CN112175980B - 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法：通过酶切连接将野生型Bst DNA聚合酶大片段基因克隆到原核表达载体上，并对氨基酸D308或D520进行点突变构建突变体，并转入原核表达载体进行表达，纯化；所述野生型Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如SEQ ID NO.1所示；得到了两个突变体：D308E，D520E。结果显示：与野生型Bst DNA聚合酶大片段相比，突变型D308E和D520E Bst DNA聚合酶大片段反应速率均有提高，因此，这两种突变体有着较大的应用价值和商业价值。

Description

通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种通过定点突变提高嗜热脂肪土芽孢杆菌属(Geobacillusstearothermophilus)DNA聚合酶大片段即Bst DNA聚合酶大片段活性的方法和应用，属于分子生物学、蛋白质工程、酶工程领域。

背景技术

DNA聚合酶，又称DNA依赖的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase)，它是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶，广泛存在于原核生物和真核生物中，是基因复制的基础，是维持机体基因组稳定和完整遗传的关键。DNA聚合酶的共同特征是：①具有5’→3’聚合酶活性，此特性决定了DNA只能沿着5’→3’方向合成；②需要引物，DNA聚合酶不能催化DNA新链从头合成，只能在引物3'-OH末端开始聚合延伸子链DNA。DNA聚合酶有三种功能①聚合作用：在引物3'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令，即A与T，C与G的配对原则，逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延长中的子链DNA。这是DNA聚合酶的主要作用；②3’→5’外切酶活性(校对作用)：从3’→5’方向识别和切除不配对的子链DNA末端的核苷酸，主要功能是校对作用，保证复制过程的保真性和准确性；③5’→3’外切酶活性(切除修复作用)：从5’→3’方向水解DNA延长链前方的DNA链(即只对DNA上双链处的磷酸二酯键有切割作用)，产生5'—脱氧核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。

嗜热脂肪土芽孢杆菌属(Geobacillus stearothermophilus)DNA聚合酶，即BstDNA聚合酶，基因全长2631bp，氨基酸序列全长876aa，对应分子量为99kda，等电点为5.32。嗜热脂肪土芽孢杆菌属(Geobacillus stearothermophilus)DNA聚合酶包含三个功能：①5’→3’外切酶活性(切除修复作用)，由多肽链N端1-290个氨基酸组成，水解母链DNA分子5’端的单核苷酸；②5’-3’核酸聚合活性；③3’→5’外切酶活性；④链置换活性。多肽链中的C端291-876个氨基酸组成，执行酶的催化聚合功能，是聚合酶中最重要的部分，又称Bst DNA聚合酶大片段，发挥②、③、④功能。Bst DNA聚合酶大片段主要应用于：①二代测序(Next-generation sequencing，NGS)中文库构建过程的链等温置换反应和以DNA为模板的测序，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和AppliedBiosystems SOLID system；②环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)。Bst DNA聚合酶大片段具有抗逆性好，对非离子表面活性剂和高盐环境的耐受性高，热稳定性高，活性温度范围宽等特点。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种通过定点突变提高Bst DNA聚合酶大片段活性的方法，本发明通过氨基酸定点突变的方法将野生型Bst DNA聚合酶大片段的第308位天冬氨酸突变成谷氨酸(D308E)、第310位甘氨酸突变成异亮氨酸(G310I)、第312位缬氨酸突变成异亮氨酸(V312I)、第319位丙氨酸突变成异亮氨酸(A319I)、第520位天冬氨酸突变成谷氨酸(D520E)、第540位天冬氨酸突变成谷氨酸(D540E)，结果显示：与野生型Bst DNA聚合酶大片段相比，突变型D308E和D520E Bst DNA聚合酶大片段反应速率均有提高。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法：通过酶切连接将野生型BstDNA聚合酶大片段基因克隆到原核表达载体上，并对氨基酸D308或D520进行点突变构建突变(比如常规的RF克隆技术)，并转入原核表达载体进行表达，纯化；

所述野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码它的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的突变体为D308E(野生型Bst DNA聚合酶的第308位天冬氨酸突变成谷氨酸)或D520E(野生型Bst DNA聚合酶的第520位天冬氨酸突变成谷氨酸)；

所述突变体D308E的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，突变体D308E的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述突变体D520E的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，突变体D520E的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

