CN113278655B - 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产L‑缬氨酸的重组微生物的构建方法，通过向微生物中导入乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢酶基因，同时增强乙酰羟基还原异构酶和氨基酸脱氢酶的活性，能够提高大肠杆菌生产L‑缬氨酸的产量和转化率，且可实现一步法厌氧发酵L‑缬氨酸。

Description

生产L-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
技术领域
本发明涉及生产L-缬氨酸的重组微生物的构建方法，所述构建方法 获得的重组微生物，具体是重组大肠杆菌，以及通过发酵法生产L-缬氨 酸的方法。
背景技术
L-缬氨酸作为三大支链氨基酸(Branched-chain amino acid，BCAA) 的一种，属于必需氨基酸，在人和动物中不能合成，只能通过从外界补 充获得。目前，L-缬氨酸被广泛用于食品和医药领域，主要包括食品添 加剂、营养增补液及风味剂等；广泛用于化妆品制备、以及用作抗生素 或者除草剂前体等；另外，随着对饲料质量和配比需求的提高，在未来L-缬氨酸在饲料添加剂行业中的作用将越来越重要，需求量会越来越大， 未来市场具有极大的潜力。微生物细胞可以直接合成L-缬氨酸，但胞内 大量反馈抑制等调控网络极大地限制了野生细胞的生产能力。要想获得 能够高效生产L-缬氨酸的发酵菌株，必须有效解除微生物细胞这些自我 调节机制。目前，世界范围内L-缬氨酸主要通过发酵法生产获得。用于发酵的生产菌株多通过诱变而来，出发菌株主要包括谷氨酸棒杆菌、黄 色短杆菌、黄色短杆菌等。陈宁等以黄色短杆菌为出发菌株，使用原生 质体紫外诱变并结合DES化学诱变的策略，筛选获得了一株L-缬氨酸 高产菌TV2564。但是，传统诱变获得的菌株具有很强的随机性，并且 遗传背景不清晰，副产物多，并且不容易进一步通过改造获得更加高产 的菌株。
近年来，随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，通过遗传改造获 得能够高效生产L-缬氨酸、遗传背景清晰、且易于培养的重组工程菌株 应运而生并取得了很好的效果。SangYup Lee课题组2007年从大肠杆菌 W3110出发，结合理性代谢工程、转录组分析和遗传改造、以及基因敲 除等手段获得了一株能够生产L-缬氨酸的工程菌。该菌株在好氧条件下批式培养(batch culture)可以生产缬氨酸但其培养过程中需要持续通氧， 且需添加L-异亮氨酸方能保证细胞正常生长。
谢希贤等整合枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS，解除了 L-缬氨酸对合成通路的反馈抑制，同时整合大肠杆菌ppGpp3’-焦磷酸水 解酶的突变基因spo TM，增强了丙酮酸供应，增强了出发菌株VHY03 的摇瓶发酵生产L-缬氨酸的水平。
目前公开报道的L-缬氨酸发酵生产多是通过好氧或者两步法发酵 实现的。但是好氧工艺在生产过程中需要用空气，能耗很大；更关键的 是，有相当一部分碳源进入三羧酸循环(TCA)从而被用于细胞生长， 导致转化率比理论最大值要低很多。厌氧工艺和好氧相比，具有低能耗、 高转化率的优点，生产过程中不需要通空气，大大节约能耗；产品的转化率通常接近理论最大值。氨基酸生产的厌氧发酵最早是在丙氨酸生产 过程中实现的，目前其他氨基酸的生产暂未有纯厌氧发酵工艺的报道。 此外，目前工程菌改造过程中关键基因的过表达都是通过在质粒上实现 的，这就导致发酵过程中需要添加抗生素维持质粒存在，增加了生产成 本并存在在产业化生产中质粒丢失的风险。
因此，本领域仍需要提供稳定、高产、节能、简便的生产L-缬氨酸 的重组微生物以及相应的L-缬氨酸的生产制备方法。
发明内容
本发明发现，原增强乙酰羟基还异构酶和/或氨基酸脱氢酶的活性， 能够提高大肠杆菌生产L-缬氨酸的产量和转化率，且可实现一步法厌氧 发酵L-缬氨酸。
本发明的第一个方面，是提供一种L-缬氨酸的重组微生物的构建方 法，经该方法获得的重组微生物具有稳定遗传背景、且具备平衡的L- 缬氨酸还原力，适宜一步法厌氧发酵。
在本申请中，酶的活性“增强”是指提高微生物中有相应的DNA编 码的一种或多种酶的胞内活性，增强活性可以通过本领域已知的任何合 适方法实现，例如通过过表达，包括但不限于提高所述基因或等位基因 的拷贝数，修饰指导或控制基因表达的核苷酸序列，使用强启动子或使 用蛋白质活性或浓度一般比起始微生物水平提高10％-500％。
在一个实施方式中，向微生物中导入乙酰羟酸异构还原酶基因或/ 和氨基酸脱氢酶基因，使得所述酶活性增强。
在一个实施方式中，本发明导入的乙酰羟基酸还原酶基因和氨基酸 脱氢酶基因对于被导入的微生物而言是外源的。所述乙酰羟基酸还原酶 基因和氨基酸脱氢酶基因可以是来自任何微生物例如乳球菌、芽孢杆菌 等的相应基因。
在一个实施方式中，所述乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢 酶基因是NADH依赖型的。
厌氧条件下细胞产生的还原力类型大部分是NADH，为实现在厌氧 条件下高效生产L-缬氨酸，须解决辅因子不平衡问题。本发明一个实施 方式中选择NADH依赖型的乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢 酶基因能够使得厌氧条件下过剩的NADH得到消耗，解决厌氧发酵时还 原力平衡的问题。
在一个实施方式中，所述乙酰羟酸异构还原酶基因是ilvC或KARI； 所述氨基酸脱氢酶基因是亮氨酸脱氢酶基因。
在一个优选的实施方式中，所述乙酰羟酸异构还原酶基因是KARI， 所述亮氨酸脱氢酶基因是leuDH。
所述乙酰羟酸异构还原酶基因和氨基酸脱氢酶基因可以以本领域已 知的任何合适方式，例如以质粒形式，或者整合入基因组中的形式存在 与所述微生物中。在一个实施方式中，所述整合入基因组中的酶编码基 因置于合适的调控元件的控制下。
所述调控元件选自M1-46人工调控元件、M1-93人工调控元件或 RBS5人工调控元件；
在一个实施方式中，M1-46人工调控元件调控ilvC基因。
在一个实施方式中，M1-93人工调控元件调控leuDH基因；
在一个实施方式中，RBS5人工调控元件调控KARI基因。
在一个实施方式中，本发明还包括对上述重组微生物的以下酶基因 中的一种或几种进行如下改造，以使得这些酶的活性降低或失活。
(1)敲除甲基乙二醛合酶(mgsA)基因；
(2)敲除乳酸脱氢酶(ldhA)基因；
(3)敲除磷酸乙酰转移酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)基因；
(4)敲除丙酸激酶(tdcD)和/或甲酸乙酰转移酶(tdcE)基因；
(5)敲除醇脱氢酶(adhE)基因；
(6)敲除富马酸还原酶(frd)和/或丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)基 因。
