CN110862940B - 一种谷氨酸棒杆菌工程菌及其在制备l-色氨酸中的应用 - Google Patents

一种谷氨酸棒杆菌工程菌及其在制备l-色氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌工程菌及其在制备L‑色氨酸中的应用。本发明提供了谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FJR‑025，保藏编号为CCTCC NO：M 2019868。本发明还保护谷氨酸棒杆菌FJR‑025在制备L‑色氨酸中的应用。本发明还保护谷氨酸棒杆菌FJR‑025在制备饲料添加剂中的应用。本发明提供的菌株可直接发酵得到L‑色氨酸，发酵48后，发酵液中的L‑色氨酸含量高达52.5g/L，而且也可不进行L‑色氨酸纯化，直接喷雾干燥得到L‑色氨酸含量30％以上的饲料添加剂，极具应用价值。

Description

一种谷氨酸棒杆菌工程菌及其在制备L-色氨酸中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌工程菌及其在制备L-色氨酸中的应用。
背景技术
L-色氨酸(L-Ile)是人体八种必需氨基酸之一，广泛应用于医药、食品、饲料和化工领域，而且近年来随着世界各国对肉类和禽肉类产品需求量的不断增加也进一步促进了氨基酸在饲料中的用量，特别是L-色氨酸及其衍生物在肠道微生物中功能的不断开发，其商业应用价值正逐渐被扩大。
L-色氨酸已由传统水解法转变为微生物法生产，其中最为主流的生产方法是微生物直接发酵法。氨基酸发酵工业中最重要的两类菌株分别为大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。目前，大多数发酵法生产的L-色氨酸是通过大肠杆菌工程菌株实现的，但鉴于大肠杆菌的内毒素属性，其安全性也也更多被人关注，不仅如此，其生产菌株本身也不能作为菌体蛋白获得更多的应用。谷氨酸棒杆菌作为食品安全级菌株，不产生内毒素，从而使其具备更广阔的应用。采用非定向诱变与代谢工程手段相结合进行高产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌的选育，构建新型L-色氨酸代谢工程菌株，提高发酵法生产L-色氨酸的水平，对我国氨基酸发酵工业的发展以及满足我国高品质L-色氨酸的市场需求，特别是饲料L-色氨酸的需要具有极其重要的经济和现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种谷氨酸棒杆菌工程菌及其在制备L-色氨酸中的应用。
本发明提供了谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FJR-025。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FJR-025已于2019年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M2019868。
本发明还保护敲除谷氨酸棒杆菌的AlaT基因和LtbR基因得到的重组菌。
本发明还保护将谷氨酸棒杆菌FNT112进行如下(c1)和(c2)的改造得到的重组菌：
(c1)用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换谷氨酸棒杆菌FNT112的AlaT基因中的特异DNA片段甲；特异DNA片段甲如序列表的序列2中第450-861位核苷酸所示；
(c2)用“AACTACAGACCTAGAACCTA”替换谷氨酸棒杆菌FNT112的LtbR基因中的特异DNA片段丙；特异DNA片段丙如序列表的序列6中第390-558位核苷酸所示。
本发明还保护谷氨酸棒杆菌FJR-025或以上任一所述重组菌在制备L-色氨酸中的应用。
本发明还保护谷氨酸棒杆菌FJR-025或以上任一所述重组菌在制备饲料添加剂中的应用。
本发明还保护一种制备L-色氨酸的方法，包括如下步骤：发酵谷氨酸棒杆菌FJR-025或以上任一所述重组菌，得到L-色氨酸。
本发明还保护一种制备饲料添加剂的方法，包括如下步骤：发酵谷氨酸棒杆菌FJR-025或以上任一所述重组菌，然后将发酵产物直接进行喷雾干燥，得到饲料添加剂。
本发明还保护一种制备L-色氨酸的方法，包括如下步骤：
以谷氨酸棒杆菌为出发菌，制备以上任一所述重组菌；
发酵所述重组菌，得到L-色氨酸。
本发明还保护一种制备饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
以谷氨酸棒杆菌为出发菌，制备以上任一所述重组菌；
发酵所述重组菌，然后将发酵产物直接进行喷雾干燥，得到饲料添加剂。
本发明还保护所述方法制备得到的饲料添加剂。
以上任一所述的谷氨酸棒杆菌具体可为谷氨酸棒杆菌FNT112。
AlaT基因为编码AlaT蛋白的基因。
LtbR基因为编码LtbR蛋白的基因。
AlaT蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与(a1)具有相同功能的蛋白质；
(a3)来源于谷氨酸棒杆菌且与(a1)具有相同功能的蛋白质。
LtbR蛋白为如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)序列表中序列5所示的蛋白质；
(b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与(b1)具有相同功能的蛋白质；
(b3)来源于谷氨酸棒杆菌且与(b1)具有相同功能的蛋白质。
AlaT基因为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)序列表中序列2所示的DNA分子；
(d2)来源于谷氨酸棒杆菌且与(d1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(d3)在严格条件下与(d1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
