JPH06277067A - アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 コリネ型細菌由来のアセトヒドロキシ酸イソ
メロレダクターゼをコードする遺伝子を用い、効率的に
Ｌ−イソロイシン又はＬ−バリンを製造する。 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
から単離された、３３８個のアミノ酸をコードする１０
１４の塩基対より成るアセトヒドロキシ酸イソメロレダ
クターゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を同種
であるコリネ型細菌に導入し、該コリネ型細菌を用い
て、新たな観点から効率的にＬ−イソロイシン又はＬ−
バリンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌由来のア
セトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．
１．１．８６）をコードする遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子を
含む組換えプラスミド、該プラスミドで形質転換された
コリネ型細菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】アセトヒドロキシ酸イソメロレダクター
ゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．８６）は、イソロイシン及び
バリンの生合成遺伝子の一つとして、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてよく
研究されており〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６１，２４４１−２４
５０，１９８６〕、その他にも、シネコシスティス（Ｓ
ｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）由来遺伝子〔ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７４，７９１０−７
９１８，１９９２〕、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来遺伝子〔ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７４，６５８０−
６５８９，１９９２〕、リゾビウム・メリロティー（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）由来遺伝子〔ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７３，７７５６−
７７６４，１９９１〕、サッカロマイセス・セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）由来遺伝子〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｓｅａｒｃｈ）１
４，９６３１−９６５１，１９８６〕、スピナチア・オ
レラセア（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ）由来
遺伝子〔バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉａｃｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）２７７，４９６−４７５，
１９９１〕の一次構造が決定されている。。しかしなが
ら、産業上重要な細菌であるコリネ型細菌由来のアセト
ヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．
１．８６）遺伝子の一次構造について、従来の報告例は
ない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コリ
ネ型細菌由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクター
ゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．８６）をコードする遺伝子を
単離し、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、
該コリネ型細菌を用いて、新たな観点から効率的にＬ−
イソロイシン又はＬ−バリンを製造することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌染色
体よりアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子
を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
かくして、本発明によれば、（１） コリネ型細菌由来
のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードす
る遺伝子ＤＮＡ、（２） 該遺伝子ＤＮＡが導入された
組換えプラスミド、（３） 該組換えプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌、が提供される。

【０００５】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクター
ゼをコードする遺伝子ＤＮＡ」とは２−アセト−２−ヒ
ドロキシ酪酸から２，３−ジヒドロキシ−３−メチル吉
草酸を合成する酵素、あるいは、２−アセト乳酸から
２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸を合成する酵素、すな
わちアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（Ｅ．
Ｃ．１．１．８６）をコードする遺伝子ＤＮＡを意味す
る。

【０００６】アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、これを
「Ａ断片」と略称することがある）は、その塩基配列が
決定された後は合成することも可能であるが、一般には
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ生産性を有す
る微生物からクローニングすることができ、その供給源
となる微生物としては、コリネ型細菌、殊にブレビバク
テリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）およびその由来株が有利に使用される。

【０００７】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る：Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限
酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から以下
に述べる方法で分離、取得することができる。

【０００８】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＢｇｌ II 及び
ＥｃｏＲＩを用いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。得
られるＤＮＡ断片を平滑末端処理後、大腸菌における発
現ベクター、例えばｐＫＫ２３３−３（ファルマシア
製）に挿入し、このベクターを用いてアセトヒドロキシ
酸イソメロレダクターゼ遺伝子が欠損したイソロイシン
及びバリン要求性大腸菌変異株エシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＥ８３１５〔国立
遺伝学研究所、遺伝実験生物保存研究センター；〒４１
１、静岡県三島市谷田１１１１番地〕を形質転換し、選
択培地に塗抹することにより、形質転換株を取得する。
得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制
限酵素で解析することにより挿入されたブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来のＡ断片を確
認・取得することができる。

【０００９】かくして得られるＡ断片をさらに適当な制
限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌
で複製可能なベクターブラスミドに挿入し、このベクタ
ープラスミドを通常用いられる形質転換法、例えば、塩
化カルシウム法、電気パルス法等による形質転換により
前記イソロイシン及びバリン要求性大腸菌変異株に導入
し、選択培地に塗抹する。

【００１０】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより、挿入された
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由
来のＡ断片を確認・取得することができる。このように
して得られるＡ断片の一つは、上記ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩの完全分解により切り出し、さらにそれを制限
酵素Ｂｇｌ II で切断することによって得られる大きさ
が約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。

【００１１】この約２．１ｋｂのアセトヒドロキシ酸イ
ソメロレダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び
切断断片の大きさを下記表１に示す。

