CN117603932A - 甲醇脱氢酶MDHBs突变体及其应用 - Google Patents

甲醇脱氢酶MDHBs突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体，采用定点饱和突变以及迭代饱和突变对野生型甲醇脱氢酶进行改造筛选得到，在数个位点中，先通过分子对接筛选得到LEU‑23、LEU‑29、LYS‑22、GLU‑69、PRO‑21、ARG‑20为定点饱和突变位点，再对有益突变位点进行迭代定点饱和突变得到最佳酶活的突变体E69Q/K22T/R20I，突变体的产量和酶活性都比野生型高。本发明的MDHBs突变体用于催化甲醇制备得到甲醛，提高了催化效率。具有广阔的工业化催化制备甲醛和/或1,3‑二羟基丙酮中的应用前景，绿色环保且工艺简单。

Description

甲醇脱氢酶MDHBs突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物化工和基因工程技术领域，涉及一种甲醇脱氢酶MDHBs突变体及其应用。
背景技术
1,3-二羟基丙酮(DHA)是一种天然存在的酮糖，具有生物可降解性，且对人体和环境无害，广泛应用于化妆品、医药、食品添加剂等领域。DHA可由CO2作为碳源，由甲醇或甲酸作中间体生物催化制得，能进一步转化为乳酸等有机化学品，是CO2生物转化为高值化学品过程中的重要中间产物，成为生物固碳的研究热点。
脱氢酶是酶法再生NADH体系中常用的酶，有研究报道来源于B.stearothermophilus的体内体外酶活均高于B.methanolicus MGA3来源的MDH酶(MetabEng.,2017,39:49-59)，故本发明以B.stearothermophilus来源的MDHBs酶作为关键酶，催化甲醇合成甲醛。近年来，Siegel JB团队(Proceedings of the NationaI Academy ofSciences.,2015，112(12)：3704-3709)改造得到的甲醛依赖型醛缩酶(FLS)能够快速催化甲醛合成DHA。但这两种酶的酶学性能欠佳，催化效果不显著，距离工业应用仍有较大差距。尤其是MDH酶作为重要的一碳化合物关键代谢酶，是甲醇催化转化的重要限速酶，酶学性能的挖掘和改造将大大提高甲醇的转化率和利用率。
发明内容
有鉴于此，故本发明提供一种嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体，以及编码突变体的基因、含有该突变体基因的重组载体，还提供该重组载体转化得到的重组基因工程菌。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
1.嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体，将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs的第69位谷氨酸突变为谷氨酰胺，第22位赖氨酸突变为苏氨酸，第20位精氨酸突变为异亮氨酸。
相比定向进化，本发明采用迭代定点饱和突变可减少一定工作量，得到有益突变。
进一步，所述的嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白片段或其突变体，如其保守性突变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白突变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。所述改变氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换，对于突变体的保守性改变，所得到的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或酶学活性，均属于本发明保护范围之列。
2.编码嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体的核苷酸序列。
3.含有编码嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体的核苷酸序列的载体或细胞。
进一步，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.表达嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体的基因工程菌。
