CN113621589B - 醛酮还原酶KmAKR突变体、工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种醛酮还原酶KmAKR突变体、工程菌及其在不对称还原6‑氯‑(5S)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氯‑(3R,5S)‑二羟基己酸叔丁酯中应用，所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第164位、第182位、第232位或第266位进行单突变或多突变获得的。本发明构建的突变体单位菌体酶活较对照组增加了0.24～0.30倍；全细胞下的T50 15值则提高了0.6～6.3℃，最大底物投料量可达到400g/L，底物转化率大于99％，dep值始终保持在99.5％以上，时空产率达到449.2g/L/d。

Description

醛酮还原酶KmAKR突变体、工程菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种源自马克斯克鲁维酵母的醛酮还原酶KmAKR的突变体构建，并开发醛酮还原酶及醛酮还原酶重组菌在瑞舒伐他汀侧链双手性二醇6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯手性生物催化合成方面的应用。
(二)背景技术
他汀药物大多含有6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯结构，既是重要的药效基团又是关键合成前体。6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯是瑞舒伐他汀、匹伐他汀等“超级他汀”药物的合成前体。瑞舒伐他汀是治疗心脑血管疾病的重大降脂药品种，具有高效的降脂功效、长期安全性和临床益处，显著降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。
由于6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯具有两个手性中心，因此，研究光学纯6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯的手性合成方法学和合成技术具有重要意义。已有文献报道的6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯合成方法主要包括化学催化6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，生成6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。但是硼烷等化学催化剂催化还原工艺存在能耗高、转化率低、差向选择性低和生产成本高等缺陷。与化学催化剂相比，酶作为绿色天然生物催化剂，在催化化学反应中具有优越的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优点，且反应条件温和、副产物少、环境友好。但许多酶分子在催化非天然底物时，往往存在活力较低、稳定性差、底物产物抑制等问题，亟需对酶分子实施分子改造。
在我们前期发明(CN 201710282633.X、CN201910072740.9、CN201910932502.0、CN202110136118.7)的基础上，本发明基于KmAKR的模拟三维结构通过将分子动力学模拟和HotSpot Wizard 3.0相结合的计算机辅助设计技术来预测热点氨基酸残基，从而提高KmAKRM9的热稳定性。基于这种组合的计算机辅助设计技术，我们通过构建有限的定点突变体文库，从而迅速鉴定出与热稳定性相关的关键热点残基；通过突变改造增强了KmAKRM9的热稳定性并减少了该酶的生物催化剂用量，筛选获得催化性能最强、溶剂耐受性强、具有工业属性的超级突变体KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C/K164E/S182H/S232A/Q266D(KmAKRM13)；进一步分析了突变体稳定性提升的分子机理；通过优化反应工艺参数，构建KmAKRM13催化合成6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯工艺。
(三)发明内容
本发明目的是针对现有醛酮还原酶热稳定性、有机溶剂耐受性和底物耐受性低的问题，提供一种醛酮还原酶KmAKR突变体编码基因、突变酶、基因工程菌及其不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯技术，本发明有效提高了突变体的催化活性、热稳定性、有机溶剂耐受性和底物耐受性。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种源自马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus CICC32920)的醛酮还原酶KmAKR突变体，所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第164位、第182位、第232位或第266位进行单突变或多突变获得的。
进一步，优选所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列(记为KmAKR M9)进行下列之一突变：(1)第164位赖氨酸突变为谷氨酸(K164E，记为KmAKRM10)；(2)第182位丝氨酸突变为组氨酸(S182H)；(3)第232位丝氨酸突变为丙氨酸(S232A)；(4)第266位谷氨酰胺突变为天冬氨酸(Q266D)；(5)第164位赖氨酸突变为谷氨酸，且第232位丝氨酸突变为丙氨酸(K164E/S232A，记为KmAKRM11)；(6)第164位赖氨酸突变为谷氨酸，第232位丝氨酸突变为丙氨酸且第182位丝氨酸突变为组氨酸(K164E/S232A/S182H，记为KmAKRM12)；(7)第164位赖氨酸突变为谷氨酸，第232位丝氨酸突变为丙氨酸，第182位丝氨酸突变为组氨酸且第266位谷氨酰胺突变为天冬氨酸(K164E/S232A/S182H/Q266D，记为KmAKRM13)。
本发明还涉及所述醛酮还原酶KmAKR突变体编码基因，重组载体以及工程菌，重组载体优选以pET28a(+)、pET28b(+)为基础质粒，工程菌优选以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。