【００１２】

【表１】 表１ 制限酵素 認識部位数 切断片の大きさ（ｋｂ） ＰｖｕＩＩ １ １．５５ ０．５５ ＳａｌＩ ２ ０．９５ ０．６５ ０．５ ＥｃｏＲＶ １ １．１ １．０ ＳｔｕＩ １ １．８ ０．３ ＤｒａＩ １ １．４ ０．７

【００１３】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。

【００１４】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ IIIで切断
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大
きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それ
ぞれの大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の
大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさにつ
いては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる
結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大
きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって得られる結果を採用した。

【００１５】一方、上記したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｂｇｌ II によって切断することにより得られる大
きさが約２．１ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基
配列をプラスミドｐＵＣ１１８及び／またはｐＵＣ１１
９（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ法、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，ｐ５４６
３，１９７７）により決定することができる。このよう
にして決定した上記約２．１ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配
列のオープンリーディングフレームの存在から決定した
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする
遺伝子は、後記する配列表の配列番号：１に示す配列を
有するものであり、３３８個のアミノ酸をコードする１
０１４塩基対から構成されている。

【００１６】上記した、後記配列表の配列番号：１に示
す塩基配列を包含して成る本発明のアセトヒドロキシ酸
イソメロレダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離され
たもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例
えばアプライド・バイオシステムズ社製３９４ＤＮＡ／
ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであって
もよい。

【００１７】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダク
ターゼをコードする機能を実質的に損なうことがない限
り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていて
もよく又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が
挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位さ
れているものであってもよく、これらの誘導体のいずれ
もが、本発明のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクター
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に包含されるも
のである。

【００１８】以上に詳述した大きさが約２．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に示す。本発明の
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）は、適当なプラスミ
ドベクター、例えば、コリネ型細菌内でプラスミドの複
製増殖機能を司る遺伝子を少くとも含むプラスミドベク
ターに導入することにより、コリネ型細菌内でアセトヒ
ドロキシ酸イソメロレダクターゼの高発現可能な組換え
プラスミドを得ることができる。

【００１９】また、本発明のアセトヒドロキシ酸イソメ
ロレダクターゼをコードする遺伝子を発現させるための
プロモーターは、コリネ型細菌が保有する該遺伝子自身
のプロモーターであることができるが、それに限られる
ものではなく、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクター
ゼ遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来の塩基
配列であれば、いかなるプロモーターであってもよい。

【００２０】本発明のＡ断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平３
−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。

【００２１】中でもコリネ型細菌の宿主ベクター系で用
いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内
でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細
菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつも
のが好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲ
Ｙ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２
ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘ等が好適に使用される。

【００２２】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）か
らプラスミドｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細につ
いては特開平１−９５７８５号公報参照）ＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラス
ミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（以
下これを「複製領域」と言うことがある。）を切り出
し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約
２．１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含
むＤＮＡ断片（以下これを「安定化領域」と言うことが
ある。）を切り出す。これらの両断片をプラスミドｐＨ
ＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及
びＳａｌＩ部位に組み込むことにより、プラスミドベク
ターｐＣＲＹ３０を調製することができる。

【００２３】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えば、プラスミドベクター中に１
個所だけ存在する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。

【００２４】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記アセトヒドロキシ酸イソメ
ロレダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
（Ａ断片）をＤＮＡリガーゼで連結させることにより行
うことができる。このようにして造成されるプラスミド
ｐＣＲＹ３０に本発明の大きさが約２．１ｋｂのＡ断片
を導入した組換えプラスミドを、本発明者らはプラスミ
ドｐＣＲＹ３０−ＩＲと命名した。プラスミドｐＣＲＹ
３０−ＩＲの作成方法の詳細については、後記実施例で
説明する。

【００２５】かくして造成されるアセトヒドロキシ酸イ
ソメロレダクターゼをコードする遺伝子を含むコリネ型
細菌内で複製増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導
入して該微生物の培養物を用いてＬ−イソロイシン及び
Ｌ−バリンを安定に効率よく生産することが可能とな
る。本発明によるプラスミドで形質転換しうる宿主微生
物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−Ａ
Ｂ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
９）等が挙げられる。

【００２６】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４蘭参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株とし
たＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さら
に、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。

【００２７】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同Ａ
ＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブレビバク
テリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０；ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）Ａ
ＴＣＣ１３８６９；コリネバクテリウム・グルタミカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。

【００２８】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
〔Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．，３６，ｐ．３６１〜４０５（１
９７２）参照〕。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的
に除去する方法の一例を示せば次のとおりである。