LtbR基因为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表中序列6第138-845位核苷酸所示的DNA分子。
(e2)序列表中序列6所示的DNA分子；
(e3)来源于谷氨酸棒杆菌且与(e1)或(e2)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(e4)在严格条件下与(e1)或(e2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述发酵采用发酵培养基。
发酵培养基含有碳源、氮源以及无机盐和微量营养元素(如维生素和生物素)。
每升发酵培养基含有：125g葡萄糖、70g豆饼水解液、25g(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4·3H2O、0.5g MgSO4·7H2O、1.1g L-酪氨酸、0.7g L-苯丙氨酸、200μg维生素B1、100μg维生素H和35g CaCO3，余量为去离子水。125℃高压灭菌30min，其中葡萄糖为115℃分消后加入。
发酵培养基pH为7.0-7.2。
所述发酵的条件可为33℃、溶氧30-50％、48小时。
所述发酵过程中可通过补加葡萄糖控制发酵体系的葡萄糖含量为0.5-1.0g/100mL。
所述发酵的条件可为：采用30吨发酵罐，发酵培养基的装液量为18吨，接种3800L种子液(二级种子液)，培养48小时；培养过程中，通过流加70g/100ml葡萄糖水溶液，维持发酵体系的葡萄糖含量为0.5-1.0g/100mL；初始搅拌速度为300rpm，通过调整搅拌速度使溶氧(DO)控制在30-50％；温度为33℃；初始pH为7.0，通过流加20％氨水控制pH为7.0。
所述种子液(二级种子液)的制备方法具体如下：
谷氨酸棒杆菌FJR-025接种至种子培养基的250mL，33℃、220rpm振荡培养至OD562nm＝40，即为基础种子液；
采用500L发酵罐，种子培养基的装液量为350L，接种3.5L基础种子液，培养16小时，得到一级种子液(一级种子液的OD562nm≥60)。初始搅拌速度为300rpm，通过调整搅拌速度使溶氧(DO)控制在30-50％。温度为33℃。
采用5000L发酵罐，种子培养基的装液量为3500L，接种350L一级种子液，培养8小时，得到二级种子液(二级种子液的OD562nm≥120)。初始搅拌速度为250rpm，通过调整搅拌速度使溶氧(DO)控制在30-50％。温度为33℃。
种子培养基：取25g葡萄糖、5g玉米浆、100g豆饼水解液、3g酵母膏、5g(NH4)2SO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.4g KH2PO4·3H2O、1.1g L-酪氨酸、0.7g L-苯丙氨酸和10g碳酸钙，用去离子水溶解并定容至1L。125℃高压灭菌25min。
种子培养基pH为7.0-7.2。
豆饼水解液：用中性蛋白酶酶切豆粕粉得到。
豆饼水解液还可以通过商购途径得到。
豆饼水解液：取100g黄豆磨粉，加400mL去离子水拌匀，调pH值为7.0，55℃预热1个小时，然后加入5000U中性蛋白酶，然后55℃孵育3h，得到豆饼水解液。
本发明提供的菌株可直接发酵得到L-色氨酸，发酵48后，发酵液中的L-色氨酸含量高达52.5g/L，而且也可不进行L-色氨酸纯化，直接喷雾干燥得到L-色氨酸含量30％以上的饲料添加剂，极具应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。中性蛋白酶：宁夏夏盛实业集团有限公司，货号FDG-3806；产品规格10万U/g。发酵液中L-色氨酸含量的检测方法：GB/T 15400-2018，饲料中色氨酸的测定(高效液相色谱法)。其它氨基酸含量的检测方法：GB 5009.124-2016，食品安全国家标准(食品中氨基酸的测定)。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FNT112，已于2016年07月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)保藏编号为CCTCC NO：M2016398。谷氨酸棒杆菌FNT112，已申请专利并已授权，授权公告号为CN106434478B，授权公告日为2019-09-24。
载体pK18mobSacB：湖南丰晖生物科技有限公司，货号QT071。
种子培养基(pH7.0-7.2)：取25g葡萄糖、5g玉米浆、100g豆饼水解液、3g酵母膏、5g(NH4)2SO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.4g KH2PO4·3H2O、1.1g L-酪氨酸、0.7g L-苯丙氨酸和10g碳酸钙，用去离子水溶解并定容至1L。125℃高压灭菌25min。种子培养基pH为7.0-7.2。
每升发酵培养基含有：125g葡萄糖、70g豆饼水解液、25g(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4·3H2O、0.5g MgSO4·7H2O、1.1g L-酪氨酸、0.7g L-苯丙氨酸、200μg维生素B1、100μg维生素H和35g CaCO3，余量为去离子水。125℃高压灭菌30min，其中葡萄糖为115℃分消后加入。发酵培养基pH为7.0-7.2。
豆饼水解液：取100g黄豆磨粉，加400mL去离子水拌匀，调pH值为7.0，55℃预热1个小时，然后加入5000U中性蛋白酶，然后55℃孵育3h，得到豆饼水解液。
实施例1、丙氨酸转氨酶系敲除组件的构建
一、丙氨酸转氨酶(AlaT)敲除组件的构建
谷氨酸棒杆菌FNT112中，AlaT基因如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的AlaT蛋白。
1、取谷氨酸棒杆菌FNT112，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用alaT-P1与alaT-P2组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