具体地，获得突变体的方法为：根据野生型Bst DNA聚合酶大片段氨基酸序列特征、酶三维结构、活性位点及其作用机制的分析，选出有可能影响Bst DNA聚合酶大片段反应速率的6个氨基酸，并分别对其基因序列进行定点突变设计，野生型基因和所设计的突变基因分别克隆在大肠杆菌表达载体pET-16b载体上，酶切位点选择NdeI和XhoI，并在XhoI酶切位点后添加终止密码子。将野生型基因和设计的突变型基因序列，连同载体和酶切位点要求，委托给商业公司进行基因合成和克隆，得到含有野生型和6个突变型基因的质粒，共计7种。分别将7种质粒转入表达感受态细胞，并诱导表达目的蛋白。通过亲和层析、离子层析、分子筛等纯化方法，分别得到纯度较高的野生型和突变型的Bst DNA聚合酶大片段。检验：通过BSA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度，用SDS-PAGE法鉴定蛋白纯度，通过单碱基延伸法对野生型和突变型的DNA聚合酶大片段进行反应速率的测定。

所述通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法在提高Bst DNA聚合酶大片段活性中的应用。

一种突变体D308E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种突变体D520E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明通过氨基酸定点突变的方法将野生型Bst DNA聚合酶大片段的第308位天冬氨酸突变成谷氨酸(D308E)、第310位甘氨酸突变成异亮氨酸(G310I)、第312位缬氨酸突变成异亮氨酸(V312I)、第319位丙氨酸突变成异亮氨酸(A319I)、第520位天冬氨酸突变成谷氨酸(D520E)、第540位天冬氨酸突变成谷氨酸(D540E)，结果显示：与野生型Bst DNA聚合酶大片段相比，突变型D308E和D520E Bst DNA聚合酶大片段反应速率均有提高，因此，这两种突变体有着较大的应用价值和商业价值。

本发明是基于野生型嗜热脂肪土芽孢杆菌属(Geobacillusstearothermophilus)DNA聚合酶大片段即Bst DNA聚合酶大片段，对其基因序列进行定点突变，改变Bst DNA聚合酶大片段的一级序列(氨基酸序列)，以达到Bst DNA聚合酶大片段扩增反应速率提升的目的，以减少在相关产品中的使用量，从而降低企业成本。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：pET16B质粒的结构示意图。

图2：pET16B质粒的克隆表达区域示意图。

图3：酶表达验证结果示意图。

图4：目的酶纯度鉴定结果示意图。

图5：BSA标准曲线示意图。

图6：底物分子的结构示意图。

图7：单碱基延伸实验图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1通过定点突变提高Bst DNA聚合酶大片段活性的实验

根据野生型Bst DNA聚合酶大片段氨基酸序列特征、酶三维结构、活性位点及其作用机制的分析，选出有可能影响Bst DNA聚合酶大片段反应速率的6个氨基酸，并分别对其基因序列进行定点突变设计，野生型基因和所设计的突变基因分别克隆在大肠杆菌表达载体pET-16b质粒上，酶切位点选择NdeI和XhoI，并在XhoI酶切位点后添加终止密码子。将野生型基因和设计的突变型基因序列，连同载体和酶切位点要求，委托给商业公司进行基因合成和克隆，得到含有野生型和6个突变型基因的质粒，共计7种。

将野生型Bst DNA聚合酶大片段、6种突变型Bst DNA聚合酶大片段基因序列委托给通用生物系统(安徽)有限公司(通用生物)。pET-16b质粒信息如图1、2所示。

野生型Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如下所示(5’→3’)，如SEQ ID NO.1所示：