本领域技术人员能够理解，可以用现有技术已知的方式进行基因敲 除，使得所述酶的活性被降低或失活。所述的敲除操作针对的是出发微 生物内源性的酶基因，使得微生物的上述内源性酶活性降低或失活。
还可以通过同源重组等基因工程的方式，以另一基因的编码序列取 代上述(1)-(6)中所述酶基因的编码序列，从而使得微生物的上述内 源性酶活性降低或失活。替代这些内源性酶的基因可以是待增强表达的 基因，如上述的ilvC基因、KARI基因或leuDH基因。
在一个实施方式中，还包括增强本发明的重组微生物中的乙酰乳酸 合成酶(AHAS)和/或二羟酸脱水酶(ilvD)的活性。
在一个优选地实施方式中，AHAS选自ilvBN、ilvGM或ilvIH，它 们中至少一种酶的活性被增强。在一个优选地实施方式中，AHAS的活 性通过解除缬氨酸对ilvIH的反馈抑制得到增强，例如通过突变ilvH基 因解除缬氨酸对ilvIH的反馈抑制。
就涉及L-缬氨酸生物合成的乙酰羟酸合成酶而言，除了同功酶Ⅱ(这 里也称为AHASⅡ)，还知道有同功酶Ⅲ(这里也称为AHASⅢ)。AHASⅢ 由ilvIH操纵子编码，该操纵子由编码大亚基(催化亚基)的ilvI和编码小 亚基(控制亚基)的ilvH组成。AHASⅢ受L-缬氨酸的反馈抑制。可采用 已报道的方法突变ilvI基因，例如ilvH 14Gly→Asp的氨基酸取代(Vyazmensky,M.等，《生物化学》35:10339-10346(1996))和/或ilvH 17Ser→Phe(US6737255B2)；以及ilvH612(De Felice等，《细菌学杂志》 120:1058-1067(1974))等。
在一个实施方式中，本发明的重组微生物中的二羟酸脱水酶(ilvD) 的活性被增强，例如通过向微生物中导入ilvD基因增强ilvD的活性。
增强AHAS和/或二羟酸脱水酶(ilvD)的活性，任选地结合上述(1) -(6)任一项或几项改造进行操作。
在一个实施方式中，结合第(2)项改造进行操作。
在一个实施方式中，结合第(6)项改造进行操作。
在一个实施方式中，结合第(2)项和第(5)项改造进行操作。
在一个实施方式中，结合第(1)项、第(3)-(6)项改造进行操 作。
在一个实施方式中，结合第(1)-(6)项改造进行操作。
在一个实施方法中，任选地，以ilvC基因替换微生物内源性的mgsA 基因来实现第(1)项敲除。
在一个实施方式中，以ilvD基因替换微生物内源性的pflB基因， 和/或以leuDH基因替换微生物内源性的frd基因来实现第(6)项敲除。
在一个优选地实施方式中，以KARI基因替换微生物内源性的adhE 基因来实现第(5)项敲除。
所述替换可以本领域技术人员已知的方式，将待插入的基因的编码 序列整合到所述微生物染色体中被替换的基因编码序列位点，使得原位 点基因编码序列被整合插入的基因的编码序列所取代。
优选地，KARI、ilvC、ilvD和leuDH的替换同时发生，其中ilvC 基因可任选的被再次敲除。
在一个实施方式中，所述的微生物为大肠杆菌。
在一个实施方式中，所述的微生物为大肠杆菌ATCC 8739。
在一个实施方式中，使用至少一个调控元件调控上述涉及的酶的基 因。
在一个实施方式中，所述调控元件选自M1-46人工调控元件、M1-93 人工调控元件或RBS5人工调控元件。
在一个实施方式中，M1-46人工调控元件调控ilvC基因。
在一个实施方式中，M1-93人工调控元件调控ilvD、leuDH、ilvBN 和ilvGM基因。
在一个实施方式中，RBS5人工调控元件调控KARI基因。
调控元件可通过已知的基因工程方法插入ilvC基因的上游。所述方 法包括但不限于以基因重组的方式，例如以同源重组的方式调控元件的 序列插入目标酶的基因编码序列上游，以增强目标基因表达的强度。
在一个实施方式中，其中所述酶编码基因和所述的调控元件整合入 所述微生物的基因组中。
在一个实施方式中，将包含所述述酶编码基因和所述的调控元件序 列的质粒导入所述微生物中。
在一个实施例中，以整合入所述微生物的基因组的方法完成目标酶 基因的导入、突变或敲除。
在一个实施例中，以同源重组的方法完成所述酶基因的导入、突变 或敲除。
在一个实施例中，以两步同源重组的方法完成所述酶基因的导入、 突变或敲除。
可采用本领域已知的同源重组系统，如大肠杆菌RecA重组系统， Red重组系统进行同源重组以实现目标基因的导入、突变或敲除。
以两步同源重组的方法导入、突变或敲除目标基因包括如下步骤 (以大肠杆菌为例)：
(1)DNA片段I的制备：以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用扩增引物1扩增出 DNA片段I，用于第一步同源重组；
(2)第一步同源重组：将pKD46质粒(Datsenko and Wanner 2000, Proc NatlAcadSci USA 97:6640-6645)转化至大肠杆菌，然后将DNA片 段I转至pKD46的大肠杆菌，使用检测引物1验证转化的菌并挑选菌落；
(3)DNA片段II的制备：以出发大肠杆菌为模板，用扩增引物2 扩增出DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。
(4)第二步同源重组：将DNA片段II转化至步骤(2)挑选获得 的菌落；使用检测引物2验证转化的菌并挑选菌落。
本发明的第二个方面，是提供了一种利用上述构建方法得到的用于 生产L-缬氨酸的重组微生物，具体是一种重组大肠杆菌，其包含乙酰羟 酸异构还原酶和/或氨基酸脱氢酶基因，
在一个实施方式中，采用大肠杆菌ATCC 8739作为出发菌株，通过基因 同源重组实现胞内辅因子NADH供给和细胞生长的偶联，从而实现厌氧 条件下细胞生长和L-缬氨酸生产的偶联(附图1)。
在一个实施方式中，利用上述构建方法得到的重组大肠杆菌，进一 步经过代谢进化，经过例如50代、70代、80代、90代、100代、120 代获得了高产L-缬氨酸的重组大肠杆菌。在一个实施方式中，经105 代代谢进化获得了一株产L-缬氨酸的重组大肠杆菌，其于2020年3月6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏单位 位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC 19458，分 类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
本发明的第三方面，是上述方法获得的重组微生物在生产L-缬氨酸 中的应用。
本发明的第四方面，是利用上述构建获得的重组微生物发酵生产L- 缬氨酸的方法，包括：(1)发酵培养构建获得的重组微生物；(2)分离 并收获L-缬氨酸。
在一个实施方式中，所述发酵培养为厌氧发酵培养。
在一个实施方式中，所述厌氧发酵包括如下步骤：
(1)种子培养：挑取平板上的克隆接种到种子培养基中，37℃， 振荡培养，获得种子培养液；
(2)发酵培养：将种子培养液接种于发酵培养基，37℃，150rpm， 发酵2～4天，得到发酵液。控制发酵罐的pH在7.0。培养过程不通任何 气体。
其中种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
