CN111394325A - 一种耐热乙酰乳酸异构还原酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种耐热乙酰乳酸异构还原酶。本发明还涉及编码该酶的多肽序列；以及该耐热乙酰乳酸异构还原酶的制备方法。

Description

一种耐热乙酰乳酸异构还原酶
技术领域
本发明涉及一种耐热乙酰乳酸异构还原酶，该酶主要应用于生物化工领域，例如燃料乙醇或者异丁醇的生产。本发明还涉及编码该酶的多肽序列；以及该耐热乙酰乳酸异构还原酶的制备方法。
背景技术
酶是一类生物大分子催化剂，相比普通的化学催化剂作为生物催化剂的酶有着很多的突出优势：1.绿色环保：酶的催化反应条件非常温和，一般为常温常压，并且pH也在中性附近不会是极端酸性或碱性，也不需要重金属或者有机溶剂参与，无废水废气等污染物产生，由于酶本身主要是蛋白质，因此也不具备污染性。2.催化效率高：一般来说酶的催化效率比普通化学催化剂高出3到6个数量级。3.专一性好：酶的活性中心有着特殊的构型，底物只有与之匹配才能被催化，由于酶本身是手性分子，酶在催化过程中具有良好的手性选择性。
乙酰乳酸异构还原酶是支链氨基酸合成途径中的第二个酶，可将2-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基-3-异戊酸（缬氨酸和亮氨酸的前体）或2-乙酰-2-羟基丁酸酯转化为2,3-二羟基-3-甲基戊酸（异亮氨酸的前体），该转化过程非常特殊，通过一个活性中心完成两步反应，首先底物发生异构化反应，然后再被NADPH或者NADH还原后得到最终产物。由于乙酰乳酸异构还原酶特殊的催化特性，它在生物化工中有着重要的潜在应用，例如它是无细胞体系下生产乙醇或异丁醇过程中的关键酶之一。
乙酰乳酸异构还原酶可被分成两大类： I类为较短的乙酰乳酸异构还原酶，长度为~330个氨基酸，含有具有Rossmann折叠的氮端结构域和以α螺旋为主的碳端结构域，I类KARI需要来自相邻亚基的碳端结构域形成二聚体以完成活性位点。因此它们通常以二聚体的形式存在，但是它们还可以进一步组合成12聚体。例如结核分枝杆菌乙酰乳酸异构还原酶为二聚体，而铜绿假单胞菌乙酰乳酸异构还原酶为12聚体。II类乙酰乳酸异构还原酶，的氨基酸残基序列较长，大约为500个氨基酸，典型的代表有：大肠杆菌乙酰乳酸异构还原酶和植物中的乙酰乳酸异构还原酶，II类乙酰乳酸异构还原酶可以形成独立的活性中心，II乙酰乳酸异构还原酶一般以二聚体或四聚体的形式存在。
在工业过程酶作为催化剂的主要缺点之一是它们的半衰期较短且热稳定性较低，因此通过在自然界中寻找或者通过改造获得耐热的酶是酶工程领域的重要研究方向，耐热的酶不但半衰期长，而且可以让反应在较高温度下进行，从而加快反应速率。乙酰乳酸异构还原酶在生物化工领域有着重要的潜在应用价值，因此寻找耐热的乙酰乳酸异构还原酶在生物化工领域是有着重要需求的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，该序列具有乙酰乳酸异构还原酶的活性。
一方面，所述乙酰乳酸异构还原酶与SEQ ID NO:1 至少有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。
另一方面，所述乙酰乳酸异构还原酶具有良好的热稳定性，在高温反应体系中展示良好的催化活性。其中所述高温为50℃以上，例如60℃、65℃、70℃、75℃。
另一方面，所述乙酰乳酸异构还原酶是通过原核表达系统进行表达的，例如大肠杆菌表达系统。
另一方面，所述乙酰乳酸异构还原酶是通过在酶的氮端或碳端引入组氨酸标签，通过金属离子螯合色谱纯化，然后再通过分子排阻色谱纯化的。
具体实施方式
根据本发明的一个方面，通过PCR或基因合成的方式或者编码SEQ ID NO:1序列或者同源序列的基因，在引物合成或者基因合成过程中采取在引物或者合成的基因上添加组氨酸标签的序列便于后续的纯化，将其连接在相应的表达载体上，然后通过热激法或者电转的方式将其转化到原核表达系统中，然后对转化的菌株进行培养，诱导表达。通过金属离子螯合色谱对乙酰乳酸异构还原酶进行纯化，再利用分子排阻色谱对其进行进一步纯化，最后对乙酰乳酸异构还原酶进行酶学表征和热稳定性测试。
实施例1
1.载体构建
采用基因合成的方式合成SEQ ID NO:1序列对应基因序列，并在该序列末端添加6个组氨酸标签对应的序列以及终止密码子对应序列，该合成序列是针对大肠杆菌经过密码子优化后的序列，将该序列插入在pET-21a(+)载体的Nde I和Xhol中间位置，然后将构建好的质粒转入大肠杆菌DH5α中进行扩增，然后提取质粒进行测序。
2.蛋白试表达