CATATGGAAGGGGAGAAACCGCTTGAGGAGATGGAGTTTGCCATCGTTGACGTCATTACCGAAGAGATGCTTGCCGACAAGGCAGCGCTTGTCGTTGAGGTGATGGAAGAAAACTACCACGATGCCCCGATTGTCGGAATCGCACTAGTGAACGAGCATGGGCGATTTTTTATGCGCCCGGAGACCGCGCTGGCTGATTCGCAATTTTTAGCATGGCTTGCCGATGAAACGAAGAAAAAAAGCATGTTTGACGCCAAGCGGGCAGTCGTTGCCTTAAAGTGGAAAGGAATTGAGCTTCGCGGCGTCGCCTTTGATTTATTGCTCGCTGCCTATTTGCTCAATCCGGCTCAAGATGCCGGCGATATCGCTGCGGTGGCGAAAATGAAACAATATGAAGCGGTGCGGTCGGATGAAGCGGTCTATGGCAAAGGCGTCAAGCGGTCGCTGCCGGACGAACAGACGCTTGCTGAGCATCTCGTTCGCAAAGCGGCAGCCATTTGGGCGCTTGAGCAGCCGTTTATGGACGATTTGCGGAACAACGAACAAGATCAATTATTAACGAAGCTTGAGCAGCCGCTGGCGGCGATTTTGGCTGAAATGGAATTCACTGGGGTGAACGTGGATACAAAGCGGCTTGAACAGATGGGTTCGGAGCTCGCCGAACAACTGCGTGCCATCGAGCAGCGCATTTACGAGCTAGCCGGCCAAGAGTTCAACATTAACTCACCAAAACAGCTCGGAGTCATTTTATTTGAAAAGCTGCAGCTACCGGTGCTGAAGAAGACGAAAACAGGCTATTCGACTTCGGCTGATGTGCTTGAGAAGCTTGCGCCGCATCATGAAATCGTCGAAAACATTTTGCATTACCGCCAGCTTGGCAAACTGCAATCAACGTATATTGAAGGATTGTTGAAAGTTGTGCGCCCTGATACCGGCAAAGTGCATACGATGTTCAACCAAGCGCTGACGCAAACTGGGCGGCTCAGCTCGGCCGAGCCGAACTTGCAAAACATTCCGATTCGGCTCGAAGAGGGGCGGAAAATCCGCCAAGCGTTCGTCCCGTCAGAGCCGGACTGGCTCATTTTCGCCGCCGATTACTCACAAATTGAATTGCGCGTCCTCGCCCATATCGCCGATGACGACAATCTAATTGAAGCGTTCCAACGCGATTTGGATATTCACACAAAAACGGCGATGGACATTTTCCATGTGAGCGAAGAGGAAGTCACGGCCAACATGCGCCGCCAGGCAAAGGCCGTTAACTTCGGTATCGTTTACGGAATTAGCGATTACGGATTGGCGCAAAACTTGAACATTACGCGCAAAGAAGCTGCCGAATTTATCGAACGTTACTTCGCCAGCTTTCCGGGCGTAAAGCAGTATATGGAAAACATTGTGCAAGAAGCGAAACAGAAAGGATATGTGACAACGCTGTTGCATCGGCGCCGCTATTTGCCTGATATTACAAGCCGCAATTTCAACGTCCGCAGTTTTGCAGAGCGGACGGCCATGAACACGCCAATTCAAGGAAGCGCCGCTGACATTATTAAAAAAGCGATGATTGATTTAGCGGCACGGCTGAAAGAAGAGCAGCTTCAGGCTCGTCTTTTGCTGCAAGTGCATGACGAGCTCATTTTGGAAGCGCCAAAAGAGGAAATTGAGCGATTATGTGAGCTTGTTCCGGAAGTGATGGAGCAGGCCGTTACGCTCCGCGTGCCGCTGAAAGTCGACTACCATTACGGCCCAACATGGTATGATGCCAAATAAGGATCC。

突变型D308E Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如下所示(5’→3’)，如SEQ IDNO.2所示：

突变型G310I Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如下所示(5’→3’)：

突变型V312I Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如下所示(5’→3’)：

突变型A319I Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如下所示(5’→3’)：

突变型D520E Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如下所示(5’→3’)，如SEQ IDNO.3所示：

突变型D540E Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如下所示(5’→3’)：

野生型Bst DNA聚合酶大片段基因理论表达氨基酸序列如下所示(5’→3’)，如SEQID NO.4所示(注：下划线部分为质粒表达带有的氨基酸序列，其余为野生型Bst DNA聚合酶大片段氨基酸序列)：

MGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMEGEKPLEEMEFAIVDVITEEMLADKAALVVEVMEENYHDAPIVGIALVNEHGRFFMRPETALADSQFLAWLADETKKKSMFDAKRAVVALKWKGIELRGVAFDLLLAAYLLNPAQDAGDIAAVAKMKQYEAVRSDEAVYGKGVKRSLPDEQTLAEHLVRKAAAIWALEQPFMDDLRNNEQDQLLTKLEQPLAAILAEMEFTGVNVDTKRLEQMGSELAEQLRAIEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPHHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVRPDTGKVHTMFNQALTQTGRLSSAEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSEPDWLIFAADYSQIELRVLAHIADDDNLIEAFQRDLDIHTKTAMDIFHVSEEEVTANMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNITRKEAAEFIERYFASFPGVKQYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLAARLKEEQLQARLLLQVHDELILEAPKEEIERLCELVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGPTWYDAK。

突变型D308E Bst DNA聚合酶大片段基因理论表达氨基酸序列如下所示(5’→3’)，如SEQ ID NO.5所示(注：下划线为质粒表达带有的氨基酸序列，双下划线部分为突变位点，其余为野生型Bst DNA聚合酶大片段氨基酸序列)：

突变型G310I Bst DNA聚合酶大片段基因理论表达氨基酸序列如下所示(5’→3’)(注：下划线为质粒表达带有的氨基酸序列，双下划线部分为突变位点，其余为野生型BstDNA聚合酶大片段氨基酸序列)：

突变型V312I Bst DNA聚合酶大片段基因理论表达氨基酸序列如下所示(5’→3’)(注：下划线为质粒表达带有的氨基酸序列，双下划线部分为突变位点，其余为野生型BstDNA聚合酶大片段氨基酸序列)：

突变型A319I Bst DNA聚合酶大片段基因理论表达氨基酸序列如下所示(5’→3’)(注：下划线为质粒表达带有的氨基酸序列，双下划线部分为突变位点，其余为野生型BstDNA聚合酶大片段氨基酸序列)：

突变型D520E Bst DNA聚合酶大片段基因理论表达氨基酸序列如下所示(5’→3’)，如SEQ ID NO.6所示(注：下划线为质粒表达带有的氨基酸序列，双下划线部分为突变位点，其余为野生型Bst DNA聚合酶大片段氨基酸序列)：

突变型D540E Bst DNA聚合酶大片段基因理论表达氨基酸序列如下所示(5’→3’)(注：下划线为质粒表达带有的氨基酸序列，双下划线部分为突变位点，其余为野生型BstDNA聚合酶大片段氨基酸序列)：(备注：加粗为质粒表达带有的氨基酸序列，加粗加大为突变位点)：

(二)分别将7种质粒转入表达感受态细胞，并诱导表达目的蛋白。

所需培养基、试剂：LB液体培养基，LB固体培养基，100mg/ml氨苄霉素溶液，氨苄抗性平板(含100mg/ml氨苄霉素的LB固体培养基)，1M IPTG溶液。均按常规方法配制。

具体操作步骤如下：

1.质粒转化：7种质粒均按照以下步骤分别进行转化。

(1)取50ul灭菌过滤的IVD用纯化水加入装有质粒粉末的离心管中，混匀。

(2)取Rosetta(DE3)感受态细胞冰浴融化。

(3)取1ul质粒加入融化的Rosetta(DE3)感受态细胞，轻弹混匀，放在冰浴中30min。

(4)设置水浴锅温度42℃。

(5)将冰浴后含有质粒的感受态细胞放入水浴锅中热激30s。

(6)取800ul LB液体培养基入热激后的细胞中。

(7)将细胞转移至恒温振荡培养箱中37℃、150rpm孵育1h。

(8)取200ul培养后的菌液涂板在氨苄抗性平板中。

(9)倒置放入恒温培养箱，37℃静置培养过夜。

2.菌体活化：7种单克隆菌株均按照以下步骤分别进行活化。

(1)挑取1个单克隆点加入到含有100ug/ml的氨苄霉素的150ml LB液体培养基中。

(2)放入恒温振荡培养箱中37℃、200rpm，培养过夜。

3.扩大培养：7种单克隆菌液均按照以下步骤分别进行培养。

(1)取10ml过夜菌加入含有100ug/ml的1L/瓶的LB液体培养基中。

(2)放入恒温振荡培养箱中37℃、200rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～1.0之间(OD₆₀₀的检测是以LB培养基为空白对照，在紫外600nm处的吸光值)。