进一步，所述基因工程菌以pET-28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
进一步，所述基因工程菌中，所述表达宿主为大肠杆菌BL21(DE3)、Top10、DH5α。
5.一种获得嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体的方法，具体的将编码突变体的基因片断连接至表达载体并转化大肠杆菌进行表达。
更具体的，将含有甲醇脱氢酶MDHBs突变体编码基因的重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，接种到含有1‰卡那霉素的LB中，在37℃、200rpm恒温摇床培养箱中培养12～16h使其活化，活化的菌液接种到含有1‰卡那霉素的LB液体培养基中，在20～40℃，200rpm恒温摇床培养箱中培养至OD600＝0.6～0.8时，添加适量IPTG至终浓度为0.1mM～1mM，30℃，200rpm恒温摇床培养箱中诱导6-24h使MDHBs酶表达。
进一步，获得嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体的方法中，还包括MDHBs粗酶液的制备。更具体的，将表达MDHBs酶的发酵液在冷冻离心机中冷冻离心后弃上清收集菌体，用等体积的PBS缓冲液悬浮菌体1～2次。随后将菌体溶于缓冲液A(100mM Tris+150mM NaCl+20mM咪唑，pH＝7.5)置于冰水浴中，用超声破碎仪超声破碎10～15min，随后在4℃下离心去掉沉淀得到粗酶液。
进一步，获得嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体的方法中，还包括MDHBs酶的纯化。更具体的，本发明采用镍柱纯化，首先将酶粗液用0.22μm过滤得到上清液。其次用缓冲液A洗脱杂蛋白，重复洗涤约10mL后，收集流出液。用缓冲液B(100mM Tris、150mM NaCl、500mM咪唑，pH＝7.5)洗脱，收集洗脱峰，得到目的蛋白。
进一步，该方法中，是以SEQ ID NO.4所示基因为模板，采用迭代饱和突变的方法进行突变，获得编码突变体的基因片段。
6.嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体在催化制备甲醛和/或1,3-二羟基丙酮中的应用，也在本发明所保护的范围中。
本发明的有益效果在于：本发明从MDH酶的晶体结构模型分析，采用定点饱和突变以及迭代饱和突变，构建了一种嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体，其氨基酸序列相比较于SEQ ID NO.1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs来说，第69位谷氨酸突变为谷氨酰胺，第22位赖氨酸突变为苏氨酸，第20位精氨酸突变为异亮氨酸。本发明的MDHBs突变体用于催化甲醇制备得到甲醛，提高其酶活和促进甲醇转化效率，进一步和甲醛依赖型醛缩酶作用可制备得到二羟基丙酮。相比较野生型甲醇脱氢酶，突变体的产量和酶活性都比野生型高。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为微凝胶稳定固碳酶催化甲醇生成二羟基丙酮的技术路线图。
图2为MDHBs、FLS转入感受态细胞后的PCR验证图。
图3为FLS酶和MDH酶的SDS-PAGE图。
图4为以甲醇分子为中心6A范围内的氨基酸残基示意图。
图5为MDH不同突变位点的SDS-PAGE蛋白图。
图6为利用高效液相检测甲醛的的生成量来检测MDH酶活。
图7为MDHBs与MDHBs-E69Q/K22T/R20I突变体的酶学性能图。(a)为不同温度下的酶活；(b)为不同pH下的酶活。
图8为不同甲醇浓度下无微凝胶-野生MDHBs和FLS催化反应、无微凝胶-突变MDHBs-E69Q/K22T/R20I酶和FLS催化反应、有微凝胶-突变MDHBs-E69Q/K22T/R20I酶和FLS催化反应的二羟基丙酮得率图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的优选实施例技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