本发明还提供一种所述醛酮还原酶KmAKR突变体在不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述应用为：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后的混合菌体作为催化剂，以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-40℃、400～800rpm条件下进行反应，反应液分离纯化，获得6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。
进一步，所述含醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体以干重比1～5:1(w/w)混合，优选2～3:1(w/w)。
进一步，所述转化体系中，底物加入终浓度30～400g/L(优选200～400g/L)，葡萄糖加入终浓度30～400g/L(优选200～400g/L)，催化剂加入量以混合菌体总干重计为0.1～20g DCW/L(DCW为细胞干重)，优选6g DCW/L)。
进一步，所述醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体按如下方法制备：将醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含醛酮还原酶突变体基因的湿菌体。
所述葡萄糖脱氢酶基因工程菌的湿菌体按如下方法制备：将来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)葡萄糖脱氢酶基因bmgdh(GenBank No.LK055286.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)插入到pET28b(+)的Nco I和EcoR I两个酶切位点之间，构建重组表达载体；并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种至LB培养基，37℃培养12h，测序确定葡萄糖脱氢酶基因工程菌构建成功，即E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh。将E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM的IPTG，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得湿菌体细胞。
本发明不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯的催化剂还可以是醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶，转化体系由催化剂、底物、NADPH和反应介质组成；此时的反应为：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶作为催化剂，以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，添加NADPH，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～40℃、400～800rpm条件下进行反应，反应液分离纯化，获得6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。所述转化体系中，纯酶加入量以蛋白含量计为0.01～1mg/mL(优选0.05mg/mL)，NADPH加入终浓度为0.5-5mM(优选0.8～1.0mM)，底物加入终浓度为0.1～20mM(优选10mM)。
所述纯酶按如下方法制备：(1)将醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体按50g/L的量用(pH 7.0、100mM)磷酸钾缓冲液重悬，置于冰水混合物中，破碎10min；破碎条件：功率为350W，破碎1s，暂停1s，得到粗酶液；(2)将粗酶液经4℃、8000rpm条件下离心10min，去沉淀，上清液经0.22μm的滤膜过滤后，滤液作为上样液使用镍柱(40×12.6mm，Bio-Rad,USA)纯化酶蛋白，其步骤为：
先用超纯水冲洗管路中的杂质与空气，并除去镍柱中的20％无水乙醇；
平衡基线：用5-10倍柱体积的结合缓冲液(Binding buffer，20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液，含0.3M的NaCl)平衡镍柱，使基线平衡；
样品上样：将先前收集到的滤液上样，设置流速为0.25mL/min，总上样量为10mL；
洗脱杂蛋白：用5～10倍柱体积的冲洗缓冲液(20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，含0.3M NaCl，20mM咪唑)洗脱杂蛋白，流速1mL/min，直至基线平衡，使得杂质完全洗脱；
洗脱目的蛋白：用洗脱缓冲液(Elution buffer，20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液，含0.3M NaCl，500mM咪唑)洗脱目的蛋白，流速为1mL/min；通过观察电脑软件中紫外吸收检测值进行监测，当紫外吸收检测值相对于基线向上扬起时拿试管收集从废液口流出的样品，当紫外吸收检测值回到基线时停止收集，将收集的目的蛋白置于冰上保存；
透析：将经纯化的目的蛋白装入透析袋(MD 34(3500))，置于pH 7.0、20mM的PBS溶液中，并放入4℃透析12h，透析完成后截留液即为纯酶液。
本发明醛酮还原酶KmAKR及醛酮还原酶KmAKR突变体碱基序列全长均为933bp，从第一个碱基起至第933个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。