葡萄糖20g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO48.8g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O2g/L。
发酵培养基和种子培养基成分相同，区别仅在于葡萄糖浓度为50 g/L。
本发明的有益效果：
(1)相对于之前的生产方法和菌株，本发明实现了一步法厌氧发 酵生产L-缬氨酸，降低了生产成本、提高了转化率。
(2)本发明优选对重组微生物的基因组而非以质粒形式构建稳定 遗传的L-缬氨酸生产菌株，不需要额外添加抗生素和诱导剂等物质，生 产工艺稳定易操作。
(3)通过代谢进化方式，提高了重组微生物的L-缬氨酸的产量和 转化率以及细胞耐受性。
附图说明
图1：L-缬氨酸合成途径
图2：高效液相色谱测定L-缬氨酸的标准品
图3：高效液相色谱测定Sval064菌株发酵液组分
图4：代谢进化发酵培养获得Sval065菌株
图5：高效液相色谱测定L-缬氨酸的标准品
图6：高效液相色谱测定Sval065菌株发酵液组分
具体实施方式
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当 理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要 求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以 清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的 前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改 变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下 述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本研究中所构建的菌株和质粒详见表1，所用引物详见表2。
表1本发明所用的菌株和质粒
Figure BDA0002489612930000091
Figure BDA0002489612930000101
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表2本发明所用的引物
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Figure BDA0002489612930000121
Figure BDA0002489612930000131
Figure BDA0002489612930000141
实施例1：ATCC 8739菌株中甲基乙二醛合酶编码基因mgsA的敲除 从大肠杆菌ATCC 8739出发，采用两步同源重组的方法敲除甲基乙 二醛合酶编码基因mgsA，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物mgsA-cs-up/ mgsA-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
扩增体系为：Phusion 5X缓冲液(NewEngland Biolabs)10μl、 dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、 Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总 体积为50μl。
扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃ 退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将上述DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒-(购 买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化 法转化至大肠杆菌ATCC 8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌ATCC 8739。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC 8739的 电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片 段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用 MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅 速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm， 30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml) 和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌 落进行PCR验证，所用引物XZ-mgsA-up/XZ-mgsA-down，正确的菌落 扩增产物为3646bp的片段，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval001。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的基因组DNA为模板，用 引物XZ-mgsA-up/mgsA-del-down扩增出566bp的DNA片段II。DNA 片段II用于第二次同源重组。扩增条件和体系同第一步中所述。将DNA 片段II电转至菌株Sval001。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的Sval001的电转化感受态 细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放 置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad 公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mlLB培养基 转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时。 将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶 中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB 固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-mgsA-up/mgsA-del-down，正确的菌落扩增产物为1027bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval002。