在本发明的实施方式中，通过将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的甲醇脱氢酶(MDHBs)和甲醛依赖型醛缩酶(FLS)分别导入到宿主细胞中诱导表达、提取粗酶并纯化，构建由甲醇到二羟基丙酮(DHA)的体外酶催化途径。此代谢途径包括两步酶催化反应：(1)MDHBs酶催化甲醇、辅酶因子NAD+生成甲醛和NADH；(2)FLS酶催化甲醛生成DHA。此外，本发明采用迭代定点饱和突变，以提高限速酶MDHBs的活性。为提高酶的稳定性，本发明采用微凝胶包覆酶的方法，将酶与底物区隔化，减轻酶的毒害作用。因此，本发明的方法可应用于生物固碳转化制备二羟基丙酮及衍生化学品等领域，具有重要价值和应用前景。本发明的总体技术路线如图1所示。
MDHBs酶和FLS酶的表达与纯化
(1)基因MDHBs和FLS的克隆和表达载体的构建：
甲醇脱氢酶(MDHBs)来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，基因编码序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；选用的甲醛依赖型醛缩酶(FLS)由Siegel J B团队(Proceedings of the NationaI Academy of Sciences.,2015，112(12)：3704-3709)改造得到，基因编码序列如SEQ ID NO.6所示,氨基酸编码序列如SEQ IDNO.3所示。将上述两段基因片段送由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，并将其克隆至载体pET-28a(+)上，克隆位点选为HindIII，XhoI；C端融合6xHis6X-His标签。成功克隆的基因表达载体命名为pET-28a(+)-MDHBs和pET-28a(+)-FLS。接着分别将其转入到不同大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中过夜培养12～16h，第二天挑取单菌落进行PCR验证，图2为PCR验证结果，泳道1为MDHBs酶的PCR产物，基因片段长度在1020bp左右，证明pET-28a(+)-MDH成功转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中；泳道2为FLS酶的PCR产物，基因片段长度为1725bp，证明pET-28a(+)-FLS已成功转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。将成功转化的单菌落分别接种于4mL含有1‰卡那抗生素的LB液体培养基中过夜培养12～16h，接着分别吸取700μL菌液与300μL 50％的甘油混合，置于-80℃冰箱中保存。
在一些实施例中，所述大肠杆菌感受态细胞包括但不限于BL21(DE3)、Top10、DH5α。
(2)MDHBs和FLS酶的诱导表达
分别吸取上述pET-28a(+)-MDHBs、pET-28a(+)-FLS菌液接种到含有1‰卡那霉素的4mL LB试管中，在37℃、200rpm恒温摇床培养箱中培养12～16h使其活化。随后吸取1％活化的pET-28a(+)-MDHBs、pET-28a(+)-FLS菌液接种到含有1‰卡那霉素的50mL LB液体培养基的封口锥形瓶中，在37℃，200rpm恒温摇床培养箱中培养至OD600＝0.6～0.8时，添加适量IPTG至终浓度为0.1mM，30℃，200rpm恒温摇床培养箱中诱导12h使MDHBs、FLS酶表达。
在一些实施例中，IPTG的终浓度为100～1000μM，具体为100μM、200μM、400μM、500μM、800μM、1000μM等，为使篇幅简洁，此处便不一一详细列举。
在一些实施例中，诱导时间为6～24h，具体为6h、8h、10h、12h、24h等。
在一些实施例中，诱导温度为20～40℃，具体为20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃等。
(3)MDHBs和FLS粗酶液的制备
将上述发酵液在冷冻离心机中4℃、6000rpm冷冻离心10min后弃上清收集菌体，用等体积pH为7.5的PBS缓冲液悬浮菌体1～2次。随后将菌体溶于缓冲液A(100mM Tris+150mMNaCl+20mM咪唑，pH＝7.5)置于冰水浴中，用超声破碎仪超声破碎10～15min(工作2s，间隔3s)，随后在4℃，6000rpm条件下离心15min去掉沉淀得到粗酶液。
(4)MDHBs和FLS酶的纯化