本发明所述醛酮还原酶KmAKR突变体的获取是采用定点突变技术，使用该技术对KmAKRM9醛酮还原酶基因(核苷酸序列，SEQ ID NO.2)进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用重悬菌液催化6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原，制备光学纯6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯，具体方法如下：第一步将对照菌活化，获得了对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C(E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakrM9)，提取质粒pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C(pET28a(+)-kmakrM9)，并保存于-20℃。第二步通过SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)寻找与KmAKRM9相似度高的模型，并以此为模板进行同源建模。得到KmAKRM9分子模型后进行分子对接，选择合适的突变位点。通过基于三维结构模型，将Molecule Dynamics(MD)和HotSpot Wizard 3.0相结合的计算技术来预测热点氨基酸残基，得到的正突变位点并进行叠加突变，得到突变体KmAKRM9-K164E(记为KmAKRM10)、KmAKRM9-K164E/S182H(记为KmAKRM11)、KmAKRM9-K164E/S182H/S232A(记为KmAKRM12)和KmAKRM9-K164E/S182H/S232A/Q266D(记为KmAKRM13)(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
本发明醛酮还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长，优选LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，调节pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。
与现有技术相比，本发明主要的有益效果主要体现在：本发明构建的组合突变体KmAKRM10、KmAKRM11、KmAKRM12、KmAKRM13单位菌体酶活较对照组醛酮还原酶KmAKRM9增加了0.29倍、0.27倍、0.30倍与0.24倍；全细胞下的T50 15值则提高了0.6℃、4.1℃、5.5℃与6.3℃。其中使用2.5g DCW/L的KmAKRM13和1.75g DCW/L的BmGDH混合体系中，最大底物6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯投料量可达到400g/L，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，8.0h内可反应完成，底物转化率大于99％，dep值始终保持在99.5％以上，时空产率达到449.2g/L/d，同时相比于对照菌株KmAKRM9具有更少的菌体用量。因此醛酮还原酶突变体KmAKRM13更具工业应用前景。
(四)附图说明
图1是醛酮还原酶KmAKRM13与葡萄糖脱氢酶BmGDH偶联催化6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯的反应示意图。
图2是实施例5中醛酮还原酶突变体纯酶的SDS-PAGE电泳图；M：蛋白质标记；泳道1：纯化的KmAKRM9；泳道2：纯化的KmAKRM10；泳道3：纯化的KmAKRM11；泳道4：纯化的KmAKRM12；泳道5：纯化的KmAKRM13；泳道6：KmAKRM5。
图3是实施例3中KmAKRM9不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的液相色谱图。
图4是实施例3中HPLC信号值(mAu)与产物6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯相应浓度(g/L)的标准曲线。
图5是实施例10利用醛酮还原酶突变体KmAKRM9偶联BmGDH不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯时间进程图。
图6是实施例11利用醛酮还原酶突变体KmAKRM13偶联BmGDH不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯时间进程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：醛酮还原酶突变体的构建及筛选
醛酮还原酶KmAKR突变体的制备通过定点突变来实现，引物设计如表1，以专利申请CN202110136118.7中的E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K 29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C(记为出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9)提取的载体pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C(记为载体KmAKRM9)为模板(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)，采用表1中的上下游引物，进行定点突变PCR。
PCR反应体系(25μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，12.5μL 2×Phanta缓冲液，0.5μLdNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，0.5μL DNA聚合酶和8.5μL超纯水。
根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸6min)，72℃终延伸10min。