【００２９】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約２４時間約３５℃で培
養する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で
約２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラ
スミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去
されている株を選択する。この操作によりプラスミドｐ
ＢＹ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来菌株が得られる。

【００３０】上記宿主微生物の前記組換えプラスミドに
よる形質転換は、それ自体既知の方法、例えばＣａｌｖ
ｉｎ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａｎａｗａｌｔ，Ｐ．Ｃ．，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１
７０，２７９６（１９８８）；Ｉｔｏ，Ｋ．，Ｎｉｓｈ
ｉｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｚａｋｉ．Ｋ．，Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，５２，２９３（１９８８）等の文献に記
載の方法により、例えば宿主微生物にパルス波を通電
〔Ｓａｔｏｈ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，５，１５９（１９９０）参照〕することにより行う
ことができる。

【００３１】上記の方法で形質転換して得られるアセト
ヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ産生能を有するコリ
ネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３由来株の培養方法を以下に述べる。培養は炭素
源、窒素源、無機塩等を含む通常の栄養培地で行うこと
ができ、炭素源としては、例えばグルコース、エタノー
ル、メタノール、廃糖蜜等が、そして窒素源としては、
例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは
混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリ
ン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ
酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養源を培地に添加
することができる。

【００３２】培養は、通常、通気撹拌、振盪等の好気条
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％である。また、培養期
間は通常１〜７日間とすることができ、最高期間は３日
間である。

【００３３】このようにして得られる培養物から各々菌
体を集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、Ｌ−イソロ
イシン又はＬ−バリン生成反応に使用することができ
る。Ｌ−イソロイシン又はＬ−バリン生成反応において
は、これらの菌体をそのまま用いることができ、あるい
は超音波処理等を加えた菌体破砕物又はそれから分離さ
れた粗酵素もしくは精製酵素として、あるいは適当な担
体に固定化して用いることができる。以上に述べた如き
菌体の破砕物、粗もしくは精製酵素、固定化物等を本明
細書ではまとめて「菌体処理物」という。

【００３４】しかして本発明に従えば、上記培養菌体又
は菌体処理物の存在下に、少くとも炭素源と窒素源を含
有する水性反応液中にて酵素反応させてＬ−イソロイシ
ン又はＬ−バリンを生成せしめることを特徴とするＬ−
イソロイシン又はＬ−バリンの製造法が提供される。上
記の酵素反応は、通常約２０〜約４０℃、好ましくは約
２５〜約３５℃の範囲内で行うことができる。

【００３５】水性反応液中に添加することができる炭素
源、窒素源は、前記した通常の栄養培地に用いられるも
のを挙げることができる。また該水性反応液には、前記
した通常の栄養培地に用いることができる無機塩等を添
加することもできる。特に、本発明のプラスミドで形質
転換しうる宿主微生物がビオチン要求性のコリネ型細菌
である場合は、上記の如く調製された培養菌体またはそ
の固定化物と、少なくとも炭素源と窒素源とを含有しか
つビオチンを含有しない水性反応液中で、酵素反応させ
てＬ−イソロイシン又はＬ−バリンを生成せしめるのが
好適である。この場合、ビオチン要求性のコリネ型細菌
はビオチンを実質的に含有しない水性反応液中では菌体
増殖せずに、該菌体の保有する代謝系において炭素源及
び窒素源がエネルギー共役を伴う酵素反応を介して反応
せしめられ、Ｌ−イソロイシン又はＬ−バリンが製造さ
れる。

【００３６】しかして本発明に従えば、（１）上記培養
菌体又はその固定化物の存在下に、少くともエタノール
と酪酸誘導体をビオチンを含有しない水性反応液中にて
酵素反応させてＬ−イソロイシンを生成せしめることを
特徴とするＬ−イソロイシンの製造法、（２）上記培養
菌体又はその固定化物の存在下に、少くともグルコース
を含有する水性反応液中にて酵素反応させてＬ−バリン
を生成せしめることを特徴とするＬ−バリンの製造法が
提供される。

【００３７】上記した、本発明に従う水性反応液は、ビ
オチンを実質的に含有しない水あるいはリン酸またはト
リス塩酸等の緩衝液であることもできるが、好ましくは
ビオチンを含有しない合成培地が用いられる。この合成
培地には、酵母エキス、ペプトン、コースティープリカ
ー等の天然栄養物質を含まない化学構造が既知の無機窒
素源及び／又は無機物を含有する水溶液が包含される。
本発明において用いうる合成培地の無機窒素源として
は、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等を例
示することができ、また、無機物としては、例えば、リ
ン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等を例示することがで
きる。これらの無機窒素源および無機塩はそれぞれ、単
独でまたは２種以上混合して用いることができる。