本发明采用镍柱纯化，采用的仪器为PPS-100-A蛋白层析系统。首先将酶粗液用0.22μm的有机滤膜过滤除菌得到上清液，用缓冲液A平衡镍柱后，将酶粗液上样；其次用缓冲液A洗脱杂蛋白，重复洗涤约10mL后，收集流出液。用缓冲液B(100mM Tris、150mM NaCl、500mM咪唑，pH＝7.5)进行洗脱，收集500mM咪唑的洗脱峰，获取目的蛋白。之后将收集得到的纯化酶液置于30KDa的透析袋中，浸泡于磷酸缓冲液中，静置在4℃冰箱12h将咪唑透析出。最后将脱盐后的纯化酶液用超滤管在4℃，6000rpm条件下离心15min，得到浓缩的MDHBs和FLS纯化酶液。目的蛋白用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析，蛋白浓度用考马斯亮蓝法测定(Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic,2015,115:105-112.)。图3为FLS酶和MDH酶的SDS-PAGE图，如图3中(a)，FLS蛋白分子量与理论值66KDa基本一致，故表明FLS成功表达，如图3中(b)，MDH酶的蛋白分子量与理论值36KDa基本一致。
实施例2
甲醇脱氢酶突变体的制备
(1)MDHBs酶突变位点的选择
由于位于酶底物结合口袋附近的氨基酸突变通常会在一定程度上影响酶的空间结构、电荷分布及疏水性，从而影响酶的催化活性、底物专一性及热稳定性等催化特性。MDHBs酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，本发明选取晶体PDB ID：6IQD.1.A为模板，由SWISS-MODEL在线网址进行同源构建，获取来源于B.stearothermophilus的MDH酶的晶体模型，氨基酸同源性为87％。辅酶因子NAD+、甲醇小分子由PubChem数据库获得。随后在Autodock4.0软件中以MDHBs为受体，NAD+、甲醇分子为配体，采用Lamarckian GA(4.2)遗传算法进行了半柔性分子对接模拟，产生数个对接构象。再将对接构象在晶体结构分析软件Pymol中进行分析。其中一个对接构象如图4所示，在Pymol可视化软件中，以甲醇分子为中心，周围6A范围以内的氨基酸残基有LEU-23、LEU-29、LYS-22、GLU-69、PRO-21、ARG-20，其中氨基酸残基LEU-23、GLU-69与甲醇分子构成氢键作用。在本实施例中，选取LEU-23、LEU-29、LYS-22、GLU-69、PRO-21、ARG-20为定点饱和突变位点。
(2)含有MDHBs酶饱和突变文库的构建
以实施例1步骤(1)中构建的pET-28a(+)-MDHBs为模板，针对MDHBs酶的20、21、22、23、29、69位的单点氨基酸位点设计含有简并密码子NNN(N＝A/T/C/G)的引物简并引物(表1)，分别通过全质粒聚合酶链式反应(PCR)进行定点饱和突变，构建获得含有MDHBs酶突变体的重组质粒。
表1突变体引物序列
50μL PCR反应体系均为：10×Pfu Buffer with MgSO4(5μL)，10mM dNTP Mix(1μL)，正向引物(1μL)，反向引物(1μL)，模板DNA(1μL)，Pfu DNA Polymerase,2.5U/μL(1.2μL)，Sterilized ddH2O(加至总反应体系为50μL)。
PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，用引物的Tm值减去5℃作为退火温度进行退火1min，68℃延伸15min，18个循环；68℃充分延伸10min；4℃保存。
在突变体系中加入1μL Dpn I限制性酶(10U/μL)到每个扩增反应中，温和混匀，37℃下孵育1h，消化亲本模板。
将含有MDHBs酶突变体的消化产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞37℃培养12～16h，挑取不同的突变转化子及1/8野生转化子至含有200μL LB液体培养基的96浅孔板中发酵培养8h后，转接至含有1mL LB液体培养基的96深孔板中，继续于37℃，220rmp条件下培养3h至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，在30℃、220rmp条件下诱导培养12h，向转接后的96浅孔板中加入终体积分数为15％的甘油，于-80℃下保藏备用。
(3)MDHBs酶饱和突变文库的高通量筛选