alaT-P1：5’-GAATTCGTGACTACAGACAAGCGCAAAACCTC-3’；
alaT-P2：5’-AACTACAGACCTAGAACCTATTGAGGAGTGCTTGGGTGGTCATG-3’。
3、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用alaT-P3与alaT-P4组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
alaT-P3：5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTACTGGACCAAAGCAATACGCACGTGG-3’；
alaT-P4：5’-GTCGACCTACTGCTTGTAAGTGGACAGGAAG-3’。
4、同时将步骤2得到的扩增产物和步骤3得到的扩增产物作为模板，采用alaT-P1与alaT-P4组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
5、取步骤4得到的扩增产物，用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收酶切产物。
6、取载体pk18mobsacB，用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收约5600bp的载体骨架。
7、将步骤5得到的酶切产物和步骤6得到的载体骨架连接，得到重组质粒pk18ΔAlaT。根据测序结果对重组质粒pk18ΔAlaT进行结构描述如下：在载体pk18mobsacB的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间插入了ΔAlaT基因。与AlaT基因相比，ΔAlaT基因的区别仅在于用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了特异DNA片段甲。特异DNA片段甲如序列表的序列2中第450-861位核苷酸所示。
二、丙氨酸转氨酶(AvtA)敲除组件的构建
谷氨酸棒杆菌FNT112中，AvtA基因如序列表的序列4所示，编码序列表的序列3所示的AvtA蛋白。
1、取谷氨酸棒杆菌FNT112，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用avtA-P1与avtA-P2组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
avtA-P1：5’-AAGCTTATGCAGATGTTGGACCGAGTCC-3’；
avtA-P2：5’-AACTACAGACCTAGAACCTATGCGATATGCCGGGTACC-3’。
3、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用avtA-P3与avtA-P4组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
avtA-P3：5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTGGCTGCGGGACGCGCAGC-3’；
avtA-P4：5’-GGATCCCTATTTTTTGATGAATTCTCCG-3’。
4、同时将步骤2得到的扩增产物和步骤3得到的扩增产物作为模板，采用avtA-P1与avtA-P4组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
5、取步骤4得到的扩增产物，用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切，回收酶切产物。
6、取载体pk18mobsacB，用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切，回收约5600bp的载体骨架。
7、将步骤5得到的酶切产物和步骤6得到的载体骨架连接，得到重组质粒pk18ΔAvtA。根据测序结果对重组质粒pk18ΔAvtA进行结构描述如下：在载体pk18mobsacB的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间插入了ΔAvtA基因。与AvtA基因相比，ΔAvtA基因的区别仅在于用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了特异DNA片段乙。特异DNA片段乙如序列表的序列4中第341-761位核苷酸所示。
实施例2、亮氨酸和色氨酸合成调节因子(LtbR)敲除组件的构建
谷氨酸棒杆菌FNT112中，LtbR基因如序列表中序列6第138-845位核苷酸所示，编码序列表的序列5所示的LtbR蛋白。
1、取谷氨酸棒杆菌FNT112，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用ltbR-P1与ltbR-P2组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
ltbR-P1：5’-GAATTCatgaccttgaaatacacggtgaag-3’；
ltbR-P2：5’-AACTACAGACCTAGAACCTAATGCAGGGTCAGCAGCGCGC-3’。
3、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用ltbR-P3与ltbR-P4组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
ltbR-P3：5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTagcgccgcgtgcacccaatg-3’；
ltbR-P4：5’-GTCGACATATCGTTTCATGGGACAGTATAGC-3’。