【００３８】本発明に従うＬ−イソロイシン又はＬ−バ
リンの製造法において用いられる合成培地の一例を示す
と次のとおりである：（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ２ｇ／ｌ；Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ／ｌ；Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ／ｌ；
ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ₄ ・７
Ｈ₂ Ｏ ２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ２０
ｐｐｍ含有するｐＨ７．６の水溶液。

【００３９】本発明のＬ−イソロイシン又はＬ−バリン
製造法において使用される前記のようにして調製された
培養菌体又は菌体処理物の使用量は、特に制限されるも
のではないが、培地の容量を基準にして一般に１〜５０
％（ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは２〜２０％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ）の範囲内の濃度で使用することができる。上記し
たとおりの組成を有する水性反応液中における培養菌体
又は菌体処理物を用いる酵素反応は、一般に約２０〜約
５０℃、好ましくは約３０〜約４０℃の温度で通常約１
０〜約７２時間行うことができる。

【００４０】本発明に従うＬ−イソロイシンの製造法に
おいては、上記したビオチンを含有しない水性反応液中
にて、エタノールと酪酸誘導体と窒素源とが酵素反応せ
しめられＬ−イソロイシンが生成される。

【００４１】Ｌ−イソロイシン製造に際しての、水性反
応液中のエタノールの濃度は通常０．５〜４０容量％、
好ましくは１〜２０容量％の範囲内とすることができ
る。水性反応液中の酪酸誘導体としては、例えば、ＤＬ
−α−アミノ酪酸、α−ケト酪酸又はそれらの塩類を挙
げることができる。水性反応液中の酪酸誘導体の濃度
は、通常０．１〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度範囲で
使用するのが適当であるが、特にα−ケト酪酸又はその
塩を使用する場合は、反応液中の濃度が常に０．３％
（ｗｔ／ｖｏｌ）を越えずに添加すると、副生物である
ノルバリンの生成を低減し、Ｌ−イソロイシンの収率も
向上させうることができる。上記した反応基質の添加
は、上記濃度を越えないかぎり連続的に行ってもよく、
あるいは間欠的に行ってもよい。反応に使用されうる上
記した酪酸誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム、
カリウム等のアルカリ金属塩類；カルシウム等のアルカ
リ土類金属塩類；アンモニウム塩等が挙げられ、それら
の中でもナトリウム塩が好適である。

【００４２】また、本発明に従うＬ−バリンの製造法に
おいては、上記したビオチンを含有しない水性反応液中
にて、グルコースと窒素源とが酵素反応せしめられＬ−
バリンが生成される。Ｌ−バリン製造に際しての、水性
反応液中のグルコース濃度は、通常０．１〜５．０重量
％の範囲内とすることができる。グルコースは反応中上
記範囲内の濃度に維持されるように連続的または間欠的
に水性反応液に添加するのが好ましい。

【００４３】かくして製造されるＬ−イソロイシン又は
Ｌ−バリンの水性反応液からの分離、精製は、それ自体
既知の通常用いられる方法に従って行なうことができ、
例えば、イオン交換樹脂処理法、晶析法等の方法を適宜
組合せて行うことができる。

【００４４】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のアセ
トヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化

【００４５】（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＨＮ₄ ）₂ ＳＯ
₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ₄ ４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．
５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チア
ミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１リット
ル〕１リットルに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後
期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ
／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−
２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼ
Ｋを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加
し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナト
リウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０
℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフ
ェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間
ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×
ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、
酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２
倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０
％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡ
に１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以
後の実験に用いた。

【００４６】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＢｇｌ II ５０ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１時
間反応させ完全分解した。このＥｃｏＲＩ及びＢｇｌ I
I 分解ＤＮＡに平滑末端処理後、クローニングベクター
ｐＫＫ２２３−３（ファルマシアより市販）を制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断し平滑末端処理したものを混合し、５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオス
レイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 及
びＴ₄ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各
成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。

【００４７】（Ｃ）アセトヒドロキシ酸イソメロレダク
ターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドの選択 上記遺伝子の選択は、前記大腸菌変異株エシェリヒア・
コリＭＥ８３１５を用いて行った。上記（Ｂ）項で得ら
れたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，５３，１５９，１９７０）により前記エシェリヒア
・コリＭＥ８３１５を形質転換し、アンピシリン５０ｍ
ｇを含む選択培地〔Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ２
ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ
０．１ｇ、グルコース２０ｇ、ロイシン２０ｍｇ、チア
ミン１ｍｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶解〕
に塗抹した。