通过热激法将构建好的乙酰乳酸异构还原酶的质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中,然后利用氨苄青霉素对转化菌株进行筛选，挑取单克隆菌株培养留种，取100微升菌液加入5mL含有100mg/L的氨苄霉素的LB培养基在37℃下培养3h，然后转入500mL的三角瓶，加入195mL含有100mg/L的氨苄霉素的LB培养基在37℃下培养至OD600到0.6，然后加入200微升1M的IPTG诱导表达8h，然后通过5000rpm离心收集细胞。
将收集的细胞中加入5ml含有200mM NaCl、200mM MgCl2、20mM TrisHCl pH8.0的缓冲液，然后用移液枪吹打使细胞分散，利用超声破碎仪破碎细胞，细胞破碎后13000转高速冷冻离心30min将上清和残渣分开，取10微升上清液加入到含1mM的乙酰乳酸、200mMNaCl、200mM MgCl2、20mM TrisHCl pH8.0、200uM的反应液中，利用分光光度计在340nm下检测吸光值变化，结果表明吸光度随时间变小，因此可以判定乙酰乳酸异构还原酶成功表达。
3. 表达条件优化
培养2升的乙酰乳酸异构还原酶达菌株至OD600为0.6，然后分成6份，分别在37℃，35℃， 30℃， 25℃， 20℃和18℃加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，分别在诱导后5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h和20h分别进行20mL取样，通过5000rmp进行离心收集细胞，然后加入5mL含有200mM NaCl、200mM MgCl2、20mM TrisHClpH8.0的缓冲液，然后用移液枪吹打使细胞分散，利用超声破碎仪破碎细胞，细胞破碎后13000转高速冷冻离心30min，取上清10微升加入到含1mM的乙酰乳酸、200mM NaCl、200mMMgCl2、20mM TrisHCl pH8.0、200uM的反应液中，利用分光光度计在340nm下检测吸光值变化，结果表明在37℃诱导表达11个小时的时候乙酰乳酸异构还原酶的活性最高，因此该条件为乙酰乳酸异构还原酶的最优表达条件。
4. 表达纯化
培养10升的乙酰乳酸异构还原酶表达菌株至OD600为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达在37℃的条件下进行诱导表达11小时，然后收集细胞，用200mL含有200mMNaCl、200mM MgCl2、20mM咪唑、20mM TrisHCl pH8.0的缓冲液对细胞重悬，然后利用高压均质机在4℃的低温条件下对细胞进行破碎，破碎过程重复三次，然后转入13000转高速冷冻离心30min取上清液分成4份分4次乙酰乳酸异构还原酶进行初步纯化，用50mL含有200mMNaCl、200mM MgCl2、20mM咪唑、20mM TrisHCl pH8.0的缓冲液对5mL镍柱进行平衡，利用上清液进行上样，然后用50mL含有200mM NaCl、200mM 、50mM咪唑、20mM TrisHCl pH8.0的缓冲液对镍柱进行冲洗，然后用10mL含有200mM NaCl、200mM MgCl2、500mM咪唑、20mMTrisHCl pH8.0的缓冲液进行洗脱，对4次初步纯化后的乙酰乳酸异构还原酶进行合并通过滤膜浓缩至20mL，利用分子排阻色谱对乙酰乳酸异构还原酶进一步纯化，最终得到450mg纯的乙酰乳酸异构还原酶。
5. 分子量测定
取5mg / mL的乙酰乳酸异构还原酶100μL上样，并在室温下以0.5mL / min的流速进行色谱分离，通过凝胶色谱配合多角光散射检测器对乙酰乳酸异构还原酶的分子量进行测定，结果显示乙酰乳酸异构还原酶的分子量为462kDa，由于该酶单聚体的分子量约为37kDa，因此可以判定该酶为12聚体。
6.酶学表征
通过在37℃下使用2-乙酰乳酸或3-羟基丙酮酸作为底物测量NADPH至NADP +在340nm的转化来监测反应。通过非线性回归方程将速率与底物浓度曲线拟合至Michaelis-Menten方程，最后计算相关的催化参数，结果表明该酶相对于2-乙酰乳酸的k cat = 2.3 ± 0.11s-1, K m = 127 ± 7 µM，相对于3-羟基丙酮酸的k cat = 11.3 ± 0.5 s-1，K m = 2.9 ± 0.2mM。
7.热稳定性测定
取1mg/mL的乙酰乳酸异构还原酶溶液，将其分装在离心管中，然后分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃以及90℃孵育30min,然后测定其相对于未孵育状态下的酶的活性，结果表明在35℃至75℃之间酶的活性始终保持在90%以上，然而在80℃的时候全部失活，因此可以推测该酶的最大耐受温度介于75℃和80℃之间。
SEQ ID NO: 1