4、同时将步骤2得到的扩增产物和步骤3得到的扩增产物作为模板，采用ltbR-P1与ltbR-P4组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
5、取步骤4得到的扩增产物，用限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，回收酶切产物。
6、取载体pk18mobsacB，用限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，回收约5600bp的载体骨架。
7、将步骤5得到的酶切产物和步骤6得到的载体骨架连接，得到重组质粒pk18ΔLtbR。根据测序结果对重组质粒pk18ΔLtbR进行结构描述如下：在载体pk18mobsacB的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间插入了ΔLtbR基因。与LtbR基因相比，ΔLtbR基因的区别仅在于用“AACTACAGACCTAGAACCTA”替换了特异DNA片段丙。特异DNA片段丙如序列表的序列6中第390-558位核苷酸所示。
实施例3、谷氨酸棒杆菌工程菌株的构建
一、AlaT基因修饰菌株的构建
1、将重组质粒pk18ΔAlaT通过电击法对谷氨酸棒杆菌FNT112进行转化，电击结束后，马上加入45℃预热的SOC培养基中，先42℃、200rpm培养1h，然后37℃、120-150rpm培养3-5小时。采用艾本德(Eppendorf)电转仪。电击条件：1800V，电击时间4-5ms。
2、完成步骤1后，取菌液，涂布于含25μg/mL硫酸卡那霉素的LBG培养基平板，30℃倒置培养24-30小时。平板上生长的克隆即为成功进行第一次重组的克隆。第一次重组，即重组质粒pk18ΔAlaT通过单交换的方式整体插入染色体中。
3、完成步骤2后，挑取平板上生长的单克隆，接种至装有3mL液体LB培养基的18×180mm试管中，30℃、200-250rpm培养18小时；然后，取100μL菌液，涂布于含10g/100mL蔗糖的LB培养基平板，30℃倒置培养16-20小时；然后取平板上生长的单克隆，分别接种至平板甲(LBG培养基平板)和平板乙(含25μg/mL卡那霉素的LBG培养基平板)，30℃倒置培养24-30小时。在平板甲上可以生长且在平板乙上不能生长的克隆即为成功进行第二次重组的克隆。
4、取第二次重组的克隆，扩大培养，然后采用alaT-P1和alaT-P4组成的引物对进行PCR扩增，然后进行测序验证。通过测序验证，获得重组菌FNT112-ΔAlaT。与谷氨酸棒杆菌FNT112相比，重组菌FNT112-ΔAlaT的差异仅在于：用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的AlaT基因中的特异DNA片段甲。特异DNA片段甲如序列表的序列2中第450-861位核苷酸所示。
二、AvtA基因修饰菌株的构建
用重组质粒pk18ΔAvtA代替重组质粒pk18ΔAlaT，用avtA-P1代替alaT-P1，用avtA-P4代替alaT-P4，其他同步骤一。
通过测序验证，获得重组菌FNT112-ΔAvtA。与谷氨酸棒杆菌FNT112相比，重组菌FNT112-ΔAvtA的差异仅在于：用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的AvtA基因中的特异DNA片段乙。特异DNA片段乙如序列表的序列4中第341-761位核苷酸所示。
三、AlaT与AvtA双基因修饰菌株的修饰
用重组质粒pk18ΔAvtA代替重组质粒pk18ΔAlaT，用avtA-P1代替alaT-P1，用avtA-P4代替alaT-P4，用重组菌FNT112-ΔAlaT代替谷氨酸棒杆菌FNT112，其他同步骤一。
通过测序验证，获得重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔAvtA。与谷氨酸棒杆菌FNT112相比，重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔAvtA的差异仅在于：用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的AlaT基因中的特异DNA片段甲，用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的AvtA基因中的特异DNA片段乙。特异DNA片段甲如序列表的序列2中第450-861位核苷酸所示。特异DNA片段乙如序列表的序列4中第341-761位核苷酸所示。
四、LtbR基因修饰菌株的构建
用重组质粒pk18ΔLtbR代替重组质粒pk18ΔAlaT，用ltbR-P1代替alaT-P1，用ltbR-P4代替alaT-P4，其他同步骤一。
通过测序验证，获得重组菌FNT112-ΔLtbR。与谷氨酸棒杆菌FNT112相比，重组菌FNT112-ΔLtbR的差异仅在于：用“AACTACAGACCTAGAACCTA”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的LtbR基因中的特异DNA片段丙。特异DNA片段丙如序列表的序列6中第390-558位核苷酸所示。
五、AlaT与LtbR双基因修饰菌株的修饰
用重组质粒pk18ΔLtbR代替重组质粒pk18ΔAlaT，用ltbR-P1代替alaT-P1，用ltbR-P4代替alaT-P4，用谷氨酸棒杆菌FNT112-ΔAlaT代替谷氨酸棒杆菌FNT112，其他同步骤一。
通过测序验证，获得重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔLtbR。与谷氨酸棒杆菌FNT112相比，重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔLtbR的差异仅在于：用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的AlaT基因中的特异DNA片段甲，用“AACTACAGACCTAGAACCTA”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的LtbR基因中的特异DNA片段丙。特异DNA片段甲如序列表的序列2中第450-861位核苷酸所示。特异DNA片段丙如序列表的序列6中第390-558位核苷酸所示。