将得到的PCR产物经DpnI酶切后的重组质粒转移到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂板于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，在37℃培养10h。并将克隆子接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃培养12h后，进行测序鉴定，获得一系列的醛酮还原酶突变菌株，分别记为E.coli BL21(DE3)/pE T28a(+)-KmAKRM9-K164E、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9-S232A、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9-S182H、E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9-Q266D、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9-V166L、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9-N187H、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9-L245R、E.coli BL 21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9-A267N、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM9-I192L。
表1醛酮还原酶定点突变引物设计
实施例2：醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的诱导表达
葡萄糖脱氢酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh的构建：将GenBank中来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶基因bmgdh(GenBankNo:LK055286.1)的突变基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)插入到pET28b(+)的Nco I和EcoR I两个酶切位点之间，构建重组表达载体；并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种至LB培养基，37℃培养12h，测序确定葡萄糖脱氢酶基因工程菌构建成功，即E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh。
将实施例1出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakrM9和实施例1筛选的醛酮还原酶突变菌株以及E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-bmgdh分别接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM的IPTG，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得相应的湿菌体细胞。以上获得的细胞表达了相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。
实施例3：突变体筛选
1、突变体活性
将实施例2诱导表达的突变株湿菌体及葡萄糖脱氢酶湿菌体以干重比3.0:1(w/w)混合成混合菌体，加入pH 7.0、100mM PBS缓冲液中重悬，获得突变株混合菌液。同样条件下，用出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakrM9替换突变体菌株湿菌体制备对照株混合菌液。
对获得的突变体进行活性的测定，测定条件如下：分别将突变株混合菌液和对照株混合菌液作为催化剂，以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，不添加外源性NADPH或NADP+，运用菌体内源型NADPH，建立起辅酶循环系统。反应体系选择为10mL，催化剂用量以混合菌体总干重计6.0g DCW/L，底物终浓度30g/L，葡萄糖终浓度30g/L，pH 7.0、100mM PBS缓冲液为反应介质构建转化体系，35℃、600rpm反应5min，取反应液100μL加入900μL无水乙醇沉淀蛋白，即反应液稀释10倍，12000rpm离心3min，取上清，过0.22μm微滤膜，滤液作为液相样品，利用HPLC检测6-氯-(3S,5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯((3S,5S)-CDHH))、6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯((3R,5S)-CDHH)的HPLC信号值(mAu)，根据标准曲线计算含量及dep值。以产物6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯含量和dep为指标，筛选优势突变体。
6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯标准曲线：HPLC信号值(mAu)与产物6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯相应浓度(g/L)的标准曲线为y＝113.7x-4.72，R2＝0.999，标准曲线为图4所示。
dep：(C[6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯]-C[6-氯-(3S,5S)-二羟基己酸叔丁酯])/(C[6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯]+C[6-氯-(3S,5S)-二羟基己酸叔丁酯])，即反应生成的6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯的浓度与反应所生成的6-氯-(3S,5S)-二羟基己酸叔丁酯浓度的差值除以反应所生成的6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯的浓度与反应所生成的6-氯-(3S,5S)-二羟基己酸叔丁酯浓度之和。但在所有实施例中均未检测到另一构型产物6-氯-(3S,5S)-二羟基己酸叔丁酯的生成，因此，记为dep>99.5％。
出发菌株KmAKRM9及其突变体全细胞反应下的细胞活性：在35℃、pH 7.0条件下，每分钟产生1微摩尔6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯所需要的细胞量。