4.诱导表达：7种菌液均按照以下步骤分别进行诱导表达。

(1)取1ml 1M IPTG加入1L/瓶的菌液中。

(2)放入恒温振荡培养箱中16℃、200rpm培养16～20h。

5.离心收菌：7种菌液均按照以下步骤分别进行收菌。

(1)将诱导表达完毕的菌液，分装入离心瓶中，并用天平两两配平。

(2)离心机收菌7000rpm、15min、16℃。

6.验证目的蛋白的表达：7种蛋白均按照以下步骤分别进行验证表达。

(1)做胶：Bst DNA聚合酶大片段分子量约66Kda，采用10％分离胶加5％浓缩胶配制。按照康为世纪说明书制备SDS-PAGE蛋白胶。

(2)样品处理：

A、650ul菌液12000rpm离心1min，弃上清，用30ul Lysis buffer悬起混匀。

B、取80ul，5*loading buffer加入其中，混匀，100℃，10min加热。

C、12000rpm离心2min。

(3)10ul上样，设置140V恒压，至loading至胶底部。

(4)用康为世纪染色液加热染色，用IVD用纯化水加热脱色。结果如图3所示，6种突变型和野生型的DNA聚合酶大片段均有明显的目的条带。

(三)通过亲和层析、离子层析、分子筛等纯化方法，分别得到纯度较高的野生型和突变型的Bst DNA聚合酶大片段。

1.所需缓冲液如下：

A、Lysis buffer：150mM NaCl，30mM Tris，pH8.0。

B、Ni Elution buffer：150mM NaCl，250mM咪唑，30mM Tris，pH8.0。

C、Q-Elution buffer：500mM NaCl，30mM Tris，pH8.0。

D、2*storagse buffer：100mM KCl，20mM Tris pH7.4。

具体操作步骤如下：

2.样品处理：

(1)用200ml Lysis buffer充分溶解悬起20g菌体。

(2)用高压均质机破碎菌体。

(3)将破碎液放入60℃水浴锅中，热激。

(4)将热激后的破碎液转移至离心管中，两两配平后，用高速冷冻离心机4℃、12000rpm离心30min。

(5)弃沉淀，收集上清液，并用0.2um滤膜过滤上清液。

3.Ni柱纯化：

(1)将5ml Ni预装柱连接AKTA系统，A、B泵分别放入过滤抽气后的Lysis buffer和Ni elution buffer，并泵洗AKTA系统。

(2)用Lysis buffer平衡Ni柱。

(3)将过滤后上清液上样Ni柱。

(4)Ni Elution buffer梯度洗脱目的蛋白(2ml/min，30min，100％)。

(5)收集洗脱峰。

4.Q柱纯化：

(1)将5ml Q预装柱连接AKTA系统，A、B泵分别放入过滤抽气后的Lysis buffer和Qelution buffer，并泵洗AKTA系统。

(2)用Lysis buffer平衡Q预装柱。

(3)将Ni柱洗脱后的目的蛋白，上样Q预装柱。

(4)Q Elution buffer梯度洗脱目的蛋白(2ml/min，30min，100％)。

(5)收集洗脱峰。

5.分子筛纯化：

(1)将Superdex 200预装柱连接AKTA系统，A泵放入过滤抽气后的2*storagsebuffer，并泵洗AKTA系统。

(2)用2*storagse buffer平衡Superdex 200预装柱。

(3)将Q柱洗脱后的目的蛋白，上样Superdex 200预装柱。

(4)收集洗脱峰。

6.目的蛋白处理：将目的蛋白用膜包分别浓缩到2.4mg/ml，然后加入等体积的甘油，形成理论浓度为1.2mg/ml的成品酶。

(四)检验：通过BSA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度，用SDS-PAGE法鉴定蛋白纯度，通过单碱基延伸法对野生型和突变型的DNA聚合酶大片段进行反应速率的测定。

1.SDS-PAGE法鉴定酶纯度：

(1)按照康为世纪SDS-PAGE试剂盒说明书制作分离胶是12％、浓缩胶是5％的蛋白胶。

(2)样品处理：取20ul样品和5ul 5*loading buffer于1.5ml离心管中，100℃，加热10min后混合备用。

(3)取3ul样品上样，设置恒压140V进行电泳，待loading buffer颜色至蛋白胶底部后停止电泳。

(4)用康为世纪染色液加热染色，用IVD用纯化水加热脱色。

结果如图4所示，得到的6个突变型和野生型的Bst DNA聚合酶大片段的纯度较高。

2.BCA法鉴定酶浓度：

(1)按照康为世纪BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，配制工作液。按200ul/酶标孔将工作液分入其中。