一株重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔLtbR又命名为谷氨酸棒杆菌FJR-025。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FJR-025已于2019年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M2019868。
六、AvtA与LtbR双基因修饰菌株的修饰
用重组质粒pk18ΔLtbR代替重组质粒pk18ΔAlaT，用ltbR-P1代替alaT-P1，用ltbR-P4代替alaT-P4，用谷氨酸棒杆菌FNT112-ΔAvtA代替谷氨酸棒杆菌FNT112，其他同步骤一。
通过测序验证，获得重组菌FNT112-ΔAvtA/ΔLtbR。与谷氨酸棒杆菌FNT112相比，重组菌FNT112-ΔAvtA/ΔLtbR的差异仅在于：用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的AvtA基因中的特异DNA片段乙，用“AACTACAGACCTAGAACCTA”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的LtbR基因中的特异DNA片段丙。特异DNA片段乙如序列表的序列4中第341-761位核苷酸所示。特异DNA片段丙如序列表的序列6中第390-558位核苷酸所示。
七、AlaT、AvtA与LtbR三基因修饰菌株的修饰
用重组质粒pk18ΔAvtA代替重组质粒pk18ΔAlaT，用avtA-P1代替alaT-P1，用avtA-P4代替alaT-P4，用谷氨酸棒杆菌FJR-025代替谷氨酸棒杆菌FNT112，其他同步骤一。
通过测序验证，获得重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔLtbR/ΔAvtA。与谷氨酸棒杆菌FNT112相比，重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔLtbR/ΔAvtA差异仅在于：用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的AlaT基因中的特异DNA片段甲，用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的AvtA基因中的特异DNA片段乙，用“AACTACAGACCTAGAACCTA”替换了谷氨酸棒杆菌FNT112的LtbR基因中的特异DNA片段丙。特异DNA片段甲如序列表的序列2中第450-861位核苷酸所示。特异DNA片段乙如序列表的序列4中第341-761位核苷酸所示。特异DNA片段丙如序列表的序列6中第390-558位核苷酸所示。
八、检测菌株性能
供试菌为：谷氨酸棒杆菌FNT112、谷氨酸棒杆菌FJR-025、重组菌FNT112-ΔAvtA、重组菌FNT112-ΔAlaT、重组菌FNT112-ΔLtbR、重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔAvtA、重组菌FNT112-ΔAvtA/ΔLtbR、重组菌FNT112-ΔAlaT/ΔLtbR/ΔAvtA。
1、将供试菌接种至装有30mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，33℃、220rpm培养至对数生长中后期，得到种子液(种子液的OD562nm＝40)。
2、取3mL种子液，接种至装有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，33℃、220rpm培养48h。然后检测培养体系的OD562nm值(用于表征菌株的生长效率)、检测发酵上清中的L-丙氨酸含量、L-色氨酸含量以及杂氨基酸含量，计算杂氨基酸占总氨基酸的质量百分含量。杂氨基酸指的是天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸，共15种氨基酸。总氨基酸指的是L-丙氨酸、L-色氨酸含量和杂氨基酸。
结果见表1。
表1
Figure BDA0002280155880000101
较谷氨酸棒杆菌FNT112来说，谷氨酸棒杆菌FJR-025的L-丙氨酸的含量减少了80.0％，杂氨基酸占总氨基酸的质量百分含量减少了64.7％，L-色氨酸产量提高了31.6％，同时菌浓度(OD562nm值)基本一致，不需要额外添加L-丙氨酸来满足细胞的生长。所以，对于谷氨酸棒杆菌来说，敲除AlaT基因与LtbR基因不仅可以很好的维持细胞生长与产物合成之间的L-丙氨酸的供需平衡，大幅度减少杂酸积累，还能够解除LtbR基因对L-色氨酸生物合成相关酶活性的抑制，提高L-色氨酸合成相关酶转录，有力的促进L-色氨酸合成的碳流量，从而提高色氨酸产量。
实施例4、应用谷氨酸棒杆菌FJR-025发酵生产L-色氨酸
一、摇瓶发酵生产L-色氨酸
1、应用谷氨酸棒杆菌FJR-025生产L-色氨酸
(1)种子培养
将一环谷氨酸棒杆菌FJR-025斜面菌种接种至装有30mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，33℃、220rpm振荡培养，得到种子液(种子液的OD562nm＝40)。
(2)发酵培养
将3mL种子液接种至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，8层纱布封口，33℃、220rpm振荡培养48小时。
(3)取步骤(2)的发酵体系，室温、6000rpm离心15min，收集上清液(发酵液)。
2、对照液的制备