相对活性：定义出发菌株KmAKRM9的细胞活性为100％，突变体的细胞活性与出发菌株KmAKRM9细胞活性的比值即为相对酶活。
HPLC检测条件：Agilent Zorbax SB-C8色谱柱(150×4.6mm,5μm)，流动相为30％乙腈(乙腈:水＝30:70，v/v)，流速为1mL/min，紫外检测波长为210nm，检测温度为40℃，(3R,5S)-CDHH和(S)-CHOH的保留时间分别为6.214min和8.587min。
2、突变体T50 15
对获得的突变体进行稳定性的测定，测定条件如下：称取0.15g的实施例2方法制备的突变体株湿菌体，用10mL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液悬浮，得到细胞悬浮液，将细胞悬浮液置于一定温度梯度下(40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃)保温15min，再使用酶活检测方法测定其在不同温度下残余酶活，以40℃保温15min后的酶活性定义为100％，通过Origin 9.1软件进行分析计算，采用SigmoidalBoltzman进行非线性拟合可得到各突变菌株的T50 15。并与出发菌株进行比较，检测重复三次。从而得到突变菌株活性和稳定性，结果如表2所示。突变体KmAKRM9-K164E、KmAKRM9-S182H、KmAKRM9-S232A、KmAKRM9-Q266D的T50 15值比KmAKRM9分别提高了0.6℃、1.5℃、1.8℃、2.5℃，而相对活性分别比KmAKRM9分别提高了23.6％、5.8％、9.0％、15.7％；而突变体KmAKRM9-V166L、KmAKRM9-N187H、KmAKRM9-L245R的热稳定性与活性表现出不同程度的下降；突变体KmAKRM9-A267N的热稳定性降低，但活性提高25.8％，突变体KmAKRM9-I192L未检测到活性。
表2KmAKRM9及其突变体的活性、稳定性和立体选择性
注：KmAKRM9-I192L突变体未检测到活性。
实施例4：组合突变
以出发菌株KmAKRM9载体pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C为模板，将四个单突变位点(K164E、S232A、S182H与Q 266D)依次在KmAKRM9载体的基础上进行叠加突变。所使用的引物为实施例1表1，同时按照实施例1的PCR方法、Dpn I酶切处理、转化等方法，获得突变体E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM10(KmAKRM9-K164E)，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM11(KmAKRM9-K164E/S232A)，E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM12((K mAKRM9-K164E/S232A/S182H)和E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKRM13((KmAK RM9-K164E/S232A/S182H/Q266D)。按实施例3方法检测其活性和稳定性，如表3所示。
表3KmAKRM9及其突变体全细胞条件下活性以及稳定性
实施例5：醛酮还原酶母本及其突变体的纯化
将专利申请CN201910932502.0、CN202110136118.7中获得的醛酮还原酶突变体KmAKRM5(E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)、KmAKRM9(E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M)与实施例4中获得的组合突变体(KmAKRM10、KmAKRM11、KmAKRM12和KmAKRM13)，根据实施例2所述方法诱导培养，分别在8000rpm，4℃下离心10min，收集各自的湿菌体。分别称取获得的湿菌体0.5g，并用10mL(pH 7.0、100mM)磷酸钾缓冲液重悬细胞，得到的细胞悬浮液菌体浓度为50g/L，置于冰水混合物中，破碎10min。破碎条件：功率为350W，破碎1s，暂停1s，得到粗酶液。
将获得的粗酶液经4℃、8000rpm条件下离心10min，去沉淀，上清液经0.22μm的滤膜过滤后，利用蛋白纯化系统(Biologic LP)进行蛋白纯化，滤液作为上样液使用镍柱(40×12.6mm，Bio-Rad,USA)纯化酶蛋白，其步骤为：
先用超纯水冲洗管路中的杂质与空气，并除去Ni柱中的20％无水乙醇；
平衡基线：用5～10倍柱体积的结合缓冲液(20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液，含0.3M的NaCl)平衡Ni柱，使基线平衡；
样品上样：将先前收集到的滤液上样，设置流速为0.25mL/min，总上样量为10mL；
洗脱杂蛋白：用5～10倍柱体积的冲洗缓冲液(20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液，含0.3M NaCl，20mM咪唑)洗脱杂蛋白，流速1mL/min，直至基线平衡，使得杂质完全洗脱；
洗脱目的蛋白：用洗脱缓冲液(20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液，含0.3M NaCl，500mM咪唑)洗脱目的蛋白，流速为1mL/min。通过观察电脑软件中紫外吸收检测值进行监测，当紫外吸收检测值相对于基线向上扬起时拿试管收集流出液，当紫外吸收检测值回到基线时停止收集，将收集的目的蛋白置于冰上保存；
平衡基线：用10倍柱体积的结合缓冲液(binding buffer，20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液，含0.3M的NaCl)平衡镍柱，至基线平衡；
保柱：先用超纯水冲洗管路和柱子10～20min，再用5～10倍柱体积的20％无水乙醇保存镍柱；