Met Ala Ile Thr Val Tyr Tyr Asp Lys Asp Cys Asp Leu Ser Ile Ile Lys Ser Lys Lys Val Ala Met
5 10 15 20
Ile Gly Phe Gly Ser Gln Gly His Ala His Ala Glu Asn Leu Arg Asp Ser Gly Val Asp Val Val Val
25 30 35 40 45
Gly Leu Arg Lys Gly Gly Ser Ser Trp Ala Lys Ala Glu Ala Lys Gly Phe Ser Val Lys Thr Val Ala
50 55 60 65
Asp Ala Thr Lys Glu Ala Asp Val Ile Met Ile Leu Leu Pro Asp Glu Met Gln Ala Asp Val Phe Glu
70 75 80 85 90
Glu Glu Ile Lys Pro Asn Leu Glu Glu Gly Asn Val Ile Ala Phe Gly His Gly Phe Asn Ile His Tyr
95 100 105 110 115
Gly Gln Ile Lys Pro Pro Lys Gly Ile Asp Cys Ile Met Val Ala Pro Lys Ala Pro Gly His Thr Val
120 125 130 135
Arg Asn Glu Phe Val Asn Gly Gly Gly Ile Pro Asp Leu Ile Ala Ile Ala Gln Asp Ala Ser Gly Asn
140 145 150 155 160
Ala Lys Asn Ile Ala Leu Ser Tyr Ala Ser Ala Ile Gly Gly Gly Arg Thr Gly Ile Ile Glu Thr Thr Phe
165 170 175 180 185
Lys Asp Glu Thr Glu Thr Asp Leu Phe Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Ala Thr Ala Leu
190 195 200 205
Val Gln Ala Gly Phe Glu Thr Leu Val Glu Ala Gly Tyr Glu Pro Glu Met Ala Tyr Phe Glu Cys
210 215 220 225
Leu His Glu Leu Lys Leu Ile Val Asp Leu Met Tyr Gln Gly Gly Ile Ala Asp Met Arg Tyr Ser Ile
230 235 240 245 250
Ser Asn Thr Ala Glu Tyr Gly Asp Tyr Val Ser Gly Pro Arg Val Ile Asn Asp Glu Ser Lys Lys Ala
255 260 265 270 275
Met Lys Gln Ile Leu Lys Glu Ile Gln Asp Gly Arg Phe Ala Lys Asp Phe Ile Leu Glu Arg Lys Ala
280 285 290 295
Gly Tyr Thr Arg Met Asn Ala Glu Arg Ala Asn Thr Glu Arg Ser Leu Leu Glu Gln Thr Gly Lys
300 305 310 315 320
Lys Leu Arg Ala Met Met Pro Trp Ile Thr Ser Lys Lys Ile Ile Asp Lys Asp Lys Asn
325 330 335 340。

Claims (6)

1.一种包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，该序列具有乙酰乳酸异构还原酶的活性。
2.根据权利要求1所述乙酰乳酸异构还原酶与SEQ ID NO:1 至少有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。
3.根据权利要求1和2，所述乙酰乳酸异构还原酶具有良好的热稳定性，在高温反应体系中展示良好的催化活性。
4.根据权利要求3，其中所述高温为50℃以上，例如60℃、65℃、70℃、75℃。
5.根据权利要求1，所述乙酰乳酸异构还原酶是通过原核表达系统进行表达的，例如大肠杆菌表达系统。
6.所述乙酰乳酸异构还原酶是通过在酶的氮端或碳端引入组氨酸标签，通过金属离子螯合色谱纯化，然后再通过分子排阻色谱纯化的。
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