CN104004678A - 一株高产l-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建及其发酵产l-缬氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一株高产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建及其发酵产L-缬氨酸的方法，属于食品生物工程技术领域。本发明以谷氨酸棒状杆菌ATCC13869为出发菌株，进行基因aceE、alaT和ilvA的敲除组合，获得ATCC13869ΔaceEΔalaTΔilvA突变菌株，命名为WCC003；在WCC003上进行基因lrp1、brnFE和ilvBNC1的表达组合，获得表达组合工程菌WCC003/pJYW-4-ilvBNC1-lrp1-brnFE，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2014149；并用该表达组合工程菌发酵生产L-缬氨酸。本发明基于表达调控蛋白Lrp、转运蛋白BrnFE及L-缬氨酸合成途径关键基因ilvBNC1的高产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，在谷氨酸棒状杆菌中Lrp的有利突变Arg39Trp为本发明首次明确，Lrp和BrnFE用于发酵生产L-缬氨酸也是本发明首次报道。基因lrp1、brnFE和ilvBNC1的表达组合的研究也是本发明首次开创。
Description
技术领域
本发明一株高产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建及其发酵产L-缬氨酸的方法，涉及以谷氨酸棒状杆菌ATCC13869为出发菌株，进行基因aceE、alaT和ilvA的敲除组合，获得ATCC13869ΔaceEΔalaTΔilvA突变菌株，命名为WCC003；在WCC003上进行基因lrp 1 、brnFE和ilvBNC 1 的表达组合，获得表达组合工程菌WCC003/pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2014149；并用该表达组合工程菌发酵生产L-缬氨酸，属于食品生物工程技术领域。
背景技术
L-缬氨酸（L-valine）是一种支链氨基酸，广泛运用于食品、饲料、化妆品和医药领域。谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种常用的氨基酸工业生产菌株，优点是相对安全、易于培养和改造。L-缬氨酸在谷氨酸棒状杆菌中的生物合成途径已经明确（附图1）。丙酮酸（pyruvate）是L-缬氨酸合成的重要前体，通过4步反应合成L-缬氨酸，反应的关键酶分别为ilvBN基因编码的乙酰羟酸合成酶（acetohydroxyacid synthase ，AHAS），ilvC基因编码的乙酰羟酸还原异构酶（acetohydroxyacid isomeroreductase，AHAIR），ilvD基因编码的二羟酸脱水酶（dihydroxyacid dehydratase，DHAD）和ilvE基因编码的转氨酶B（transaminase B，TA）。以上4种酶也用于L-异亮氨酸（L-isoleucine）合成，具体是先由丙酮酸和苏氨酸（threonine）经ilvA基因编码的苏氨酸脱水酶（threomine dehydratase，TD）催化反应生成2-酮丁酸（2-ketobutyrate），再共用这4种酶催化4步反应生成L-异亮氨酸。丙酮酸同时还是多种反应的前体，如可以由丙酮酸脱氢酶复合体（其中关键酶Elp由aceE基因编码）催化反应生成乙酰辅酶A（acetyl-CoA）进入三羧酸循环；可以由alaT基因编码的氨基酸转氨酶（aminotransferase）催化反应生成L-丙氨酸（L-alanine）。
代谢工程技术近年来开始用于改造谷氨酸棒状杆菌以生产L-缬氨酸，一些高效的策略已被报道。其中通过基因aceE、alaT、ilvA的分别敲除可以增加L-缬氨酸合成前体丙酮酸的积累、减少副产物L-丙氨酸和L-异亮氨酸的合成，但尚无这三种基因组合敲除的报道。此外基因簇ilvBNC的过量表达可以促进碳通量更多流向L-缬氨酸合成途径，从而提高L-缬氨酸产量。
Lrp基因编码的亮氨酸反应调节蛋白（leucine-responsive regulatory protein，Lrp）是一种细胞全局调控蛋白。BrnFE基因编码的BrnFE蛋白是谷氨酸棒状杆菌支链氨基酸的转运蛋白，其表达水平受到Lrp的调控。已有在大肠杆菌中通过过量表达Lrp生产L-缬氨酸的报道。但在谷氨酸棒状杆菌中Lrp的调控机制尚未明确， Lrp和BrnFE的利用仅限于L-异亮氨酸，尚无用于发酵生产L-缬氨酸的报道。基因lrp、brnFE和ilvBNC的表达组合也尚未有研究。
发明内容
本发明旨在提供一株基于表达调控蛋白Lrp、转运蛋白BrnFE及L-缬氨酸合成途径关键基因ilvBNC 1 ，运用新的基因敲除和表达组合策略构建高产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，以及该工程菌发酵生产L-缬氨酸的方法。
所述出发菌株ATCC13869，来源于美国模式培养物集存库（ATCC），是一种革兰氏阴性、好氧型杆菌，主要用于微生物发酵工程生产谷氨酸。
所述菌株VWB-1，是一株由ATCC13869随机诱变得到的L-缬氨酸工业生产菌。
一株通过基因敲除提高L-缬氨酸产量并减少副产物L-丙氨酸和L-异亮氨酸合成的谷氨酸棒状杆菌工程菌，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13869为出发菌株，采用（1）基因aceE、alaT和ilvA的敲除组合；（2）基于cre/lox位点特异性重组的敲除方法；获得ATCC13869ΔaceEΔalaTΔilvA突变菌株，命名为WCC003。
一株在工程菌WCC003中过量表达调控蛋白Lrp、转运蛋白BrnFE及L-缬氨酸合成途径关键基因ilvBNC 1 的高产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌表达组合工程菌WCC003/pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2014149，通过（1）基因lrp 1 、brnFE和ilvBNC 1 的表达组合；（2）lrp 1 编码的Lrp1蛋白具备有利突变Arg39Trp；(3)表达载体为pJYW-4。
