反馈抑制作用；且在L-亮氨酸浓度为0-15mmol/L条件下的LEUA^M酶活性与野生型2-异丙基苹果酸合成酶LEUA在L-亮氨酸浓度为0mmol/L条件下相比无明显降低。

本发明还提供2-异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M在生产L-亮氨酸中的应用。

有益效果：

本发明所述leuA^M基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶具有如下特点：该酶解除了L-亮氨酸对其的反馈抑制作用(图1)，在L-亮氨酸浓度为0-15mmol/L条件下，LEUA^M酶活性无明显变化，且其活性较野生型leuA编码的2-异丙基苹果酸合成酶未见明显降低(图2)。

附图说明：

图1 L-亮氨酸对leuA和leuA^M基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶活性的影响；

图2 leuA^M与leuA编码的2-异丙基苹果酸合成酶活性对比。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1：解除L-亮氨酸反馈抑制的2-异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M的获得

(1)抗L-亮氨酸结构类似物突变株的筛选

①谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032菌悬液的制备

将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032接种至LB液体培养基，于32℃，200rpm，培养12h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤3次后重悬，使得OD₆₀₀＝0.6-0.8，取10μL菌悬液涂在载片上。

②常压室温等离子诱变

诱变参数为：载片置于气流端口2mm处，功率120W，气流量10SLM，作用时间20s。

③抗L-亮氨酸结构类似物亮氨酸氧肟酸盐突变株的筛选

将步骤②诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L亮氨酸氧肟酸盐的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。

④菌株产L-亮氨酸能力测定

将步骤③筛选的菌株利用种子培养基进行96孔板培养，然后以5％的接种量接种至含发酵培养基的96孔板进行发酵实验，菌株LEU262的L-亮氨酸产量最高。

⑤抗L-亮氨酸结构类似物β-羟基亮氨酸突变株的筛选及产L-亮氨酸能力测定

以LEU262为诱变对象，重复步骤①和②，将诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L β-羟基亮氨酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。重复步骤④，LEU741的L-亮氨酸产量最高。

⑥培养基

种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄4g/L，KH₂PO₄2.5g/L，MnSO₄0.5g/L，玉米浆30mL/L，pH 6.5-7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄ 4g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O0.6g/L，MnSO₄0.02g/L，V_B1 0.002g/L，玉米浆30mL/L。pH 6.5-7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min。

⑦检测方法

将发酵液于8000g离心5min后取上清液，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对其进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(15mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm，根据高效液相法的测定结果，根据与标准品出峰时间及峰面积对比，确定L-亮氨酸产量。

(2)解除L-亮氨酸反馈抑制2-异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M突变体的获得

提取LEU741基因组，利用引物leuA-1：ATGTCTCCTAACGATGCATT(SEQ ID NO.5)和leuA-2：TTAAACGCCGCCAGC(SEQ ID NO.6)进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、50℃30s、72℃2min 30个循环，72℃10min 1个循环，反应体系为100μL。取10μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增的目的片段回收后连接至pMDTM18-T Vector并转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，然后涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养上，于37℃倒置培养24h。挑取3个单克隆，提取重组质粒并测定其序列。

测序结果表明，与野生型leuA相比，突变后基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶发生了F7L，I14F，I51S，G127D，I197V，F370L，K380M，R529H，G561D，V596A突变，将该突变体命名为LEUA^M，编码基因命名为leuA^M。

(3)2-异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M与野生型2-异丙基苹果酸合成酶LEUA的酶学性质比较

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和LEU741基因组为模板，利用引物LA-1：ATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCATGTCTCCTAACGATGCATT:(SEQ ID NO.7)和LA-2：TGATGATGTTAGCTAGCGCTGAATTCTGCTTAAACGCCGCCAGC(SEQ ID NO.8)进行PCR扩增，产物回收后连接至经BamH I酶切的pET-His质粒，然后转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得菌株E.coli-leuA和E.coli-leuA^M。利用IPTG对E.coli-leuA和E.coli-leuA^M诱导表达重组蛋白LEUA和LEUA^M，收集菌体，用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重悬后进行超声破碎并离心后取上清液。