实施例2：乳酸脱氢酶编码基因ldhA的敲除
从Sval002出发，通过两步同源重组的方法敲除乳酸脱氢酶编码基 因ldhA，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物ldhA-cs-up/ ldhA-cs-dwon扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩 增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I电转至 Sval002。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval002，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval002。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行验证，正确的PCR 产物应该3448bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval003。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 XZ-ldhA-up/ldhA-del-down扩增出476bp的DNA片段II。DNA片段II 用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval003。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正确的菌落扩增产物为829bp的片段，挑 选一个正确的单菌落，将其命名为Sval004。
实施例3：磷酸乙酰转移酶编码基因pta和乙酸激酶编码基因ackA的敲 除
从Sval004出发，通过两步同源重组的方法敲除磷酸乙酰转移酶编码 基因pta和乙酸激酶编码基因ackA，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 ackA-cs-up/pta-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同 源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I 电转至Sval004。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval004，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval004。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down进行验证，正确的PCR 产物应该3351bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval005。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 XZ-ackA-up/ackA-del-down扩增出371bp的DNA片段II。DNA片段II 用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval005。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-ackA-up/XZ-pta-down，正确的菌落扩增产物为732bp的片段，挑选 一个正确的单菌落，将其命名为Sval006。
实施例4：丙酸激酶编码基因tdcD和甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE的 敲除
从Sval006出发，通过两步同源重组的方法敲除丙酸激酶编码基因 tdcD和甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 tdcDE-cs-up/tdcDE-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步 同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I 电转至Sval006。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval006，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval006。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-tdcDE-up/XZ-tdcDE-down进行验证，正确的 PCR产物应该4380bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval007。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 XZ-tdcDE-up/tdcDE-del-down扩增出895bp的DNA片段II。DNA片段 II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval007。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为XZ-tdcDE-up/ XZ-tdcDE-down，正确的菌落扩增产物为1761bp的片段，挑选一个正 确的单菌落，将其命名为Sval008。
实施例5：醇脱氢酶基因adhE的敲除
从Sval008出发，通过两步同源重组的方法敲除醇脱氢酶基因adhE， 具体步骤包括：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物adhE-cs-up /adhE-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。 扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval008，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval008。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-adhE-up/XZ-adhE-down进行验证，正确的PCR 产物应该3167bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval009。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 XZ-adhE-up/adhE-del-down扩增出271bp的DNA片段II。DNA片段II 用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval009。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-adhE-up/XZ-adhE-down，正确的菌落扩增产物为548bp的片段，挑 选一个正确的单菌落，将其命名为Sval010。