用所述的表达组合工程菌CCTCC NO：M2014149发酵生产L-缬氨酸的方法，将菌株WCC003/pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE活化后接种于200mL种子培养基，往复式摇瓶发酵18h后接入装有2L发酵培养基的5L发酵罐；氨水控制pH维持在7.2，温度30℃，溶氧通过转速和通气量偶联维持在30%，当残糖含量低于60g/L时流加葡萄糖，发酵时间96h；最终L-缬氨酸产量达到36.6g/L；
活化培养基配方为：91g/L山梨醇，18.5g/L脑心浸液，5g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，5g/L葡萄糖，2.5g/L酵母膏，0.4g/L异亮氨酸，30 mg/L卡那霉素，以去离子水配制；
种子培养基为发酵培养基适当降低葡萄糖和硫酸铵含量；
发酵培养基配方为：120g/L葡萄糖，40g/L硫酸铵，10g/L 大豆浸出汁，1g/L磷酸二氢钾，5g/L乙酸钾，0.04g/L硫酸亚铁，0.07g/L硫酸锰，0.1g/L硫酸镁，0.7g/L甲硫氨酸，0.4g/L异亮氨酸，0.3mg/L生物素，0.05mg/L VB1，30 mg/L卡那霉素，以去离子水配制，氢氧化钠调pH至7.2。
所述基因敲除组合，包括基因aceE、alaT和ilvA的共同敲除，相比于出发菌株显著提高了L-缬氨酸的产量，并极大减少了副产物L-丙氨酸和L-异亮氨酸。
所述基因敲除方法，是一种基于cre/lox位点特异性重组的、可在谷氨酸棒状杆菌进行多次的、几乎无痕的敲除方法(王小元，胡瑾瑜，李颜颜，谭延振，李烨. 一种棒状杆菌基因连续敲除系统及其构建方法和应用，中国专利，申请号201310215508.9)。
所述基因表达组合，是在出发表达载体pJYW-4上进行基因lrp 1 、brnFE和ilvBNC 1 的共同过量表达（附图3），L-缬氨酸的产量显著提高。
所述基因lrp 1 ，brnFE和ilvBNC 1 ，来源于L-缬氨酸工业生产菌VWB-1，其中lrp 1 编码的Lrp1氨基酸序列（SEQ ID NO: 1）相比于ATCC13869有一个有利的点突变Arg39Trp，比野生型Lrp生长抑制作用弱，L-缬氨酸产量更高；BrnFE氨基酸序列（SEQ ID NO: 2）一致；ilvBNC 1 氨基酸序列（SEQ ID NO: 3）有数个突变，效果不明。所述菌株VWB-1，是一株由ATCC13869随机诱变得到的L-缬氨酸工业生产菌。
所述载体pJYW-4，是一种用于谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌的穿梭表达载体（王小元，胡瑾瑜，李颜颜，胡晓清，谭延振. 一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统，中国专利，申请号201410057876.X）。
所述发酵方法，是采用特殊配方的发酵培养基，在发酵罐水平发酵96 h，发酵过程中控制pH和溶氧并且补加葡萄糖。最终L-缬氨酸产量达36.6g/L，且副产物含量极少。
本发明的有益效果：Lrp基因编码的亮氨酸反应调节蛋白（leucine-responsive regulatory protein，Lrp）是一种细胞全局调控蛋白。BrnFE基因编码的BrnFE蛋白是谷氨酸棒状杆菌支链氨基酸的转运蛋白，其表达水平受到Lrp的调控。虽已有在大肠杆菌中通过过量表达Lrp生产L-缬氨酸的报道，但在谷氨酸棒状杆菌中用于发酵生产L-缬氨酸是本发明首次报道，Lrp的有利突变Arg39Trp为本发明首次明确，基因lrp 1 、brnFE和ilvBNC 1 的表达组合的研究也是本发明首次开创。
生物材料样品保藏：谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）WCC004，（即 WCC003/pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE），已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址武汉 武汉大学，保藏号CCTCC NO：M2014149，保藏日期2014年4月24日。
附图说明
图1：谷氨酸棒状杆菌中的L-缬氨酸生物合成途径及本发明涉及的代谢改造示意图
图2：菌株WCC003构建示意图
图3：相关表达载体示意图。
具体实施方式
实施例1 敲除组合菌株WCC003的构建
出发菌株ATCC13869。对于aceE基因的敲除，先构建带有aceE基因上下游同源臂和含loxp重组酶识别位点的卡那霉素抗性基因筛选标记（loxp-kan-loxp）的敲除载体pDTW301。然后将敲除载体转入ATCC13869，利用抗性筛选标记（如有可同时利用营养缺陷型）筛选出loxp-kan-loxp与基因组上aceE基因上下游同源臂之间的部分进行同源重组的转化子。接着转入带有位点特异性cre重组酶的温敏质粒pDTW109，利用抗性筛选标记筛选出去除基因组上kan片段的转化子。最后改变培养温度去除pDTW109，通过基因型和表型验证得到ATCC13869ΔaceE突变菌株（Jinyu Hu, Yanzhen Tan, Yanyan Li, Xiaoqing Hu, Daqing Xu, Xiaoyuan Wang, 2013. Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum. Plasmid 3:303–313）。
基因alaT及ilvA的敲除方法和aceE的敲除方法类似，需要分别构建带各自基因上下游同源臂的敲除载体pWCC001及pDTW302（同上Hu et al.参考文献）。在ATCC13869ΔaceE中连续敲除alaT及ilvA得到ATCC13869ΔaceEΔalaTΔilvA突变菌株，命名为WCC003（附图2）。
实施例2 在WCC003中过量表达基因lrp 1 、brnFE和ilvBNC 1