【００４８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３の長
さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約２．１ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したと
きの、長さ約２．１ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部
位数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおり
であった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１
に示す。

【００４９】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。

【００５０】

【表２】 表２ プラスミドｐＫＫ２２３−ＩＲ 制限酵素 認識部位数 切断片の大きさ（ｋｂ） ＳａｌＩ ４ ４．０５ １．２ ０．９５ ０．５ ＰｖｕＩＩ ２ ４．２ ２．５ ＥｃｏＲＶ １ ６．７

【００５１】上記の制限酵素により特徴づけられるプラ
スミドをｐＫＫ２２３−ＩＲと命名した。以上によりア
セトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺
伝子を含む大きさが約２．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂｇｌ
II −ＥｃｏＲＩ断片）を得ることができた。

【００５２】実施例２ アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする
遺伝子の塩基配列の決定 実施例１の（Ｄ）項で得られたアセトヒドロキシ酸イソ
メロレダクターゼをコードする遺伝子を含む長さ約２．
１ｋｂのＤＮＡ断片について、その塩基配列をプラスミ
ドｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌ
クレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅ
ｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｈｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４，５４６３，１９７７）により図２に示した戦略図
に従って決定した。

【００５３】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、アセトヒドロキシ酸イソメロレダク
ターゼをコードする遺伝子は、後記配列表の配列番号：
１に示す塩基配列を有する３３８個のアミノ酸をコード
する１０１４の塩基対より構成されていた。

【００５４】実施例３ コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターｐＣ
ＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＶＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。

【００５５】半合成培地Ａ培地〔尿素２ｇ、（ＮＨ₄ ）
₂ ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ
₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸
留水１リットル〕１リットルに、ブレビバクテリウム・
スタチオニスＩＦＯ１２１４４を対数増殖期後期まで培
養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの
濃度にリゾチームを含む緩衝液〔２５ｍＭトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５
０ｍＭグルコース〕２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間
反応させた。反応液にアルカリ−ＳＤＳ液〔０．２Ｎ
ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加し、
緩やかに混和して室温にて１５分間静置した。次に、こ
の反応液に酢酸カリウム溶液〔５Ｍ酢酸カリウム溶液６
０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混合
液〕３０ｍｌを添加し、充分混和してから氷水中に１５
分間静置した。

【００５６】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。

【００５７】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液〔トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８．０に調
製〕２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液〕１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６，０００×ｇの遠心分離を行った。

【００５８】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２倍量エタノー
ルを加え、−２０℃１時間静置した。この溶液を１５，
０００×ｇの遠心分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラ
ミスドｐＢＹ５０３を５０μｇ得た。

【００５９】 （Ｂ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０．５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。前記（Ａ）項
で調製したプラスミドｐＢＹ５０３の２μｇに制限酵素
ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３７℃で３０分間反応させ、
プラスミドＤＮＡを部分分解した。

【００６０】両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及
びＴ₄ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を
強化し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いて
エシェリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒
造製）を形質転換した。

【００６１】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１リットル、ｐ
Ｈ７．２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として
得られた。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育
してきたものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−Ｓ
ＤＳ法〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃ
ｏｌｏｎｉｎｇ”（１９８２）ｐ９０〜９１参照〕によ
り抽出した。

【００６２】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で
得られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐ
ｎＩ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉ
のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラ
スミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。

【００６３】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ−ＩＲの作成及びコリネ型細菌への
導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＫＫ２２３
−ＩＲ ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩを５ｕｎｉｔｓ用
い、３７℃で１時間反応させ分解し、平滑末端処理した
ものと、ＥｃｏＲＩリンカー（宝酒造より市販）１μｌ
を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ およびＴ₄ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成
分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃
で１５時間反応させ結合させた。

【００６４】このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ ３ｕｎ
ｉｔｓを用い３７℃で１時間反応させ分解したものと、
実施例３の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０
１μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ １ｕｎｉｔを用い、３
７℃で１時間反応させ分解したものを混合し、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およびＴ
₄ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分
の濃度は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ
結合させた。このプラスミドを用いて、前記方法に従い
前記エシェリヒア・コリＭＥ８３１５株を形質転換し、
カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地〔Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ １
ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．１ｇ、グルコース２０
ｇ、ロイシン２０ｍｇ、チアミン１ｍｇ及び寒天１６ｇ
を蒸留水１リットルに溶解〕に塗抹した。