透析：将经纯化的目的蛋白装入透析袋(MD 34(3500))，置于pH 7.0、20mM的PBS溶液中，并放入4℃透析12h，透析完成后截留液进行分装保存。分别获得20mL KmAKRM9、KmAKRM10、KmAKRM11、KmAKRM12和KmAKRM13的纯酶液，蛋白浓度分别为(5.3mg/mL、5.7mg/mL、5.1mg/mL、5.8mg/mL与5.4mg/mL)。蛋白浓度用二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定。将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE验证，蛋白胶图如图2所示。
实施例6：醛酮还原酶KmAKRM9及其突变体热稳定性的测定
酶活定义(U)为：在35℃、pH 7.0条件下，每分钟每生成1微摩尔6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为一个酶活单位。
酶活检测标准条件：10mM 6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，0.8mM NADPH，实施例5方法制备的终浓度50mg/L的纯酶液，并用pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中补齐至500μL，35℃、pH 7.0，600rpm条件下反应3min，样品采用实施例3所述HPLC检测分析。
半衰期(t1/2)，t1/2为酶的半衰期，是指在特定温度下酶活性降低一半时所需的时间，是表征酶热稳定性的重要参数。取实施例5方法制备的KmAKRM9及其突变体纯酶(见表4)用pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液稀释至蛋白浓度1mg/mL，并分别置于40℃、50℃下保温一定时间，并每隔1h，取出25μL，按酶活检测标准条件下进行检测，使用Origin 9.1进行分析计算得到半衰期(t1/2)；kd表示酶的失活率常数，使用公式ln2/t1/2计算获得。结果如表4所示，组合突变体KmAKRM9、KmAKRM10、KmAKRM11、KmAKRM12、KmAKRM13在40℃半衰期分别比KmAKRM5提高了1.9倍、2.1倍、2.8倍、3.0倍与3.1倍；组合突变体KmAKRM9、KmAKRM10、KmAKRM11、KmAKRM12、KmAKRM13的半衰期分别比KmAKRM5提高了6.7倍、8.0倍、10.4倍、11.5倍与11.9倍。
表4KmAKRM9及其突变体在40℃和50℃下的半衰期
akd:表示酶的失活率常数。
T50 15(半失活温度)：将酶置于一定温度梯度下保温处理15min后，再在酶活检测标准条件下进行检测，酶活降至初始酶活一半时的温度，即为T50 15。将实施例5方法制备的KmAKRM5及其突变体的纯酶(表5所示)用pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液稀释至蛋白浓度1mg/mL，取100μL稀释后的酶液分别置于一定温度梯度下(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)各自保温15min后，再在所述酶活检测标准条件下进行酶活检测，经HPLC分析测定，测量其残余活性。将置于40℃保温15min后的酶活性定义为100％，再利用Origin 9.1软件进行分析计算，采用Sigmoidal Boltzman进行非线性拟合得到T50 15，结果如表5所示，组合突变体KmAKRM10、KmAKRM11、KmAKRM12、KmAKRM13的T50 15值分别比KmAKRM9提高了0.6℃、4.1℃、5.5℃与6.3℃。
表5KmAKRM9及其突变体的半失活温度
Tm(熔融温度)：在蛋白质分子热变性中，随着温度的升高，当温度达到一定值时，双链开始打开然后迅速解链，把双链DNA解开一半时所需的温度称为该蛋白的Tm。利用Chirascan圆二色(CD)光谱仪对KmAKRM9及其突变体的熔融温度进行分析。首先，用pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液将实施例5方法制备的纯酶稀释至蛋白浓度为0.1mg/mL，然后取200μL上样到10mm石英比色皿中利用CD圆二色谱仪对KmAKRM9及其突变体的Tm进行测定。在波长180-260nm光谱下，在10-90℃的温度下连续收集KmAKRM9及其突变体的熔解曲线，圆二色谱分析仪自带软件Global 3可进行计算Tm，如表6所示，组合突变体KmAKRM10、KmAKRM11、KmAKRM12、KmAKRM13的Tm值比KmAKRM9分别提高了3.5℃、7.6℃、9.1℃与10.4℃。
表6KmAKRM9及其突变体的熔融温度
二级结构含量测定：用pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液将实施例5方法制备KmAKRM9和KmAKRM13的纯酶稀释至蛋白浓度0.1mg/mL，取稀释好的纯酶液于0.5mm比色皿内，将装有酶液的比色皿分别置于设置温度为30℃、50℃、70℃中保温5min，通过圆二色谱仪(ChirascanApplied Photophysics)测定其二级结构。结果如表7所示。在30℃、50℃的条件下，KmAKRM13的二级结构α-Helix含量比KmAKRM9分别增加3.5％、2.1％；而在70℃的条件下，KmAKRM13的二级结构α-Helix含量比KmAKRM9增加7.0％。
表7KmAKRM9和KmAKRM13在30℃、50℃和70℃下的二级结构含量
实施例7：醛酮还原酶KmAKRM5、KmAKRM9和KmAKRM13有机溶剂耐受性的测定
用pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液将实施例5方法制备的KmAKRM5、KmAKRM9和KmAKRM13纯酶稀释至同一蛋白浓度(1mg/mL)，取200μL稀释后的纯酶液，然后按20％体积浓度(v/v)加入40μL的10种不同种类有机溶剂中，油水分配系数值(log P)分别为异辛烷(4.50)、正辛醇(3.00)、甲苯(2.50)、对二甲苯(3.10)、乙腈(-0.33)、乙醇(0.24)、甲醇(-0.76)、异丙醇(0.17)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(-1.00)和二甲基亚砜(DMSO)(-1.41)，对照组加入等量pH7.0、100mM磷酸钾缓冲液，置于800rpm，35℃下震荡混匀60min，再利用实施例6所示酶活标准检测条件测定其残余酶活。并以对照组的活性为100％。分别计算各突变体经不同有机溶剂孵育后的残余活性，从而判定其突变前后有机耐受性情况。结果如下表8所示。KmAKRM13在这10种有机溶剂下仍能保持94％以上的相对活性，其有机耐受性明显提升。
