CN113817707B - 一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用，具体突变位点为：将野生型逆转录酶M‑MLV的第67位氨基酸从S突变为T，第303位氨基酸从F突变为R，第312位氨基酸从L突变为S，第432位氨基酸从L突变为G，第479位氨基酸从N突变为F，第524位氨基酸从D突变为Q。该酶是通过人工合成表达载体，利用优选的宿主细胞，经IPTG诱导表达获得。经改造后的一种重组突变型逆转录酶的活性温度为37‑65℃，逆转录效率是野生型逆转录酶的41.9倍，对常见干扰物的耐受能力明显提高。其性能明显优于野生型M‑MLV，并在与市场化M‑MLV的性能比较中显示出优势。

Description

一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程、酶工程领域，具体地说涉及一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用。
背景技术
逆转录酶是分子生物学研究和应用中广泛使用的一种工具酶。它以RNA为模板合成DNA，是进行RNA分析和检测的重要手段，在基因表达分析、基因功能研究、病原体检测、遗传病筛查等诸多领域均有广泛的使用。
莫罗尼鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia Virus, M-MLV）逆转录酶是目前常用的逆转录酶之一，该酶是一条多肽链，包含N端聚合结构域与C端RNase H结构域。但是该酶在应用中仍存在诸多的限制。
首先，M-MLV逆转录酶适宜反应温度为37~42℃，过低或过高的反应温度均会使其反应效率显著下降或失去活性。RNA逆转录合成cDNA程序中最大的挑战在于RNA双股互补结构复杂，在相对低温时RNA会形成二级结构，这种二级结构会影响转录合成cDNA的效率。一般来说，可以通过提高RNA逆转录反应温度来降低RNA二级结构的产生。然而，普通M-MLV难以在高于55℃的温度下良好地工作。此外，较低的温度耐受也限制了它与交叉引物恒温扩增等核酸扩增技术的整合。
其次，普通 M-MLV的逆转录效率仍不理想，难以满足如快速核酸检测等应用的需求。如新型冠状病毒的核酸检测对检测时间要求极其严格，普通M-MLV的转录效率较低，从而影响检测效果。
最后，逆转录酶的实际应用中，往往会遇到样本中含有的干扰物质影响，降低其cDNA的合成效率。普通M-MLV对诸如乙醇、肝素、胍盐等常见干扰物的耐受浓度较低，限制了它的应用。
因此，对普通M-MLV进行优化和改良提高其适用反应温度范围、合成效率、抗干扰性能，对于分子生物学研究和检测具有十分重大的意义，并具有广阔的市场前景。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种耐高温、抗干扰且具有高效逆转效率的新型重组逆转录酶及其及其表达基因序列；本发明还有一个目的是提供其相应的重组载体和宿主细胞；本发明还有一个面对是提供前述逆转录酶的制备方法及其在RT-PCR或恒温扩增反应上的应用。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述的重组突变型逆转录酶，包括如SEQID NO.1所示的氨基酸序列，其表达基因序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列是通过在野生型M-MLV逆转录酶（GenBank:AAC82568.2）氨基酸序列第67位、第303位、第312位、第432位、第479位和第524位进行定点突变获得，将突变型逆转录酶氨基酸序列经密码子优化获得如SEQ ID NO.2所示的表达基因序列。
本发明提供了包含前述基因序列的重组载体，其至少包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。重组载体选用包括但不限于pET-30a(+)、pET-28a、pPICZα A、pHT43、pFastBac1的任意一种作为载体，优选采用pET-30a(+)或pET-28a，其具有Nde I和Hind III双酶切位点和良好的宿主细胞兼容性及高效转录启动体系。
进一步的，本发明还提供一种宿主细胞，包含前述的重组载体，通过转化感受态细胞获得。宿主细胞选用包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、昆虫细胞的任意一种。优选大肠杆菌BL21作为宿主细胞，其在密码子优化设计下具有更高的表达量。
本发明的逆转录酶是将前述的基因序列连接至具有Nde I和Hind III双酶切位点的表达载体中获得重组载体；将所述重组载体转入感受态宿主细胞获得克隆菌株，经诱导培养、破碎、纯化后获得。
所述基因序列是将野生型逆转录酶M-MLV的氨基酸序列进行定点突变后经密码子优化获得；所述定点突变是将野生型逆转录酶M-MLV的第67位氨基酸从S突变为T，第303位氨基酸从F突变为R，第312位氨基酸从L突变为S，第432位氨基酸从L突变为G，第479位氨基酸从N突变为F，第524位氨基酸从D突变为Q。
所述诱导培养的条件为16-40℃，IPTG浓度0.2-5 mM。所述破碎工艺选自包括但不限于超声波破碎的方式，破碎离心过滤后的粗酶液选用包括但不限于镍离子亲和层析柱洗脱工艺进行纯化，收集纯化后的酶液并保存。洗脱时采用不同咪唑浓度的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，选择纯度较高的洗脱液收集酶液。
本发明获得的重组突变型逆转录酶具有高热稳定性，能够在最高65℃下进行cDNA链的合成。其逆转录的速率及对常见干扰物的耐受亦相较于野生型M-MLV有明显提高，并优于市面主流产品。
附图说明
图1是本发明实施例4各试验组逆转录反应效率的柱形图；
图2是本发明实施例6交叉引物恒温扩增荧光定量PCR的扩增曲线，横轴表示扩增循环数，纵轴表示荧光强度。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
本实施例提供的突变重组逆转录酶（M-6m）具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该序列是基于野生型莫罗尼鼠白血病病毒逆转录酶M-MLV的氨基酸序列进行定点突变（S67T，F303R，L312S，L432G，N479F，D524Q），并经密码子优化后获得其表达基因的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本实施例提供的突变重组逆转录酶的制备方法包括如下步骤：