首先构建各基因单独表达载体。将ATCC13869及VWB-1来源的基因lrp及lrp 1 连接到pJYW-4，构建表达载体pJYW-4-lrp及pJYW-4-lrp 1 ，发现表达效果后者生长抑制作用较弱而L-valine产量更高。将VWB-1来源的基因brnFE及ilvBNC 1 分别连接到pJYW-4，得到表达载体pJYW-4-brnFE及pJYW-4-ilvBNC 1 。
然后将pJYW-4-brnFE中带tac启动子的brnFE基因片段tac-brnFE连接到pJYW-4-lrp 1 ，得到表达载体pJYW-4-lrp 1 -brnFE；再将tac-lrp 1 -tac-brnFE片段连接到pJYW-4-ilvBNC 1 ，得到最终的表达载体pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE（附图3）。
最后将pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE转入实施例1中构建的WCC003，得到新的表达组合工程菌WCC003/pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE。250mL摇瓶发酵显示，相比于WCC003虽然其生长受到一定的限制，但L-缬氨酸的产量显著增加，达到23.9g/L，糖酸转化率和产率都有较高水平。
实施例3 工程菌WCC003/pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE罐上发酵
将菌株活化后接种于200mL种子培养基，往复式摇瓶发酵18h后接入装有2L发酵培养基的5L发酵罐。氨水控制pH维持在7.2，温度30℃，溶氧通过转速和通气量偶联维持在30%，当残糖含量低于60g/L时流加葡萄糖，发酵时间96h。最终L-缬氨酸产量达到36.6g/L。
活化培养基配方为：91g/L山梨醇，18.5g/L脑心浸液，5g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，5g/L葡萄糖，2.5g/L酵母膏，0.4g/L异亮氨酸，30 mg/L卡那霉素，以去离子水配制。
种子培养基为发酵培养基适当降低葡萄糖和硫酸铵含量。
发酵培养基配方为：120g/L葡萄糖，40g/L硫酸铵，10g/L 大豆浸出汁，1g/L磷酸二氢钾，5g/L乙酸钾，0.04g/L硫酸亚铁，0.07g/L硫酸锰，0.1g/L硫酸镁，0.7g/L甲硫氨酸，0.4g/L异亮氨酸，0.3mg/L生物素，0.05mg/L VB1，30 mg/L卡那霉素，，以去离子水配制，氢氧化钠调pH至7.2。
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 151
<212> PRT
<213> 调控蛋白Lrp1（lrp 1 编码）
<400> 1
Met Lys Leu Asp Ser Ile Asp Cys Ala Ile Ile Ala Glu Leu Ser
5 10 15
Ala Asn Ala Arg Ile Ser Asn Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val His
20 25 30
Leu Thr Pro Gly Pro Cys Leu Arg Trp Val Gln Arg Leu Glu Ala
35 40 45
Glu Gly Ile Ile Leu Gly Tyr Ser Ala Asp Ile His Pro Ala Val
50 55 60
Met Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val Asp Val Thr Leu Ser Asn
65 70 75
Phe Asp Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu Ser Ser Val Ala Gln
80 85 90
His Asp Glu Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe Gly Ser Pro Asp
95 100 105
Tyr Phe Val Arg Ile Gly Val Ala Asp Leu Glu Ala Tyr Glu Gln
110 115 120
Phe Leu Ser Ser His Ile Gln Thr Val Pro Gly Ile Ala Lys Ile
125 130 135
Ser Ser Arg Phe Ala Met Lys Val Val Lys Pro Ala Arg Pro Gln
140 145 150
Val
151
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 351
<212> PRT
<213> 转运蛋白BrnFE（brnFE编码）
<400> 2
Val Gln Lys Thr Gln Glu Ile His Ser Ser Leu Glu Val Ser Pro
5 10 15
Ser Lys Ala Ala Leu Glu Pro Gly Asp Lys Gly Tyr Arg Arg Tyr
20 25 30
Glu Ile Ala Gln Gly Leu Lys Thr Ser Leu Ala Ala Gly Leu Gly
35 40 45
Met Tyr Pro Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Leu Val Ile Gln Tyr
50 55 60
Gly Tyr Glu Trp Trp Ala Ala Pro Leu Phe Ser Gly Leu Ile Phe
65 70 75
Ala Gly Ser Thr Glu Met Leu Val Ile Ala Leu Val Val Gly Ala
80 85 90
Ala Pro Leu Gly Ala Ile Ala Leu Thr Thr Leu Leu Val Asn Phe
95 100 105
Arg His Val Phe Tyr Ala Phe Ser Phe Pro Leu His Val Val Lys
110 115 120