实施例6：乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC在甲基乙二醛合酶编码 基因mgsA位点的整合
从Sval010出发，通过两步同源重组的方法将来自大肠杆菌的乙酰 羟基酸还原异构酶编码基因ilvC整合到甲基乙二醛合酶编码基因mgsA 位点，具体步骤包括：
第一步，在Sval010菌株中mgsA位点整合cat-sacB片段，cat-sacB 片段的PCR、整合、验证同实施例1中mgsA基因敲除的第一步完全一 致，获得的克隆命名为Sval011。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 mgsA-ilvC-up/mgsA-ilvC-down扩增出1576bp的DNA片段II。DNA片 段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval011。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-mgsA-up/XZ-mgsA-down，正确的菌落扩增产物为2503bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval012。
实施例7：乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC的调控
从Sval012出发，使用人工调控元件调控整合在甲基乙二醛合酶编 码基因mgsA位点的乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC的表达，具体 步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 mgsA-Pcs-up/mgsA-Pcs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一 步同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片 段I电转至Sval012。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval012，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval012。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-mgsA-up/ilvC-YZ347-down进行验证，正确的 PCR产物应该3482bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval013。
第二步，以M1-46(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物 mgsA-P46-up/ilvC-P46-down扩增出188bp的DNA片段II。DNA片段 II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval013。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-mgsA-up/ilvC-YZ347-down，正确的菌落扩增产物为951bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval014。
实施例8：二羟酸脱水酶编码基因ilvD的整合
从Sval014出发，通过两步同源重组的方法将来自大肠杆菌的二羟 酸脱水酶编码基因ilvD整合到丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB位点并替 换掉pflB基因，即在整合ilvD的同时敲除pflB基因，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 pflB-CS-up/pflB-CS-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步 同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I 电转至Sval014。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval014，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval014。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-pflB-up600/XZ-pflB-down进行验证，正确的 PCR产物应该3675bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval015。
第二步，以大肠杆菌MG1655(来自ATCC，编号700926)的基因 组DNA为模板，用引物pflB-ilvD-up/pflB-ilvD-down扩增出1951bp的 DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转 至菌株Sval015。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-pflB-up600/XZ-pflB-down，正确的菌落扩增产物为2907bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval016。
实施例9：二羟酸脱水酶编码基因ilvD的表达调控
从Sval016出发，使用人工调控元件调控整合在丙酮酸甲酸裂解酶 编码基因pflB位点的二羟酸脱水酶编码基因ilvD的表达，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物 pflB-Pcs-up/pflB-Pcs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步 同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。将DNA片段I 电转至Sval016。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval016，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval016。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-pflB-up600/ilvD-YZ496-down进行验证，正确 的PCR产物应该3756bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval017。