【００６５】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ２．４ｋｂ
〔２．１ｋｂ；アセトヒドロキシ酸イソメロレダクター
ゼを含む断片、０．３ｋｂ；ｔａｃプロモーター（ｐＫ
Ｋ２２３−３由来）〕を含む断片〕の挿入ＤＮＡ断片が
認められた。

【００６６】上記の如く調製されたプラスミドＤＮＡ
を、コリネ型細菌へ形質転換した。形質転換は、電気パ
ルス法を用いて次のとおり行った。ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）
プラスミドｐＢＹ５０２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培
地で対数増殖初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニッ
ト／ｍｌになるように添加して、さらに２時間振盪培養
し、遠心分離により菌体を集め、菌体を２０ｍｌのパル
ス用溶液（２７２ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ ＫＨ
₂ ＰＯ₄ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ；ｐＨ７．４）にて洗浄
した。さらに菌体を遠心分離して集め、５ｍｌのパルス
用溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞と、前記で得られ
たプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌとを混合し、水中にて
２０分間静置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）
を用いて、２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パル
スを印加後氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前
記Ａ培地に移し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン
１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植
菌し３０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシ
ン耐性株より、前記実施例３（Ａ）項に記載の方法を用
いてプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表３に示す。

【００６７】

【表３】 表３ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＩＲ 制限酵素 認識部位数 切断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ ２ ８．６， ２．４ ＫｐｎＩ １ １１．０ ＢａｍＨＩ １ １１．０ ＳｍａＩ ２ ６．２， ４．８ ＳａｃＩ ２ ８．４， ２．６ ＸｈｏＩ １ １１．０

【００６８】上記制限酵素により特徴づけられるプラス
ミドをｐＣＲＹ３０−ＩＲと命名した。このプラスミド
ｐＣＲＹ３０−ＩＲの制限酵素切断点地図を図３に示
す。なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ＩＲにより形質転
換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Ｉ
Ｒは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生
命工学工業技術研究所に、平成５年３月４日付で受託番
号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３５０９として寄託されている。

【００６９】実施例５ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＩＲの安定性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＩＲを植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養
を行った後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌを５
００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間
滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０ｃｅｌｌｓの割合に
なるように植継し、同じく３０℃にて２４時間振盪培養
を行った。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄後、カ
ナマイシンを１５μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ培地及
び無添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一定量塗
抹し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウントし
た。

【００７０】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認し
た。

【００７１】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1017 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 菌株名：MJ233 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1-1017 特徴を決定した方法：E