（1）将Nde I和Hind III双酶切的载体pET-30a(+)与SEQ ID NO.2用T4 DNA连接酶连接，反应温度为16℃，过夜，获得重组载体。（2）将重组载体与大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞混合，冰浴30分钟，42℃热激60秒，冰浴5分钟，加液体LB培养基500 µl，37℃培养45分钟，涂布于含卡那霉素的平板，37℃过夜培养。
（3）挑取阳性克隆于液体培养基过夜培养，通过菌液PCR以及测序筛选阳性克隆。将筛选的阳性克隆菌株接种到液体LB培养基中37℃，200 rpm培养，当培养液OD600值达到0.6后加入IPTG至终浓度1 mM进行诱导，20℃过夜诱导。诱导结束离心收集菌体。
（4）将收集的菌体称重，以菌体湿重 : 破菌缓冲液 = 1 g : 20 ml的比例重悬菌体，采用超声波细胞粉碎机对菌悬液进行破碎，功率500 W工作2秒间隙4秒。破碎后13000rpm离心30 min，收集上清液。将上清液置于60℃温浴30 min，后13000rpm离心30 min，收集上清液，将上清液用0.22 µm滤膜过滤，获得粗酶液。
（5）将过滤后的粗酶液过镍亲和层析柱，以不同咪唑浓度的缓冲液进行杂蛋白洗涤，以及目标蛋白的洗脱。通过SDS-PAGE凝胶鉴定收集液中目的蛋白量及纯度，选择纯度较高的洗脱液进行收集。将含有目标蛋白的酶液置于30 KD的透析袋中，过夜透析。将透析袋中的酶液用0.22 µm滤膜过滤，测定浓度。
（6）测定酶活性单位浓度，具体方法为：一个活性单位U的逆转录酶是指在 37℃、10分钟内使用 poly(A)-oligo(dT) 作为模板-引物将 1 nmol 的dTTP掺入酸性可沉淀材料所需的酶量。
（7）测定活性单位浓度后的酶液，使用逆转录酶保存液稀释至200U/µl。该保存液的成分为：50 mM Tris/HCl（pH 8.5），300 mM NaCl，0.1 mM EDTA，50 v/v % Glycerol，0.1v/v % Tween 20，0.3 M 海藻糖。
实施例2
本实施例对不同突变类型逆转录酶的耐热性能进行对比测试。以人β-actin基因mRNA为模板，利用荧光定量PCR扩增人β-actin基因片段，通过检出信号的Ct值差异比较8种逆转录酶的耐热性能。包括野生型M-MLV逆转录酶（WT）、六个在野生型M-MLV基础上进行单点突变的逆转录酶Mut-67、 Mut-303、Mut-312、Mut-432、Mut-479、Mut-524（对应的突变位点分别为：S67T，F303R，L312S，L432G，N479F，D524Q）以及实施例1提供的逆转录酶（M-6m）。具体试验方法如下：
cDNA合成反应体系为:
人β-actin基因 mRNA 5µl (终浓度500 ng)
10 × RT buffer 2µl
dNTP (2.5mM) 2µl
Oligo(dT)引物 (20µM) 1µl
逆转录酶 1.5U
ddH2O 补足至20µl
按照上述体系进行逆转录反应，分别于37℃、55℃、60℃、65℃反应15分钟，然后75℃灭活5分钟。取逆转录产物按照下述体系进行荧光定量PCR检测。
β-actin引物设计如下：
FB: 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’
RB: 5’-AGGGGCCATCCATCCACAGTCTTC-3’
荧光定量PCR反应体系为：
逆转录产物 1µl
β-actin-FB (2µM) 2 µl
β-actin-RB (2µM) 2µl
2 × PCR mix 10µl
ddH2O 补足至20µl
荧光定量PCR反应程序为95℃, 3min；95℃, 15秒, 55℃, 15秒, 72℃，读取荧光信号，30个循环。实验仪器为BIO-RAD CFX96。
如表1所示，本实施例在不同温度下进行逆转录反应后，7种突变型酶组的扩增反应结果均优于野生型，表明与野生型(WT)相比突变型逆转录酶的耐热能力有一定的提升。其中M-6m突变型逆转录酶实验结果最优，在60℃时该酶对应的Ct值最小，表明M-6m突变型逆转录酶的耐热能力最强。
表1 M-MLV逆转录酶突变体耐热性测试
组别 37℃/Ct 平均值 55℃/Ct 平均值 60℃/Ct 平均值 65℃/Ct 平均值
WT 18.21 20.35 未检出 未检出
Mut-67 17.22 16.87 16.15 21.67
Mut-303 16.86 15.93 15.58 21.14
Mut-312 16.34 15.76 15.44 20.64
Mut-432 18.05 17.66 17.11 21.53
Mut-479 17.64 17.19 16.42 21.07
Mut-524 16.91 16.2 15.77 20.32
M-6m 15.37 14.23 13.96 18.88
实施例3
本实验就实施例1所述的突变型重组组逆转录酶与市售通用逆转录酶耐热性能进行比较。以人β-actin基因 mRNA为模板评估4种逆转录酶（野生型、对照A、对照B、M-6m）分别于37℃、55℃、60℃、65 ℃进行逆转录合成cDNA。其中，对照A为A公司生产的M-MuLV反转录酶，对照B为B公司的第四代耐热逆转录酶。然后利用荧光定量PCR扩增β-actin比较四种逆转录酶的耐热性能。
RT-PCR反应体系为:
人β-actin基因 mRNA 5µl (终浓度500 ng)
10 × RT buffer 2µl
dNTP (2.5mM) 2µl
Oligo(dT)引物 (20µM) 1µl
逆转录酶 1.5U
ddH2O 补足至20µl
按照上述体系进行逆转录反应，分别于37℃、55℃、60℃、65℃反应15分钟，然后75℃灭活5分钟。取逆转录产物依照下所述体系进行荧光定量PCR检测。
β-actin引物设计如下：
FB: 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’
RB: 5’-AGGGGCCATCCATCCACAGTCTTC-3’
荧光定量PCR反应体系为:
逆转录产物 1µl
β-actin-FB(2µM) 2µl
β-actin-RB(2µM) 2µl
2 × PCR mix 10µl
ddH2O 补足至20µl
荧光定量PCR反应程序为95℃, 3分钟；95℃, 15秒, 55℃, 15秒, 72℃, 读取荧光信号，30个循环。实验仪器为BIO-RAD CFX96。