第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物 pflB-Pro-up/ilvD-Pro-down扩增出189bp的DNA片段II。DNA片段II 用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval017。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-pflB-up600/ilvD-YZ496-down，正确的菌落扩增产物为1226bp的片 段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval018。
实施例10：乙酰乳酸合成酶基因ilvBN的调控
使用人工调控元件M1-93通过两步同源重组的方法调控乙酰乳酸合 成酶基因ilvBN的表达，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物ilvB pro-catup/ilvB pro-catdown扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩 增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval018，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval018。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物ilvB pro-YZup/ilvB pro-YZdown进行验证，正确的 PCR产物应该2996bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval019。
第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物ilvB pro-up/ilvB pro-down扩增出188bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源 重组。将DNA片段II电转至菌株Sval019。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为ilvB pro-YZup/ilvB pro-YZdown，正确的菌落扩增产物为465bp的片段，挑选一个正确的单 菌落，将其命名为Sval020。
实施例11：乙酰乳酸合成酶基因ilvGM的调控
使用人工调控元件M1-93通过两步同源重组的方法调控乙酰乳酸合 成酶基因ilvGM的表达，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物ilvGpro-catup/ilvG pro-catdown扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩 增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval020，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval020。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物ilvGpro-YZup/ilvGp-YZdown进行验证，正确的 PCR产物应该2993bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval021。
第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA质粒DNA为模板，用引物ilvG pro-up/ilvGpro-down扩增出188bp的DNA片段II。DNA片段II用于 第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval021。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为ilvG pro-YZup/ilvG p-YZdown，正确的菌落扩增产物为462bp的片段，挑选一个正确的单 菌落，将其命名为Sval022。
实施例12：乙酰乳酸合成酶基因ilvH的突变
通过两步同源重组的方法在ilvH基因中引入突变解除L-缬氨酸的 反馈抑制，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物ilvH*-cat-up/ ilvH*-cat-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。 扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval022，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval022。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物ilvH*-mutYZ-up/ilvH*-mut-down进行验证，正确 的PCR产物应该3165bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval023。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物 ilvH*-mut-up/ilvH*-mut-down扩增出467bp的DNA片段II。DNA片 段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval023。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为ilvH*-mutYZ-up/ ilvH*-mut-down，正确的菌落扩增产物为619bp的片段，挑选一个正确 的单菌落，将其命名为Sval024。
实施例13：使用重组菌株Sval024发酵生产L-缬氨酸
种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
葡萄糖20g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO48.8g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O2g/L。