LEUA^M和LEUA的酶活性测定方法如下：

取10μL上述上清液至990μL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 7.5含400mmol/L谷氨酸钾、20μL 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、3mmol/L乙酰辅酶A、4mmol/L酮异戊酸)。于30℃反应1h后，加入100μL硫酸(3mol/L)，并于65℃处理15min以终止反应。在反应过程中，2-异丙基苹果酸合成酶可催化乙酰辅酶A生成辅酶A，后者在OD₄₁₂处有最大吸光度。根据该原理利用分光光度测定每分钟OD₄₁₂的变化值并计算生成的辅酶A，从而计算酶活性。结果如图2所示，LEUA^M和LEUA的活性分别为12.1和13.5nmol/(min·mg总蛋白)，二者无明显差异。

L-亮氨酸对LEUA^M和LEUA的酶活性影响测定方法如下：向上述反应液中分别加入0、2、4、6、8、10、12、15mmol/L L-亮氨酸，然后测定辅酶A生成量，以考察LEUA^M解除L-亮氨酸的反馈抑制作用。

将L-亮氨酸添加浓度为0时的酶活性定义为100％，其余L-亮氨酸浓度条件下的LEUA^M和LEUA的酶活性与之相比即为相对酶活性。

结果如图1所示，LEUA的相对酶活性随L-亮氨酸浓度增加迅速降低，L-亮氨酸浓度高于6mmol/L时，几乎无活性，表明该酶受L-亮氨酸反馈抑制作用；而突变体LEUA^M的相对活性随L-亮氨酸浓度的增加无明显变化，表明其解除了L-亮氨酸的反馈抑制作用。

综合以上结果，2-异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M解除了L-亮氨酸的反馈抑制作用，同时其活性较野生型LEUA相比未见明显降低。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种异丙基苹果酸合成酶及其应用

<130> 1

<141> 2019-08-29

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Ser Pro Asn Asp Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Lys Phe Glu Thr

1 5 10 15

Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg

20 25 30

Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val

35 40 45

Glu Asp Ser Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr

50 55 60

Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala

65 70 75 80

Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu

85 90 95

Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala

100 105 110

Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Asp Met

115 120 125

Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His

130 135 140

Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile

145 150 155 160

Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe

165 170 175

Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu

180 185 190

Leu Ile Lys Thr Val Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp

195 200 205

Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys

210 215 220

Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn

225 230 235 240

Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn

245 250 255

Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg

260 265 270

Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly

275 280 285

Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu

290 295 300

Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val

305 310 315 320

Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp

325 330 335

Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln

340 345 350

Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr

355 360 365

Ala Leu Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Met Gly Leu Asp Ala

370 375 380

Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp

385 390 395 400

Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp

405 410 415

Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser

420 425 430

Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly

435 440 445

Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln

450 455 460

Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp

465 470 475 480

Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln

485 490 495

Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser

500 505 510

Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly

515 520 525

His Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu

530 535 540

Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala Arg Thr Ser

545 550 555 560

Asp Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly

565 570 575

Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser

580 585 590

Leu Lys Ala Ala Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His

595 600 605

Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val

610 615

<210> 2

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

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cgcaacgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120

tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat agttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180

aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240

ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300

ggcttcaaag aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360

cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420

gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480

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gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactaa tcaagaccgt cgctcaggat 600

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tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840

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accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020

cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080

tacggcggtg acctggtctt caccgctctc tccggttccc accaggacgc tgtgaacatg 1140

ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200

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ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320

tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380

accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440

gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500

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<211> 616

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)

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Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val

35 40 45

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65 70 75 80

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Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly

275 280 285

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485 490 495

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610 615

<210> 4

<211> 1851

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<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)

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tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660

gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720

ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780

tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840

ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900

gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960

accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020

cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080

tacggcggtg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140

ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200

gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260

ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320

tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380

accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440

gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500

gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560

ggcaaggacg tcaccgtcga tggccgcggc aacggcccac tggccgctta cgccaacgcg 1620

ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccgcacctcg 1680

ggcgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740

ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800

aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgtctccta acgatgcatt 20

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ttaaacgccg ccagc 15

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgca tgtctcctaa cgatgcatt 49

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tgatgatgtt agctagcgct gaattctgct taaacgccgc cagc 44

Claims

1.一种2-异丙基苹果酸合成酶，其特征在于，所述2-异丙基苹果酸合成酶具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述2-异丙基苹果酸合成酶的编码基因。

3.权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1所述2-异丙基苹果酸合成酶在生产L-亮氨酸中的应用。