如表2所示，不同温度条件下，野生型逆转录酶在60℃、65℃未检出产物，本发明实施例1提供的M-6m突变型逆转录酶在最高温度65℃测试时Ct值最低，说明M-6m比其他对照组耐热性更好。
表2 突变型和野生型逆转录酶耐热性测试
组别 37℃/Ct均值 55℃/Ct均值 60℃/Ct均值 65℃/Ct均值
WT 18.21 20.35 未检出 未检出
对照A 17.22 16.87 19.15 28.67
对照B 16.86 15.93 18.58 27.14
M-6m 15.53 14.47 14.31 19.08
实施例4
本实施例针对实施例1提供的突变种组逆转录酶与市售通用逆转录酶之逆转录合成效率比较。利用荧光定量PCR扩增人类GAPDH基因比较4种逆转录酶，包括野生型逆转录酶、对照A为A公司生产的M-MuLV反转录酶，对照B为B公司的第四代耐热逆转录酶、以及实施例1所提供的逆转录酶(M-6m)。
RT-PCR反应体系为:
人GAPDH基因 mRNA 5µl (终浓度500 ng)
10 × RT buffer 2µl
dNTP (2.5mM) 2µl
Oligo(dT)引物 (20µM) 1µl
逆转录酶 1.5U
ddH2O 补足至20µl
按照上述体系进行逆转录反应，分别于55℃反应15分钟，接着75℃灭活5分钟。然后取逆转录产物依照下所述体系进行荧光定量PCR检测。
人源GAPDH基因引物设计如下：FB: 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’
RB: 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’
荧光定量PCR反应体系为：
逆转录产物 1µl
GAPDH-FB (2µM) 2 µl
GAPDH-RB (2µM) 2µl
2 × PCR mix 10µl
ddH2O 补足至20µl
荧光定量PCR反应程序为95℃, 3分钟；95℃, 15秒, 5℃, 15秒, 72℃, 读取荧光信号，30个循环。实验仪器为BIO-RAD CFX96。
以野生型逆转录酶扩增效率100%作为对照，计算其他逆转录酶的反应效率，计算公式如下：
逆转录酶反应效率 = 100% × 2(A-B)
其中，A为野生型逆转录酶Ct值，B为对照组逆转录酶Ct值。
如图1所示, 本实施例实验结果显示，在55℃反应后，野生型逆转录酶与他公司产品酶对GAPDH扩增效率明显降低，M-6m逆转录酶扩增效率是野生型逆转录酶的41.9倍，且明显比其他组别逆转录酶扩增效率高。
实施例5
本实施例对不同逆转录酶的抗干扰能力进行比较，干扰物耐受试验的方法如下：
在逆转录反应体系中外加干扰物，利用逆转录所得cDNA通过荧光定量PCR扩增β-actin，所得Ct数值经计算得出各逆转录酶对抗干扰物的半抑制浓度（IC 50），进一步得到各逆转录酶对抗干扰物的能力。
RT-PCR反应体系为:
人β-actin基因 mRNA 5µl (终浓度500 ng)
10 × RT buffer 2µl
dNTP (2.5mM) 2µl
Oligo(dT)引物 (20µM) 1µl
逆转录酶 1.5U
干扰物 1-5µl
ddH2O 补足至20µl
按照上述体系进行逆转录反应，于37℃反应15分钟，然后75℃灭活5分钟。取逆转录产物进行荧光定量PCR检测。
荧光定量PCR如下：
β-actin引物：
FB: 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’
RB: 5’-AGGGGCCATCCATCCACAGTCTTC-3’
荧光定量PCR反应体系为：
逆转录产物 1µl
β-actin-FB (2µM) 2 µl
β-actin-RB (2µM) 2µl
2 × PCR mix 10µl
ddH2O 补足至20µl
荧光定量PCR反应程序为95℃, 3分钟；95℃, 15秒, 5℃, 15秒, 72℃，读取荧光信号，30个循环。实验仪器为BIO-RAD CFX96。
如表3所示，实施例1提供的M-6m突变型逆转录酶对不同干扰物的耐受能力(IC50)优于野生型逆转录酶与其他市售通用逆转录酶。
表3 逆转录酶对不同干扰物的耐受反应
Figure 426597DEST_PATH_IMAGE001
实施例6
本实施例验证各逆转录合酶应用在交叉引物恒温扩增(CPA)的效率，将市售通用逆转录酶与实施例1提供的逆转录酶进行比较，利用恒温扩增检测人源β-actin基因，测试包括实施例1提供的逆转录酶结合CPA扩增体系（M-6m），对照组为：野生型逆转录酶结合CPA扩增体系、A公司生产的M-MuLV反转录酶CPA扩增体系（对照A）、翌圣生物生产的第四代耐热逆转录酶CPA扩增体系（对照B）。
CPA反应试验以固定拷贝数(1000 拷贝/测试)的RNA为模板。
CPA 人源β-actin 基因引物：
正向外围引物FB: 5’-AGTACCCCATCGAGCACG-3’
反向外围引物RB: 5’-AGCCTGGATAGCAACGTACA-3’
正向交叉扩增引物CPF: 5’-GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA-3’
反向交叉扩增引物CPR: 5’-CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC-3’
增强引物IP1: 5’-GAGTGTGGGTGTTCCCTTTGTACGGGCCCG-3’
检测探针IP2: 5’-(FAM)-GCGTCGGCCTACCCTCGTCCTAACACGGGAGCCTGCACTGACCCGACGC-(BHQ1)-3’
CPA反应体系如下：
RNA 5µl
β-actin-FB (20µM) 0.4µl
β-actin-RB (20µM) 0.4µl
β-actin-CPF (20µM) 2µl
β-actin-CPR (20µM) 2µl
β-actin-IP1 (20µM) 1.5µl
β-actin-IP2 (20µM) 0.7µl
M-MLV酶 1.5U
CPA-MIX 12µl
ddH2O 补足至40µl
将四种逆转录酶样品按上述体系进行荧光扩增反应，反应条件为58℃，每个循环反应48秒，共60个循环。实验仪器为BIO-RAD CFX96。
如图2所示，M-6m逆转录酶对应曲线I，对照A对应曲线III，对照B对应曲线II，野生型对应曲线IV。本实施例CPA实验荧光定量结果显示M-6m逆转录酶在14个循环左右后即检测到扩增产物，对β-actin扩增效果明显比其他组强。