Asn Pro Ile Ala Arg Val Tyr Ser Val Phe Ala Leu Ile Asp Glu
125 130 135
Ala Tyr Ala Val Thr Ala Ala Arg Pro Ala Gly Trp Ser Ala Trp
140 145 150
Arg Leu Ile Ser Met Gln Ile Ala Phe His Ser Tyr Trp Val Phe
155 160 165
Gly Gly Leu Thr Gly Val Ala Ile Ala Glu Leu Ile Pro Phe Glu
170 175 180
Ile Lys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Cys Ala Leu Phe Val Thr Leu
185 190 195
Thr Leu Asp Ser Cys Arg Thr Lys Lys Gln Ile Pro Ser Leu Leu
200 205 210
Leu Ala Gly Leu Ser Phe Thr Ile Ala Leu Val Val Ile Pro Gly
215 220 225
Gln Ala Leu Phe Ala Ala Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Thr
230 235 240
Ile Arg Tyr Phe Phe Leu Gly Lys Ala Ala Lys Gln Leu Ile Ser
245 250 255
Pro Ile Phe Ser Leu Leu Ser Gln Tyr Val Gln Ser Leu Leu Leu
260 265 270
Arg Ser Gly Arg Phe Arg Ser Ser Ser Ser Pro Cys Val Asn His
275 280 285
Asn Leu Trp Ala Lys Trp Arg Cys Gly Cys Gln Gln Glu Ser Leu
290 295 300
Pro Phe Pro His Gln Arg Phe Ala Ala Met Arg Ile Arg Leu Pro
305 310 315
Leu Val Ser Leu Pro Leu Arg Leu Gln Trp Trp Arg Ile Phe Leu
320 325 330
Ala Val Asp Ala Pro Cys Ala Leu Ala Leu Ala Pro Ser Phe Leu
335 340 345
Leu Asp Trp Ile Phe Ser
350 351
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 1136
<212> PRT
<213> AHAS及AHAIR（ilvBNC 1 编码）
<400> 3
Val Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala
5 10 15
Ser Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys
20 25 30
Ala Ile Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe
35 40 45
Gly Ile Pro Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr
50 55 60
Ser Ser Thr Lys Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly
65 70 75
Ala Gly His Ala Ala Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val
80 85 90
Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val
95 100 105
Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala
110 115 120
Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe
125 130 135
Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr Met Pro Val Thr Lys His
140 145 150
Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile Pro Gln Ala Leu Ala
155 160 165
Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu
170 175 180
Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu Asp Phe Val
185 190 195
Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val Ser Thr
200 205 210
Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly Glu
215 220 225
Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala
230 235 240
Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly Ile
245 250 255
Pro Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser
260 265 270
His Glu Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser
275 280 285
Ala Val Gly Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly
290 295 300