【００７２】 配列 ATG GCT ATT GAA CTG CTT TAT GAT GCT GAC GCT GAC CTC TCC TTG ATC 48 Met Ala Ile Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Asp Ala Asp Leu Ser Leu Ile 1 5 10 15 CAG GGC CGT AAG GTT GCC ATC GTT GGC TAC GGC TCC CAG GGC CAC GCA 96 Gln Gly Arg Lys Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Ser Gln Gly His Ala 20 25 30 CAC TCC CAG AAC CTC CGC GAT TCT GGC GTT GAG GTT GTC ATT GGT CTG 144 His Ser Gln Asn Leu Arg Asp Ser Gly Val Glu Val Val Ile Gly Leu 35 40 45 CGC GAG GGC TCC AAG TCC GCA GAG AAG GCA AAG GAA GCA GGC TTC GAA 192 Arg Glu Gly Ser Lys Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Ala Gly Phe Glu 50 55 60 GTC AAG ACC ACC GCT GAG GCT GCA GCT TGG GCT GAC GTC ATC ATG CTC 240 Val Lys Thr Thr Ala Glu Ala Ala Ala Trp Ala Asp Val Ile Met Leu 65 70 75 80 CTG GCT CCA GAC ACC TCC CAG GCA GAA ATC TTC ACC AAC GAC ATC GAG 288 Leu Ala Pro Asp Thr Ser Gln Ala Glu Ile Phe Thr Asn Asp Ile Glu 85 90 95 CCA AAC CTG AAC GCA GGC GAC GCA CTG CTG TTC GGC CAC GGC CTG AAC 336 Pro Asn Leu Asn Ala Gly Asp Ala Leu Leu Phe Gly His Gly Leu Asn 100 105 110 ATT CAC TTC GAC CTG ATC AAG CCA GCT GAC GAC ATC ATC GTT GGC ATG 384 Ile His Phe Asp Leu Ile Lys Pro Ala Asp Asp Ile Ile Val Gly Met 115 120 125 GTT GCG CCA AAG GGC CCA GGC CAC TTG GTT CGC CGT CAG TTC GTT GAT 432 Val Ala Pro Lys Gly Pro Gly His Leu Val Arg Arg Gln Phe Val Asp 130 135 140 GGC AAG GGT GTT CCT TGC CTC ATC GCA GTC GAC CAG GAC CCA ACC GGA 480 Gly Lys Gly Val Pro Cys Leu Ile Ala Val Asp Gln Asp Pro Thr Gly 145 150 155 160 ACC GCA CAG GCT CTG ACC CTG TCC TAC GCA GCA GCA ATC GGT GGC GCA 528 Thr Ala Gln Ala Leu Thr Leu Ser Tyr Ala Ala Ala Ile Gly Gly Ala 165 170 175 CGC GCA GGC GTT ATC CCA ACC ACC TTC GAA GCT GAG ACC GTC ACC GAC 576 Arg Ala Gly Val Ile Pro Thr Thr Phe Glu Ala Glu Thr Val Thr Asp 180 185 190 CTC TTC GGC GAG CAG GCT GTT CTC TGC GGT GGC ACC GAG GAA CTG GTC 624 Leu Phe Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Thr Glu Glu Leu Val 195 200 205 AAG GTT GGC TTC GAG GTT CTC ACC GAA GCT GGC TAC GAG CCA GAG ATG 672 Lys Val Gly Phe Glu Val Leu Thr Glu Ala Gly Tyr Glu Pro Glu Met 210 215 220 GCA TAC TTC GAG GTT CTT CAC GAG CTC AAG CTC ATC GTT GAC CTC ATG 720 Ala Tyr Phe Glu Val Leu His Glu Leu Lys Leu Ile Val Asp Leu Met 225 230 235 240 TTC GAA GGT GGC ATC AGC AAC ATG AAC TAC TCT GTT TCT GAC ACC GCT 768 Phe Glu Gly Gly Ile Ser Asn Met Asn Tyr Ser Val Ser Asp Thr Ala 245 250 255 GAG TTC GGT GGC TAC CTC TCC GGC CCA CGC GTC ATC GAT GCA GAC ACC 816 Glu Phe Gly Gly Tyr Leu Ser Gly Pro Arg Val Ile Asp Ala Asp Thr 260 265 270 AAG TCC CGC ATG AAG GAC ATC CTG ACC GAT ATC CAG GAC GGC ACC TTC 864 Lys Ser Arg Met Lys Asp Ile Leu Thr Asp Ile Gln Asp Gly Thr Phe 275 280 285 ACC AAG CGC CTC ATC GCA AAC GTT GAG AAC GGC AAC ACC GAG CTT GAG 912 Thr Lys Arg Leu Ile Ala Asn Val Glu Asn Gly Asn Thr Glu Leu Glu 290 295 300 GGT CTT CGT GCT TCC TAC AAC AAC CAC CCA ATC GAG GAG ACC GGC GCT 960 Gly Leu Arg Ala Ser Tyr Asn Asn His Pro Ile Glu Glu Thr Gly Ala 305 310 315 320 AAG CTC CGC GAC CTC ATG AGC TGG GTC AAG GTT GAC GCT CGC GCA GAA 1008 Lys Leu Arg Asp Leu Met Ser Trp Val Lys Val Asp Ala Arg Ala Glu 325 330 335 ACC GCT TAA 1017 Thr Ala

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクタ
ーゼをコードする遺伝子を含む大きさが約２．１ｋｂの
ＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図。