本发明通过定点突变的方式获得了耐高温、高逆转录效率的突变重组逆转录酶，并能实际应用到临床检测上。使用本发明提供的M-6m逆转录酶，并结合CPA恒温扩增技术，可使逆转录反应与扩增反应在同一个反应体系中完成。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
杭州优思达生物技术有限公司
<120> 一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用
<130> 23541-Y-PUMC
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu
1 5 10 15
Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala
20 25 30
Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu
35 40 45
Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr
50 55 60
Pro Met Thr Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr
85 90 95
Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val
100 105 110
Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr
115 120 125
Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln
130 135 140
Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu
145 150 155 160
His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu
165 170 175
Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe
180 185 190
Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala
195 200 205
Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp
210 215 220
Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr
225 230 235 240
Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
245 250 255
Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu
260 265 270
Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val
275 280 285
Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Arg Leu
290 295 300
Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Ser Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met
305 310 315 320
Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp
325 330 335
Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu
340 345 350
Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu
355 360 365
Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys
370 375 380
Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp
385 390 395 400
Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile
405 410 415
Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Gly
420 425 430
Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro
435 440 445
Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu
450 455 460
Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Phe Pro
465 470 475 480
Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu
485 490 495
Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln
500 505 510
Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Gln Gly Ser Ser Leu
515 520 525
Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr
530 535 540
Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg
545 550 555 560
Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys
565 570 575
Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His
580 585 590
Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly
595 600 605
Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu
610 615 620
Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys
625 630 635 640
Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala
645 650 655
Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu
660 665 670
<210> 2
<211> 2013
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acattaaata tagaggatga acacaggcta cacgaaacca gcaaagaacc ggacgtgagc 60
ctgggttcta cctggctgtc cgatttcccg caggcgtggg cggagacggg tggtatgggt 120
ttggcagttc gccaggctcc gttgatcatc ccgttgaagg ctacgtcgac cccggttagc 180
attaagcagt atccgatgac ccaggaggcg agacttggca ttaagccgca tatccaaagg 240
ctgctggacc aaggcatcct tgttccgtgc caaagccctt ggaatacccc gctattgcca 300
gtgaagaaac cgggcacgaa cgactatcgt ccggtgcaag atctccgcga agttaataaa 360
cgcgttgaag atatccaccc gactgtgccc aacccgtaca atctgctgtc tggtctgccg 420
ccaagccatc agtggtacac ggtgttggac ctcaaggacg ctttcttttg cctgcgtctt 480
cacccgacct ctcagccgct gtttgccttc gagtggcgtg atccggaaat gggtattagc 540
ggtcaactga cttggacccg cctcccgcag ggctttaaaa acagcccgac actgtttgat 600
gaagcgcttc accgtgattt ggccgacttt cgtattcagc atccggatct gattctgttg 660
cagtacgttg atgatctgct cctggctgcg acgtccgaac tggactgtca gcagggtacc 720
cgtgcgttgc ttcagaccct gggtaacctg ggttaccgcg caagcgcaaa aaaggcgcaa 780
atttgtcaaa aacaggtaaa gtacctgggt tacctgctga aggagggcca acgttggctg 840
accgaggccc gtaaagaaac ggtgatgggc cagccgaccc caaaaacccc gcgccagctg 900
cgtgagcgtc tgggcacggc aggcttctgc cgtagctgga tcccaggctt tgcggagatg 960
gccgcgccac tgtatccgct gaccaagacc ggtacgctgt tcaactgggg tccggaccaa 1020
caaaaagcgt accaagagat taaacaggcg ttgttgaccg ctccggcgtt gggattaccg 1080
gacctgacca agccgtttga actgttcgtg gatgagaaac aaggctacgc taaaggcgtg 1140
ctgactcaga agctgggtcc gtggcgtcgt ccagttgcat atctgtccaa aaagctggac 1200
cctgtcgcgg cgggctggcc tccatgccta cgcatggtcg ctgctatagc agttctgacc 1260
aaggacgctg gcaaactgac gatgggccag ccgggtgtta tcttggcgcc gcatgcagtt 1320
gaagcgctgg tcaaacaacc gccggaccgt tggctgagta atgcacgtat gacccattat 1380
caggccctgc tcctggatac cgatcgagtt cagtttggtc cggtcgtggc gctcttcccg 1440
gcaaccctgc tgccgttacc ggaggaaggt ttgcaacata attgtctgga catcttagct 1500
gaagcgcacg gcacccgtcc ggatttgacc gatcagccgc tgcctgacgc cgaccacacc 1560
tggtacactc aaggttctag cctgttgcaa gagggccaac gtaaggcggg ggctgctgtg 1620
accaccgaaa ctgaggtcat ctgggcgaag gcgctgccgg caggcacctc agcacagcgc 1680
gcggagctga tcgcgctgac ccaggcgcta aaaatggcag aaggtaagaa gctgaacgtg 1740
tataccgaca gccgttacgc cttcgcgacc gcgcacatcc atggtgaaat ttatcgtcgc 1800
cgtggtctct taacatccga gggcaaagag atcaagaaca aggacgaaat cttagccctg 1860
ctcaaagcgc tcttcctgcc caagcgtctg agcattattc actgcccggg ccaccagaaa 1920
ggtcacagcg cagaggcgcg cggtaaccgt atggcggatc aagcggctcg caaagcggcg 1980
attaccgaga cgccggacac ctcgaccttg ttg 2013
<210> 3
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu
1 5 10 15
Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala
20 25 30
Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu
35 40 45
Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr
50 55 60
Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr
85 90 95
Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val
100 105 110
Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr
115 120 125
Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln
130 135 140
Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu
145 150 155 160
His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu
165 170 175
Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe
180 185 190
Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala
195 200 205
Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp
210 215 220
Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr
225 230 235 240
Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
245 250 255
Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu
260 265 270
Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val
275 280 285
Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe Leu
290 295 300
Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met
305 310 315 320
Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp
325 330 335
Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu
340 345 350
Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu
355 360 365
Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys
370 375 380
Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp
385 390 395 400
Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile
405 410 415
Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu
420 425 430
Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro
435 440 445
Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly
595 600 605
Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu
610 615 620
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625 630 635 640
Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala
645 650 655
Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu
660 665 670

Claims (10)

1.一种突变重组逆转录酶，所述突变重组逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述重组逆转录酶的基因序列，包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.一种重组载体，含有权利要求2所述的基因序列。
4.根据权利要求3所述的一种重组载体，其特征在于：该载体选自pET-30a(+)或pET-28a。
5.一种宿主细胞，包含权利要求3或4所述的重组载体。
6.根据权利要求5所述的一种宿主细胞，其来源于大肠杆菌BL21菌株。
7.一种突变重组逆转录酶的制备方法，其特征在于：将权利要求2所述的基因序列连接至表达载体中获得重组载体，将所述重组载体转入感受态宿主细胞获得克隆菌株，经诱导培养、破碎、纯化后获得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述基因序列是将野生型逆转录酶M-MLV的氨基酸序列进行定点突变后经密码子优化获得；
所述定点突变是将野生型逆转录酶M-MLV的第67位氨基酸从S突变为T，第303位氨基酸从F突变为R，第312位氨基酸从L突变为S，第432位氨基酸从L突变为G，第479位氨基酸从N突变为F，第524位氨基酸从D突变为Q。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述逆转录酶的N端添加组氨酸纯化标签，并以镍离子亲和层析法为纯化方法。
10.权利要求1所述的一种突变重组逆转录酶在RT-PCR或恒温扩增上的应用。
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