发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别仅在于葡萄糖浓度为50 g/L。
Sval024的厌氧发酵包括以下步骤：
(1)种子培养：将LB平板上新鲜的克隆接种到含有4ml种子培养 基的试管中，37℃，250rpm振荡培养过夜。然后，按照2％(V/V)的接 种量将培养物转接到含有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，在37℃， 250rpm振荡培养12小时得到种子培养液用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种 子培养液按照终浓度OD550＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150 rpm，发酵4天，得到发酵液。中和剂为5M氨水，使发酵罐的pH控制 在7.0。培养过程中不通任何气体。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1260)高效液相色谱仪对发酵4天的 发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯 乐(Biorad)公司的AminexHPX–87H有机酸分析柱。氨基酸测定使用Sielc 氨基酸分析柱primesep 100250×4.6mm。
结果发现：Sval024菌株在厌氧条件下发酵4天，能够生产1.3g/L 的L-缬氨酸(出现与图2对应位置的L-缬氨酸峰)，糖酸转化率0.31 mol/mol。
实施例14：亮氨酸脱氢酶编码基因leuDH的克隆与整合
leuDH基因是根据文献报道(Ohshima,T.et.al,Properties of crystallineleucine dehydrogenase from Bacillus sphaericus.The Journal of biologicalchemistry 253,5719-5725(1978))的来自Lysinibacillus sphaericus IFO 3525菌株的leuDH序列并经过密码子优化(优化序列为 序列69)后通过全基因合成获得，合成时在leuDH基因前加上M1-93 人工调控元件用于启动leuDH基因的表达，插入pUC57载体，构建获得质粒pUC57-M1-93-leuDH(南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合 成和载体构建)。将M1-93人工调控元件和leuDH基因一起通过来两步 同源重组的方法整合到Sval024菌株中富马酸还原酶编码基因frd位点并 替换掉frd基因，即在整合leuDH的同时敲除frd基因。具体步骤包括：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物frd-cs-up/ frd-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩 增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转 化法转化至大肠杆菌Sval024，然后将DNA片段I电转至带有pKD46 的大肠杆菌Sval024。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第一步方 法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素 (终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行 PCR验证，使用引物XZ-frd-up/XZ-frd-down进行验证，正确的PCR产 物应该3493bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Sval025。
第二步，以pUC57-M1-93-leuDH质粒DNA为模板，用引物 frd-M93-up/frd-leuDH-down扩增出1283bp的DNA片段II。DNA片段 II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval025。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为XZ-frd-up/XZ-frd-down， 正确的菌落扩增产物为2057bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其 命名为Sval026。
实施例15：使用重组菌株Sval026发酵生产L-缬氨酸
种子培养基和发酵培养基的组成和配制同实施例13中所述相同。
发酵在500mL的发酵罐中进行，发酵过程和分析过程同实施例13 中所述Sval024的发酵过程和分析过程一致。
结果发现：Sval026菌株在厌氧条件下发酵4天，能够生产1.8g/L 的L-缬氨酸(出现与图2对应位置的L-缬氨酸峰)，糖酸转化率0.56 mol/mol。
实施例16：NADH依赖性乙酰羟基酸还原异构酶编码基因在醇脱氢酶 基因adhE位点的整合
乙酰羟基酸还原异构酶编码基因kari是根据文献报道 (Brinkmann-Chen,S.,Cahn,J.K.B.&Arnold,F.H.Uncovering rare NADH-preferring ketol-acidreductoisomerases.Metab Eng 26,17-22, doi:10.1016/j.ymben.2014.08.003(2014).)的来自Thermacetogenium phaeum菌株的kari序列并经过密码子优化(优化序列参见序列70)后 通过全基因合成获得，合成时在kari基因前加上RBS5人工调控元件用 于启动kari基因的表达，插入pUC57载体，构建获得质粒 pUC57-RBS5-kari(南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成和载体 构建)。将RBS5人工调控元件和kari基因一起通过来两步同源重组的方 法整合到Sval026菌株中醇脱氢酶编码基因adhE位点。具体步骤包括：
第一步，将cat-sacB基因整合Sval026中adhE基因位点，片段的获 得和纯化、第一步同源重组的整合、验证同实施例5中adhE基因敲除 第一步同源重组所用片段和方法完全一致，获得的克隆命名为Sval061 (表1)。
第二步，以pUC57-RBS5-kari质粒DNA为模板，用引物 adhE-RBS5-up/adhE-kari-down扩增出1188bp的DNA片段II。DNA片 段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Sval061。
电转条件和步骤同实施例1中所述用于mgsA基因敲除的第二步方 法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为 XZ-adhE-up/XZ-adhE-down，正确的菌落扩增产物为1636bp的片段， 挑选一个正确的单菌落，将其命名为Sval062。