将上述(2)中的96深孔板于4℃，4500rmp转速下离心10min收集菌体，并用等量pH为7.5的PBS缓冲液洗涤2次，向96深孔板中加入500μL含有终浓度为100mM甲醇、0.1mM NAD+的pH为7.5的PBS缓冲液，于30℃，220r/min条件下反应2h；反应液于4℃，4500r/min转速下离心10min，取125μL上层清液置于96孔细胞培养板中，加入125μL纳什试剂(5M乙酸铵，50mM乙酰丙酮)37℃下混合1小时进行显色反应，用紫外分光光度计测量显色液波长在412nm处的吸光值，挑取吸光值相对于野生MDHBs转化子高的突变株进行测序及活力鉴定。
(4)MDHBs酶及突变酶的酶活测定
将诱导成功且吸光值相对于野生MDHBs转化子高的突变菌株按照实施例1中(3)、(4)步骤的方法制备粗酶液并纯化，得到纯酶液。
图5为MDH不同突变位点的SDS-PAGE蛋白图，表2为MDH不同突变位点的蛋白浓度表。
表2 MDH不同突变位点的蛋白浓度
酶活力测定体系总体积为500μL，包括100mM底物甲醇、100mM PBS缓冲液，0.1mMNAD+及2～5mg/ml的纯酶液，加入500μL乙腈终止反应，过滤后产物采用高效液相检测。
高效液相检测甲醛的方法：甲醛含有羰基，可与二硝基苯肼(DNPH)可衍生为甲醛苯腙，使用HPLC定量检测。将0.0201g DNPH溶解在50mL体积比为1.5％的磷酸-乙腈混合溶液中，得到衍生液。将800μL衍生液与200μL甲醛标准液、样品液混合，60℃金属浴衍生1h。待其冷却用0.22μm滤膜过滤用于HPLC分析。色谱条件为：HPLC(紫外检测器)，C18色谱柱(ShimNex CS，4.6×250mm，5μm)，双流动相(乙腈：水＝70：30(V：V))，柱温30℃，波长338nm，流速0.8mL·min-1，进样量10μL，检测15分钟。酶活力单位(U)定义：在所述条件下，每分钟转化生成1μmol产物甲醛所需的酶量。酶活计算公式如下：
其中，MDHBs酶活单位为mU/mg；甲醛生成量单位为mM；反应时间单位为min；反应液体积单位为mL；蛋白含量单位为g/mL。
实施例3：迭代饱和突变策略的应用
(1)最佳MDHBs突变体的获取
由于上述单点突变株酶活提高不明显，进一步对影响酶活的不同关键位点进行组合突变。若简单地将每个位点的最优突变株直接组合则不能考虑到各位点间的相互影响；若对四个位点进行随机组合突变，即使选用NDT密码子，也需要筛选超过60000个转化子。因此，本研究使用迭代饱和突变策略(ISM)(Molecular Biosystems,2009,5(2):115-122.)对之前找到的关键位点行组合突变，按一定迭代顺序在一个位点的最优突变株上引入另一个位点的饱和突变，避免了直接组合可能带来的消极作用，也大大降低了筛选工作量。在本实施例中，在突变体pET28a(+)-MDHBs-E69Q的基础上依次对剩余的正向突变位点20、21、22、23、29再次进行饱和突变，逐步形成更加稳定的结构，每次突变都进行酶活的筛选，部分酶活测定结果见表3、表4，以便得到最佳突变体。经过数轮饱和突变酶活的筛选后，最终得到重组质粒pET28a(+)-MDHBs-E69Q/K22T/R20I，MDHBs-E69Q/K22T/R20I基因编码序列如SEQID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。突变的PCR反应体系和扩增程序以及所用酶活测定方法与实施例2中步骤相同。
表3部分突变位点MDHBs突变株的酶活数据
表4部分迭代饱和突变位点MDHBs突变株的酶活
图6为利用高效液相检测甲醛的的生成量来检测MDH酶活，图6中(a)为甲醛标品的高效液相图，从中可以发现甲醛苯腙在5.637min处出峰，4.075min处的吸收峰为DNPH的吸收峰；图6中(b)为甲醛样品的高效液相图，从中判断在5.646min处出峰的峰图为甲醛。
(2)最佳突变体的酶学性能测试
最适温度的测试：在pH 7.5，浓度为100mM的PBS缓冲体系，在不同温度下(25～60℃)进行酶促反应1h，分别测定酶活，以测定纯化的野生型酶MDH和突变体酶的最适温度。最高酶活时的温度定义为最适反应温度，以最高酶活为100％，计算各温度下的相对酶活。由图7中(a)可知，突变体E69Q/K22T/R20I的最适反应温度为55℃，较野生型酶MDHBs上升了10℃。
最适pH的测试：将酶液在不同pH 2.5～9.5的缓冲液中于最适温度下进行酶促反应1h以测定最适pH值。最高酶活时的pH值定义为最适反应pH，以最高酶活为100％，计算各pH下的相对酶活。由图7中(b)可知，突变体E69Q/K22T/R20I的最适反应pH为8.5左右，较野生型酶MDHBs耐碱性增强。