(2)样品处理：取50ul IVD用纯化水和50ul样品混合待测(即稀释2倍)。

(3)取10ul BSA标准品和样品加入含有工作液的酶标孔中充分混匀，放入恒温培养箱中，静置30min，每点重复测试3次。

(4)酶标仪在562nm处进行紫外吸收检测。

(5)数据处理：制作BCA对照品标准曲线，得出Y＝kX±b，依照公式，样品检测值为X，计算浓度Y。结果如表1、表2、图5所示。

表1 BSA标准曲线数据

表2目的酶浓度数据

结果：6种突变型和野生型蛋白浓度均为：2.4mg/ml。

3.单碱基延伸法检测酶活性和反应速率：

(1)模板制备：引物1和引物2结合后，暴露碱基为T，延伸A底物。

引物序列如下：

引物1(5’→3’)：AGAAGCTAGTACTAATTGATGGCAACAGTGTGGCA。

引物2(5’→3’)：TGCCACACTGTTGCCATCAATTAGT。

A.将引物1和引物2分别用seq buffer稀释至100uM，按照引物1：引物2(v/v)＝4:6，混合均匀。

B.将引物混合物放置在90℃金属浴中，10min，然后2～8℃静置30min。标记浓度为40uM，待用。

(2)底物：5’末端荧光标记的核苷酸，此分子(结构如图6所示)在单独存在时无荧光信号，被DNA聚合酶识别并正确结合到模板上时，可在碱性磷酸酶作用下快速释放荧光信号(涉及和参考的专利CN 104844674 A、CN 105315698 B，且此底物由北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心黄岩谊实验室提供)。

(3)缓冲液：Seq buffer：20mM Tris-HCl，20mM KCl，20mM NH₄Cl，pH8.5。

(4)反应体系：如表3所示。

表3单碱基延伸实验体系

结果及分析：结果如图7、表4所示。

表4单碱基延伸实验数据

从反应起始10s内，单碱基A延伸所释放信号的速率对应Bst DNA聚合酶大片段的酶反应速率。从表4可看出D520E的反应速率值和野生型的Bst DNA聚合酶大片段的反应速率稍微高一些，较野生型Bst DNA聚合酶大片段活性高3.4％，可以作为后期双突变研究的备选位点。而D308E突变型Bst DNA聚合酶大片段明显大于野生型的反应速率，反应速率提高34.4％。G310I、V312I、D540E突变型Bst DNA聚合酶大片段相较于野生型的反应速率却有不同程度的减弱，甚至A319I突变型Bst DNA聚合酶大片段活性基本丧失。

结论：D520E和D308E突变是有效突变，提高了Bst DNA聚合酶大片段的反应速率。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (4)

1.一种通过定点突变提高Bst DNA聚合酶大片段活性的方法，其特征在于：通过酶切连接将野生型Bst DNA聚合酶大片段基因克隆到原核表达载体上，并根据针对如下所示氨基酸序列中的D308E或D520E点突变构建该聚合酶大片段突变体的核苷酸序列，并转入原核表达载体进行表达，纯化；其中，

突变型D308E Bst DNA聚合酶大片段氨基酸序列如下所示，双下划线部分显示第308位由氨基酸残基D突变为E：

突变型D520E Bst DNA聚合酶大片段氨基酸序列如下所示，双下划线部分显示为第520位由氨基酸残基D突变为E：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Bst DNA聚合酶大片段的突变体D308E的氨基酸序列如SEQ ID NO.5的第23位至第608位氨基酸残基所示；

所述Bst DNA聚合酶大片段的突变体D520E的氨基酸序列如SEQ ID NO.6的第23位至第608位氨基酸残基所示。

3.一种Bst DNA聚合酶大片段的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5的第23位至第608位氨基酸残基所示，其中存在D308E突变。

4.一种Bst DNA聚合酶大片段的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6的第23位至第608位氨基酸残基所示，其中存在D520E突变。

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