Ser Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala
305 310 315
Pro Asp Ala Lys Ile Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile
320 325 330
Gly Lys Ile Lys Gln Val Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg
335 340 345
Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala
350 355 360
Glu Thr Glu Asp Ile Ser Glu Trp Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu
365 370 375
Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp Glu Gln Pro Gly Asp Leu
380 385 390
Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu Ser Lys Glu Val Gly
395 400 405
Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp
410 415 420
Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr Trp Leu Asn
425 430 435
Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala Ala Leu
440 445 450
Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile Asp
455 460 465
Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
470 475 480
Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly
485 490 495
Asn Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly
500 505 510
Arg Tyr Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro
515 520 525
Asp Phe Val Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg
530 535 540
Val Thr Lys Ala Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg
545 550 555
Glu Ile Asn Asp Arg Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu
560 565 570
Asp Ala Gln Val Trp Pro Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser
575 580 585
Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp
590 595 600
Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala Asp Ile His Glu Ala Val Ser
605 610 615
Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr Glu Ala Met Ala Asn Ser
620 625 630
Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln Asp Val Asp
635 640 645
Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg Ala Phe
650 655 660
Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly Ile
665 670 675
Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu
680 685 690
Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val
695 700 705
Val Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu
710 715 720
Val Lys Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp
725 730 735
Ala Ala Asn Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp
740 745 750
Ser Val Val Ile Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala
755 760 765
Leu Leu Asp Val Met Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln
770 775 780
Ser Gly Gln Ile Ala Leu Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro
785 790 795
Ala Lys Ile Met Ala Ile Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Asp Ala Asp
800 805 810
Leu Ser Leu Ile Gln Gly Arg Lys Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly
815 820 825
Ser Gln Gly His Ala His Ser Gln Asn Leu Arg Asp Ser Gly Val
830 835 840
Glu Val Val Ile Gly Leu Arg Glu Gly Ser Lys Ser Ala Glu Lys
845 850 855
Ala Lys Glu Ala Gly Phe Glu Val Lys Thr Thr Ala Glu Ala Ala
860 865 870
Ala Trp Ala Asp Val Ile Met Leu Leu Ala Pro Asp Thr Ser Gln
875 880 885
Ala Glu Ile Phe Thr Asn Asp Ile Glu Pro Asn Leu Asn Ala Gly
890 895 900
Asp Ala Leu Leu Phe Gly His Gly Leu Asn Ile His Phe Asp Leu
905 910 915
Ile Lys Pro Ala Asp Asp Ile Ile Val Gly Met Val Ala Pro Lys
920 925 930
Gly Pro Gly His Leu Val Arg Arg Gln Phe Val Asp Gly Lys Gly
935 940 945
Val Pro Cys Leu Ile Ala Val Asp Gln Asp Pro Thr Gly Thr Ala
950 955 960
Gln Ala Leu Thr Leu Ser Tyr Ala Ala Ala Ile Gly Gly Ala Arg
965 970 975
Ala Gly Val Ile Pro Thr Thr Phe Glu Ala Glu Thr Val Thr Asp
980 985 990
Leu Phe Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Thr Glu Glu Leu
995 1000 1005
Val Lys Val Gly Phe Glu Val Leu Thr Glu Ala Gly Tyr Glu Pro
1010 1015 1020
Glu Met Ala Tyr Phe Glu Val Leu His Glu Leu Lys Leu Ile Val
1025 1030 1035
Asp Leu Met Phe Glu Gly Gly Ile Ser Asn Met Asn Tyr Ser Val
1040 1045 1050
Ser Asp Thr Ala Glu Phe Gly Gly Tyr Leu Ser Gly Pro Arg Val
1055 1060 1065
Ile Asp Ala Asp Thr Lys Ser Arg Met Lys Asp Ile Leu Thr Asp
1070 1075 1080
Ile Gln Asp Gly Thr Phe Thr Lys Arg Leu Ile Ala Asn Val Glu
1085 1090 1095
Asn Gly Asn Ala Glu Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ser Tyr Asn Asn
1100 1105 1110
His Pro Ile Glu Glu Thr Gly Ala Lys Leu Arg Asp Leu Met Ser
1115 1120 1125
Trp Val Lys Val Asp Ala Arg Ala Glu Thr Ala
1130 1135 1136
Claims (3)
1.一株通过基因敲除提高L-缬氨酸产量并减少副产物L-丙氨酸和L-异亮氨酸合成的谷氨酸棒状杆菌工程菌，其特征在于：以谷氨酸棒状杆菌ATCC13869为出发菌株，采用（1）基因aceE、alaT和ilvA的敲除组合；（2）基于cre/lox位点特异性重组的敲除方法；获得ATCC13869ΔaceEΔalaTΔilvA突变菌株，命名为WCC003。
2.一株在权利要求1所述的工程菌WCC003中过量表达调控蛋白Lrp、转运蛋白BrnFE及L-缬氨酸合成途径关键基因ilvBNC 1 的高产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌表达组合工程菌WCC003/pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2014149，其特征在于：（1）基因lrp 1 、brnFE和ilvBNC 1 的表达组合；（2）lrp 1 编码的Lrp1蛋白具备有利突变Arg39Trp；(3)表达载体为pJYW-4。
3. 用权利要求2所述的表达组合工程菌CCTCC NO：M2014149发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于：将菌株WCC003/pJYW-4-ilvBNC 1 -lrp 1 -brnFE活化后接种于200mL种子培养基，往复式摇瓶发酵18h后接入装有2L发酵培养基的5L发酵罐；氨水控制pH维持在7.2，温度30℃，溶氧通过转速和通气量偶联维持在30%，当残糖含量低于60g/L时流加葡萄糖，发酵时间96h；最终L-缬氨酸产量达到36.6g/L；
活化培养基配方为：91g/L山梨醇，18.5g/L脑心浸液，5g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，5g/L葡萄糖，2.5g/L酵母膏，0.4g/L异亮氨酸，30 mg/L卡那霉素，以去离子水配制；
种子培养基为发酵培养基适当降低葡萄糖和硫酸铵含量；
发酵培养基配方为：120g/L葡萄糖，40g/L硫酸铵，10g/L 大豆浸出汁，1g/L磷酸二氢钾，5g/L乙酸钾，0.04g/L硫酸亚铁，0.07g/L硫酸锰，0.1g/L硫酸镁，0.7g/L甲硫氨酸，0.4g/L异亮氨酸，0.3mg/L生物素，0.05mg/L VB1，30 mg/L卡那霉素，以去离子水配制，氢氧化钠调pH至7.2。
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