将谷氨酸棒杆菌FNT112代替谷氨酸棒杆菌FJR-025进行步骤1，收集上清液(发酵液)。
3、检测L-色氨酸含量
谷氨酸棒杆菌FJR-025发酵液中的L-色氨酸浓度为12.5g/L，谷氨酸棒杆菌FNT112发酵液中的L-色氨酸浓度为9.5g/L。
二、工业发酵生产L-色氨酸
将谷氨酸棒杆菌FJR-025(或谷氨酸棒杆菌FNT112)采用30吨发酵罐进行补料分批发酵，具体步骤如下：
1、第一阶段培养
谷氨酸棒杆菌FJR-025接种至种子培养基的250mL，33℃、220rpm振荡培养至OD562nm＝40，即为基础种子液。
采用500L发酵罐，种子培养基的装液量为350L，接种3.5L基础种子液，培养16小时，得到一级种子液(一级种子液的OD562nm≥60)。初始搅拌速度为300rpm，通过调整搅拌速度使溶氧(DO)控制在30-50％。温度为33℃。
2、第二阶段培养
采用5000L发酵罐，种子培养基的装液量为3500L，接种350L一级种子液，培养8小时，得到二级种子液(二级种子液的OD562nm≥120)。初始搅拌速度为250rpm，通过调整搅拌速度使溶氧(DO)控制在30-50％。温度为33℃。
3、第三阶段培养
采用30吨发酵罐，发酵培养基的装液量为18吨，接种3800L二级种子液，培养48小时。培养过程中，通过流加70g/100ml葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.5-1.0g/100mL。初始搅拌速度为300rpm，通过调整搅拌速度使溶氧(DO)控制在30-50％。温度为33℃。初始pH为7.0，通过流加20％氨水控制pH为7.0。
4、完成步骤3后，取发酵体系，4℃、6000rpm离心15min，收集上清液(发酵液)，检测发酵液中的L-色氨酸含量。
谷氨酸棒杆菌FJR-025发酵液中的L-色氨酸浓度为51.5g/L,谷氨酸棒杆菌FNT112发酵液中的L-色氨酸浓度为40.5g/L,谷氨酸棒杆菌FJR-025的L-色氨酸产量较谷氨酸棒杆菌FNT112提高了27.2％。
5、完成步骤3后，取发酵体系，直接进行喷雾干燥，得到干粉，可作为含有L-色氨酸及菌体蛋白的饲料添加剂。
谷氨酸棒杆菌FJR-025发酵液直接喷干粉中，L-色氨酸浓度为35.0％(质量百分含量)，谷氨酸棒杆菌FNT112发酵液直接喷干粉中的L-色氨酸浓度为25.0％(质量百分含量)。谷氨酸棒杆菌FJR-025较谷氨酸棒杆菌FNT112的L-色氨酸含量高40％，有利于促进产品在饲料产品中的竞争力。
SEQUENCE LISTING
<110> 金河生物科技股份有限公司
<120> 一种谷氨酸棒杆菌工程菌及其在制备L-色氨酸中的应用
<130> GNCYX192460
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 437
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
Val Thr Thr Asp Lys Arg Lys Thr Ser Lys Thr Thr Asp Thr Ala Asn
1 5 10 15
Lys Ala Val Gly Ala Asp Gln Ala Ala Arg Pro Thr Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Arg Arg Ile Phe Asp Gln Ser Glu Lys Met Lys Asp Val Leu Tyr Glu
35 40 45
Ile Arg Gly Pro Val Ala Ala Glu Ala Glu Arg Met Glu Leu Asp Gly
50 55 60
His Asn Ile Leu Lys Leu Asn Thr Gly Asn Pro Ala Val Phe Gly Phe
65 70 75 80
Asp Ala Pro Asp Val Ile Met Arg Asp Met Ile Ala Asn Leu Pro Thr
85 90 95
Ser Gln Gly Tyr Ser Thr Ser Lys Gly Ile Ile Pro Ala Arg Arg Ala
100 105 110
Val Val Thr Arg Tyr Glu Val Val Pro Gly Phe Pro His Phe Asp Val
115 120 125
Asp Asp Val Phe Leu Gly Asn Gly Val Ser Glu Leu Ile Thr Met Thr
130 135 140
Thr Gln Ala Leu Leu Asn Asp Gly Asp Glu Val Leu Ile Pro Ala Pro
145 150 155 160
Asp Tyr Ala Gln Trp Thr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Gly Gly Lys Pro
165 170 175
Val His Tyr Ile Ser Asp Val Glu Asp Asp Trp Asn Pro Ser Ile Glu
180 185 190
Asp Ile Lys Ser Lys Leu Ser Glu Lys Thr Lys Ala Ile Val Val Ile
195 200 205
Asn Pro Asn Asn Pro Thr Gly Ala Val Tyr Pro Arg Arg Val Leu Glu
210 215 220
Gln Ile Val Glu Ile Ala Arg Glu His Asp Leu Leu Ile Leu Ala Asp
225 230 235 240
Glu Ile Tyr Asp Arg Ile Leu Tyr Asp Asp Ala Glu His Ile Ser Leu
245 250 255
Ala Thr Leu Ala Pro Asp Leu Leu Cys Ile Thr Tyr Asn Gly Leu Ser
260 265 270