【図２】大きさが約２．１ｋｂの本発明のＤＮＡ断片の
塩基配列決定のための戦略図。

【図３】本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ＩＲの制限
酵素切断点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネ型細菌由来のアセヒドロキシ酸イ
   ソメロレダクターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
   ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
   ｍ）ＭＪ−２３３である請求項１記載の遺伝子ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 次のＤＮＡ塩基配列 ATGGCTATTG AACTGCTTTA TGATGCTGAC GCTGACCTCT CCTTGATCCA GGGCCGTAAG 60 GTTGCCATCG TTGGCTACGG CTCCCAGGGC CACGCACACT CCCAGAACCT CCGCGATTCT 120 GGCGTTGAGG TTGTCATTGG TCTGCGCGAG GGCTCCAAGT CCGCAGAGAA GGCAAAGGAA 180 GCAGGCTTCG AAGTCAAGAC CACCGCTGAG GCTGCAGCTT GGGCTGACGT CATCATGCTC 240 CTGGCTCCAG ACACCTCCCA GGCAGAAATC TTCACCAACG ACATCGAGCC AAACCTGAAC 300 GCAGGCGACG CACTGCTGTT CGGCCACGGC CTGAACATTC ACTTCGACCT GATCAAGCCA 360 GCTGACGACA TCATCGTTGG CATGGTTGCG CCAAAGGGCC CAGGCCACTT GGTTCGCCGT 420 CAGTTCGTTG ATGGCAAGGG TGTTCCTTGC CTCATCGCAG TCGACCAGGA CCCAACCGGA 480 ACCGCACAGG CTCTGACCCT GTCCTACGCA GCAGCAATCG GTGGCGCACG CGCAGGCGTT 540 ATCCCAACCA CCTTCGAAGC TGAGACCGTC ACCGACCTCT TCGGCGAGCA GGCTGTTCTC 600 TGCGGTGGCA CCGAGGAACT GGTCAAGGTT GGCTTCGAGG TTCTCACCGA AGCTGGCTAC 660 GAGCCAGAGA TGGCATACTT CGAGGTTCTT CACGAGCTCA AGCTCATCGT TGACCTCATG 720 TTCGAAGGTG GCATCAGCAA CATGAACTAC TCTGTTTCTG ACACCGCTGA GTTCGGTGGC 780 TACCTCTCCG GCCCACGCGT CATCGATGCA GACACCAAGT CCCGCATGAA GGACATCCTG 840 ACCGATATCC AGGACGGCAC CTTCACCAAG CGCCTCATCG CAAACGTTGA GAACGGCAAC 900 ACCGAGCTTG AGGGTCTTCG TGCTTCCTAC AACAACCACC CAATCGAGGA GACCGGCGCT 960 AAGCTCCGCG ACCTCATGAG CTGGGTCAAG GTTGACGCTC GCGCAGAAAC CGCTTAA 1017 で表されるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを
   コードする遺伝子ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 次のアミノ酸配列 Met Ala Ile Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Asp Ala Asp Leu Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gln Gly Arg Lys Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Ser Gln Gly His Ala 20 25 30 His Ser Gln Asn Leu Arg Asp Ser Gly Val Glu Val Val Ile Gly Leu 35 40 45 Arg Glu Gly Ser Lys Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Ala Gly Phe Glu 50 55 60 Val Lys Thr Thr Ala Glu Ala Ala Ala Trp Ala Asp Val Ile Met Leu 65 70 75 80 Leu Ala Pro Asp Thr Ser Gln Ala Glu Ile Phe Thr Asn Asp Ile Glu 85 90 95 Pro Asn Leu Asn Ala Gly Asp Ala Leu Leu Phe Gly His Gly Leu Asn 100 105 110 Ile His Phe Asp Leu Ile Lys Pro Ala Asp Asp Ile Ile Val Gly Met 115 120 125 Val Ala Pro Lys Gly Pro Gly His Leu Val Arg Arg Gln Phe Val Asp 130 135 140 Gly Lys Gly Val Pro Cys Leu Ile Ala Val Asp Gln Asp Pro Thr Gly 145 150 155 160 Thr Ala Gln Ala Leu Thr Leu Ser Tyr Ala Ala Ala Ile Gly Gly Ala 165 170 175 Arg Ala Gly Val Ile Pro Thr Thr Phe Glu Ala Glu Thr Val Thr Asp 180 185 190 Leu Phe Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Thr Glu Glu Leu Val 195 200 205 Lys Val Gly Phe Glu Val Leu Thr Glu Ala Gly Tyr Glu Pro Glu Met 210 215 220 Ala Tyr Phe Glu Val Leu His Glu Leu Lys Leu Ile Val Asp Leu Met 225 230 235 240 Phe Glu Gly Gly Ile Ser Asn Met Asn Tyr Ser Val Ser Asp Thr Ala 245 250 255 Glu Phe Gly Gly Tyr Leu Ser Gly Pro Arg Val Ile Asp Ala Asp Thr 260 265 270 Lys Ser Arg Met Lys Asp Ile Leu Thr Asp Ile Gln Asp Gly Thr Phe 275 280 285 Thr Lys Arg Leu Ile Ala Asn Val Glu Asn Gly Asn Thr Glu Leu Glu 290 295 300 Gly Leu Arg Ala Ser Tyr Asn Asn His Pro Ile Glu Glu Thr Gly Ala 305 310 315 320 Lys Leu Arg Asp Leu Met Ser Trp Val Lys Val Asp Ala Arg Ala Glu 325 330 335 Thr Ala で表されるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを
   コードする遺伝子ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡが導入された組換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
   ＤＮＡと、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子
   を含むＤＮＡを保有する組換えプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えプラスミドで形質
   転換されたコリネ型細菌。