实施例17：mgsA位点NADPH依赖性乙酰羟基酸还原异构酶编码基因 的敲除
通过两步同源重组的方法敲除整合在甲基乙二醛合酶编码基因mgsA 位点的NADPH依赖性乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC，具体步骤 如下：
第一步，将cat-sacB基因整合到mgsA位点替代ilvC基因，片段的 获得和纯化、第一步同源重组的整合、验证同实施例1中mgsA敲除第 一步同源重组所用片段和方法完全一致，获得的克隆命名为Sval063(表 1)。
第二步，使用mgsA敲除的片段替代cat-sacB片段，获得mgsA基因 及ilvC基因敲除的菌株，片段的获得和纯化、第二步同源重组的整合、 验证同实施例1中mgsA敲除第二步同源重组所用片段和方法完全一致， 获得的克隆命名为Sval064。
实施例18：使用重组菌株Sval064发酵生产L-缬氨酸
种子培养基和发酵培养基的组成和配制同实施例13中所述相同。
发酵在500mL的发酵罐中进行，发酵过程和分析过程同实施例13 中所述Sval024的发酵过程和分析过程一致。
结果发现：
Sval064菌株在厌氧条件下发酵4天，能够生产2.0g/L的L-缬氨酸 (出现与图2对应位置的L-缬氨酸峰)，糖酸转化率0.80mol/mol(图3)。
实施例19：重组菌株Sval065的构建
从Sval064开始，通过进化代谢同步提高细胞生长和L-缬氨酸的生 产能力。
进化代谢过程使用500ml的发酵罐，发酵培养基为250ml。使用 5M氨水为中和剂，使发酵罐的pH控制在7.0。进化代谢所用的发酵培 养基组成和配制同实施例16中发酵培养基所述。每24小时，将发酵液 转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.1，经过105代进化，获得菌 株Sval065(图4)。Sval065菌株以保藏号CGMCC 19458保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
实施例20：重组菌株Sval065在500mL发酵罐中发酵生产L-缬氨酸
种子培养基的组成和配制同实施例13中所述相同。
发酵在500mL的发酵罐中进行，发酵培养基为250ml。发酵培养 基基本上和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为100g/L，使用的中和 剂为5M氨水，使发酵罐的pH控制在7.0。
结果发现：Sval065发酵48小时后，L-缬氨酸产量达45g/L，产率 达0.9mol/mol，无杂酸等杂质生成。
实施例21：重组菌株Sval065在5L发酵罐中发酵生产L-缬氨酸
种子培养基的组成和配制、分析方法同实施例13中所述相同。发 酵培养基基本上和种子培养基相同，区别仅在于葡萄糖浓度为140g/L。
发酵在5L发酵罐(上海保兴，BIOTECH-5BG)中厌氧进行，包括以 下步骤：
(1)种子培养：500ml三角瓶中种子培养基为150ml，115℃灭菌15 min。冷却后将重组大肠杆菌Sval045按照1％(V/V)的接种量接种于种 子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12小时得到种子液，用于 发酵培养基接种。
(2)发酵培养：5L中发酵培养基体积为3L，115℃灭菌25min。将种 子液按照终浓度OD550＝0.2的接种量接种于发酵培养基，37℃厌氧培养 3天，搅拌转速200rpm，得到发酵液。发酵液为发酵罐内所有物质。培 养过程没有通任何气体。
结果发现：Sval065发酵48小时后，L-缬氨酸产量达83g/L，产率 达0.92mol/mol(0.6g/g)，无杂酸等杂质生成(图5-6)。

Claims (13)

1.一种生产L-缬氨酸的重组微生物的构建方法，其特征在于，向微生物中导入NADH依赖型乙酰羟酸异构还原酶基因kari和NADH依赖型亮氨酸脱氢酶基因leuDH，使得乙酰羟酸异构还原酶和氨基酸脱氢酶活性增强，还包括对微生物进行以下第(1)项-第(7)项的改造：
(1)敲除甲基乙二醛合酶基因mgsA；
(2)敲除乳酸脱氢酶基因ldhA；
(3)敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA；
(4)敲除丙酸激酶基因tdcD和甲酸乙酰转移酶基因tdcE；
(5)敲除醇脱氢酶基因adhE；
(6)敲除富马酸还原酶基因frd和丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB；
(7)增强乙酰乳酸合成酶AHAS和二羟酸脱水酶ilvD的活性；
所述的微生物为大肠杆菌；
所述AHAS包括ilvBN、ilvGM和ilvIH；
所述ilvIH的AHAS的活性通过解除缬氨酸对ilvIH的反馈抑制得到增强。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以ilvD基因替换微生物本身的pflB基因的方式实现第(6)项。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以leuDH基因替换微生物本身的frd基因的方式实现第(6)项。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以KARI基因替换微生物本身的adhE基因的方式实现第(5)项。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC替换微生物本身的mgsA基因的方式实现第(1)项，且ilvC在导入后再次敲除。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的微生物为大肠杆菌ATCC 8739。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，使用至少一个调控元件增强所述酶基因的活性。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述调控元件为M1-46人工调控元件调控ilvC基因。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述调控元件为M1-93人工调控元件调控ilvD、leuDH、ilvBN和ilvGM基因。
10.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述调控元件为RBS5人工调控元件调控KARI基因。
11.利用权利要求1-10任一项所述构建方法得到的重组微生物。
12.一种重组微生物，其保藏号为CGMCC 19458。
13.权利要求11或权利要求12所述的重组微生物在生产L-缬氨酸中的应用。
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