Lys Ala Tyr Arg Val Ala Gly Tyr Arg Ala Gly Trp Met Val Leu Thr
275 280 285
Gly Pro Lys Gln Tyr Ala Arg Gly Phe Ile Glu Gly Leu Glu Leu Leu
290 295 300
Ala Gly Thr Arg Leu Cys Pro Asn Val Pro Ala Gln His Ala Ile Gln
305 310 315 320
Val Ala Leu Gly Gly Arg Gln Ser Ile Tyr Asp Leu Thr Gly Glu His
325 330 335
Gly Arg Leu Leu Glu Gln Arg Asn Met Ala Trp Thr Lys Leu Asn Glu
340 345 350
Ile Pro Gly Val Ser Cys Val Lys Pro Met Gly Ala Leu Tyr Ala Phe
355 360 365
Pro Met Leu Asp Pro Asn Val Tyr Glu Ile His Asp Asp Thr Gln Leu
370 375 380
Met Leu Asp Leu Leu Arg Ala Glu Lys Ile Leu Met Val Gln Gly Thr
385 390 395 400
Gly Phe Asn Trp Pro His His Asp His Phe Arg Val Val Thr Leu Pro
405 410 415
Trp Ala Ser Gln Leu Glu Asn Ala Ile Asp Arg Leu Arg Asn Phe Leu
420 425 430
Ser Thr Tyr Lys Gln
435
<210> 2
<211> 1314
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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gtgactacag acaagcgcaa aacctctaag accaccgaca ccgccaacaa ggctgtgggc 60
gcggatcagg cagcgcgtcc cactcggcga acaactcgcc gcatcttcga tcagtcggag 120
aagatgaagg acgtgctgta cgagatccgt ggcccggtgg ccgcggaggc ggaacgcatg 180
gagcttgatg ggcataacat cttaaagctc aacacgggaa atccagccgt gttcggattc 240
gatgcccccg acgtgattat gcgtgacatg atcgccaacc ttccaacttc ccaagggtat 300
tccacctcca aaggcattat tccggcccgg cgagcagtgg tcacccgcta cgaagttgtg 360
cccggattcc cccacttcga tgttgatgat gtgttcttag gcaacggtgt ctcagaacta 420
atcaccatga ccacccaagc actcctcaac gacggcgatg aagttcttat ccccgcaccg 480
gactacgcac agtggactgc cgcaacctcc ctggctggtg gtaagcctgt gcactacatc 540
agtgatgtgg aagatgactg gaacccatcc atcgaagaca tcaagtccaa actctcagag 600
aaaaccaaag ctattgtggt gatcaacccc aacaacccca cgggagctgt ctacccgcgc 660
cgcgtgttgg aacaaatcgt cgagattgca cgcgagcatg acctgctgat tttggccgat 720
gaaatctacg accgcattct ctacgatgat gccgagcaca tcagcctggc aacgcttgca 780
ccagatctcc tttgcatcac atacaacggt ctatccaagg cataccgcgt cgcaggatac 840
cgagctggct ggatggtatt gactggacca aagcaatacg cacgtggatt tattgagggc 900
ctcgaactcc tcgcaggcac tcgactctgc ccaaatgtcc cagctcagca cgctattcag 960
gtagctctcg gtggacgcca gtccatctac gacctcactg gcgaacacgg ccgactcctg 1020
gaacagcgca acatggcatg gacgaaactc aacgaaatcc caggtgtcag ctgtgtgaaa 1080
ccaatgggag ctctatacgc gttccccatg ctcgacccca acgtgtacga aatccacgac 1140
gacacccaac tcatgctgga tcttctccgt gccgagaaaa tcctcatggt tcagggcact 1200
ggcttcaact ggccacatca cgatcacttc cgagtggtca ccctgccatg ggcatcccag 1260
ttggaaaacg caattgaccg cctgcgtaac ttcctgtcca cttacaagca gtag 1314
<210> 3
<211> 369
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
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Thr Ile Met Phe Cys Ala Gly Gln Pro Ser Thr Gly Ala Pro Glu Ala
20 25 30