实施例4：微凝胶-酶包覆体应用于二羟基丙酮的生产
(1)微凝胶的制备
在100mL圆底烧瓶中加入1.212g甲基丙烯酸、0.736g二乙烯基苯、0.03896g 2,2-偶氮二异丁腈和40mL乙腈，超声30min使其分散均匀。在85℃-90℃条件下恒温回流进行反应，1h-2h后停止反应。后将其以8000r/min离心10min，倒掉上层清液，加入无水乙醇超声分散再以8000r/min离心分离5min，反复2～3次制得乳白色微凝胶小球备用。优选的，在90℃条件下恒温回流进行反应，2h后停止反应。
(2)微凝胶-酶包覆体的制备
为了固定化酶，将5mg微凝胶小球和0.1mL的纯酶液溶解在磷酸盐(PBS)缓冲液(0.5M，pH＝7.5)中(终浓度其中MDHBs酶蛋白含量为5～10mg/ml，FLS酶蛋白含量为2～5mg/ml)，37℃搅拌2h，后在8000r/min下离心20min倒去上清液，将下层残留物重新分散在水与异丙醇的混合溶剂(水与异丙醇的体积比例为1:1～1:3)中，再离心弃上层清液，反复润洗2～3次；最后用正己烷与异丙醇混合溶液(正己烷:异丙醇的体积比为1:1～1:2)分散，由于MDHBs的蛋白分子量为36.2kDa，FLS蛋白分子量为66kDa，分子量较小，故蛋白分子包覆于微凝胶内部，形成一个微凝胶-酶包覆体，可区隔化酶蛋白与底物小分子，起到稳定和保护酶蛋白的作用。
(3)催化生产二羟基丙酮
反应体系为5mL，各物质的终浓度为：0.5M，pH7.0～pH7.5的PBS缓冲液，100mM甲醇，0.2mM无水硫酸镁，0.1mM NAD+，0.1mM TPP，终浓度为10mg/mL微凝胶-酶包覆体。
在对比中，无微凝胶-突变MDHBs催化生产二羟基丙酮的测试中，直接加同样终浓度的MDHBs酶和FLS酶。
在对比中，无微凝胶-野生MDH催化生产二羟基丙酮的测试中，直接加同样终浓度的MDH酶和FLS酶。
(4)检测二羟基丙酮的含量
为验证微凝胶-固碳酶包覆体的技术效果，本发明以生产二羟基丙酮的产量为指标，采用高效液相色谱法测定反应液二羟基丙酮的含量。色谱条件为：HPLC(紫外检测器)，C18色谱柱(ShimNex CS，4.6×250mm，5μm)，双流动相(甲醇：含0.05％磷酸的超纯水＝5：95(V：V))，柱温25℃，波长272nm，流速1.0mL·min-1，进样量10μL，检测15分钟。
(5)最适底物浓度的测定
配置50～300mM浓度梯度的甲醇溶液于含有终浓度为10mg/mL的微凝胶-酶包覆体的反应液，按照本实施例步骤(3)的反应体系进行酶促反应，并以不含微凝胶包覆作用的游离酶的反应液为对照实验，以二羟基丙酮的产量/投入甲醇的含量为得率作为评价指标，测定不同底物浓度的二羟基丙酮得率，结果如表5和图8所示。如图8可知，无微凝胶-固碳酶包覆体的反应液的最适底物浓度为150mM，含有微凝胶包覆体的反应液最适底物浓度为250mM，得率增大到原来的2.67倍，表明耐受甲醇性有所增强。
表5不同底物酶促反应的二羟基丙酮得率
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs的第69位谷氨酸突变为谷氨酰胺，第22位赖氨酸突变为苏氨酸，第20位精氨酸突变为异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.编码权利要求1所述嗜热脂肪芽孢杆菌来源的甲醇脱氢酶MDHBs突变体的核苷酸序列。
4.含有权利要求3所述核苷酸序列的载体或细胞。
5.表达权利要求1所述甲醇脱氢酶MDHBs突变体的基因工程菌。
6.根据权利要5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pET-28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
7.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，将编码突变体的基因片断连接至表达载体并转化大肠杆菌进行表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，是以SEQ ID NO.4所示基因为模板，采用迭代饱和突变的方法进行突变，获得编码突变体的基因片段。
10.权利要求1所述突变体在催化制备甲醛和/或1,3-二羟基丙酮中的应用。
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