Val Ile Glu Glu Ala Glu Ile Ala Leu Arg Ser Gly Pro Leu Gly Tyr
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50 55 60
His Ser Ala Thr Tyr His Val Glu Thr Lys Pro Asp Asn Val Ile Val
65 70 75 80
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Thr Ala Glu Thr Arg Phe Gln Pro Thr Ala Gln Met Leu Glu Glu Leu
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Gly Thr Ile Ile Asp Pro Glu Glu Leu Glu Arg Ile Ala Lys Trp Cys
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Asp Asp Asn Asp Ala Val Leu Ile Ser Asp Glu Asp Tyr His Gly Met
180 185 190
Ser Phe Gly Arg Pro Leu Ala Thr Ala His Gln Phe Ser Lys Asn Ala
195 200 205
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Val Gly Cys Ile Ile Val Pro Asp Glu Leu Val Thr Pro Ile Glu Asn
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gcactcgcat gcctttaaat gcagggtcag cagcgcgcgt ttttgccgcc tacctcccca 600
tcccctctgc cagcgtcttt tcccgcgagg agcttgacca ggtgcgcgcc agcggcttag 660
cggagtccgt gggcgagcgt gagctcggcc ttgctagcct ctcctcccct gtttttgatt 720
ccaacggatc catgatcgcg gcactgtcca tctccggcgt ggccgagcgc ctcaagcccc 780
accccgccgc catgtggggc accgagctta tcgacgccgc cgagcgccta ggcgctttgc 840
tttaagagct tttcgacgca caaccccagt tgtttattca actcattgaa ccctaagcgc 900
tggagagata tctgataaac ctcgctatac caccagattt gctgctcttt gccagcgtta 960
aagcgttgcc ataaatcttc accgtgtatt tcaaggtcat ccaagatgga catgagatta 1020

Claims (10)

1.谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FJR-025，其保藏编号为CCTCC NO：M2019868。
2.敲除谷氨酸棒杆菌FNT112的AlaT基因和LtbR基因得到的重组菌；AlaT基因为编码AlaT蛋白的基因；LtbR基因为编码LtbR蛋白的基因；
AlaT蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；
LtbR蛋白为序列表中序列5所示的蛋白质。
3.将谷氨酸棒杆菌FNT112进行如下(c1)和(c2)的改造得到的重组菌：
(c1)用“TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT”替换谷氨酸棒杆菌FNT112的AlaT基因中的特异DNA片段甲；特异DNA片段甲如序列表的序列2中第450-861位核苷酸所示；
(c2)用“AACTACAGACCTAGAACCTA”替换谷氨酸棒杆菌FNT112的LtbR基因中的特异DNA片段丙；特异DNA片段丙如序列表的序列6中第390-558位核苷酸所示；
AlaT基因为编码权利要求2中所述的AlaT蛋白的基因；LtbR基因为编码权利要求2中所述的LtbR蛋白的基因。
4.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌FJR-025或权利要求2所述重组菌或权利要求3所述重组菌在制备L-色氨酸中的应用。
5.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌FJR-025或权利要求2所述重组菌或权利要求3所述重组菌在制备饲料添加剂中的应用。
6.一种制备L-色氨酸的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述谷氨酸棒杆菌FJR-025或权利要求2所述重组菌或权利要求3所述重组菌，得到L-色氨酸。
7.一种制备饲料添加剂的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述谷氨酸棒杆菌FJR-025或权利要求2所述重组菌或权利要求3所述重组菌，然后将发酵产物直接进行喷雾干燥，得到饲料添加剂。
8.一种制备L-色氨酸的方法，包括如下步骤：
以谷氨酸棒杆菌为出发菌，制备权利要求2所述重组菌或权利要求3所述重组菌；
发酵所述重组菌，得到L-色氨酸。
9.一种制备饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
以谷氨酸棒杆菌为出发菌，制备权利要求2所述重组菌或权利要求3所述重组菌；
发酵所述重组菌，然后将发酵产物直接进行喷雾干燥，得到饲料添加剂。
10.权利要求9所述方法制备得到的饲料添加剂。
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