表8KmAKRM5、KmAKRM9和KmAKRM13纯酶在不同有机溶剂下的耐受性
实施例8：醛酮还原酶KmAKRM5、KmAKRM9和KmAKRM13底物耐受性的研究
C50 60是指在一定的底物浓度下处理60min后，酶残余活力为初始活力一半时的底物浓度。具体是用pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液将实施例5方法制备的KmAKRM5、KmAKRM9和KmAKRM13纯酶液稀释为蛋白浓度1mg/mL，取200uL稀释后的酶液，分别加入300mM、400mM、600mM、900mM、1300mM浓度底物6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，25℃、800rpm震荡混匀处理60min，再利用实施例6所示酶活标准检测条件测定其残余活性表示，通过Origin 9.1软件进行分析计算，采用Sigmoidal Boltzman进行非线性拟合获得其C50 60值，结果如表9所示。突变体KmAKRM5、KmAKRM9与KmAKRM13的C50 60值分别为465.7mM、639.3mM与866.7mM,其中KmAKRM13的C50 60值比KmAKRM5提高了0.86倍，表明突变体KmAKRM13底物耐受性显著提高。
表9醛酮还原酶KmAKRM5、KmAKRM9和KmAKRM13在不同底物浓度下的耐受性
实施例9：醛酮还原酶KmAKRM9及其突变菌株的动力学参数测定
以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，浓度为(0.1mM、0.2mM、0.5mM、0.8mM、1.0mM、2.0mM、5.0mM、8.0mM、10mM、15mM、20mM)，添加NAPDH的浓度为1.0mM，加入实施例5方法制备的表10所列突变体的纯酶(加入蛋白终浓度0.05mg/mL)，并用pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液补齐至500μL，在35℃，600rpm的条件下反应3min，加入2μL 6M盐酸终止反应。反应结束后在12000rpm条件下离心3min，经过0.22μm滤膜过滤，最后滤液采用实施例3所述HPLC测定产物量。使用origin 9.1的米氏方程进行拟合，计算得出KmAKRM9及其突变体对底物的亲和力Km，催化常数kcat以及催化效率kcat/Km。结果如下表10所示。突变体KmAKRM9、KmAKRM10、KmAKRM11、KmAKRM12、KmAKRM13的kcat/Km值分别比KmAKRM5提高了0.63倍、1.34倍、1.34倍、1.57倍与1.60倍。
表10KmAKRM5及其突变体动力学参数
实施例10：出发菌株醛酮还原酶KmAKRM9不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯
采用实施例2方法发酵获得出发菌株醛酮还原酶KmAKRM9湿菌体和葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体。在建立的双酶偶联体系中，将醛酮还原酶湿菌体KmAKRM9和葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体以干重比2:1(w/w)混合成混合菌体作为催化剂，催化6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯生成6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。
在10mL反应体系中，先将混合菌体用pH 7.0、100mM的PBS缓冲液重悬，混合菌体加入总干重量为6.0g DCW/L，底物6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的投料量为400g/L，葡萄糖加入浓度为400g/L，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在40℃、800rpm条件下反应，采用实施例3所述HPLC检测产物量和dep值，6.5h能完全转化成产物6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯，产物dep值始终保持在99.5％以上，时空产率达到527.6g/L/d，如图5所示。
实施例11：醛酮还原酶突变体KmAKRM13不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯
采用实施例2方法发酵获得醛酮还原酶突变体KmAKRM13湿菌体和葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体。在建立的双酶偶联体系中，将湿菌体KmAKRM13和葡萄糖脱氢酶BmGDH湿菌体以干重比2:1(w/w)混合成混合菌体。先将混合菌体用pH 7.0、100mM的PBS缓冲液重悬，混合菌体加入总干重量为3.75g DCW/L，底物6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的投料量为400g/L，葡萄糖加入浓度为400g/L时，在40℃、800rpm反应，采用实施例3所述HPLC检测产物量和dep值，8.0h能完全转化成产物6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯，产物dep值始终保持在99.5％以上，时空产率达到449.2g/L/d，如图6所示。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 醛酮还原酶KmAKR突变体、工程菌及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 312
<212> PRT
<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)
<400> 1
Met Thr Asn Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro
1 5 10 15
Ala Val Ala Val Val Gly Thr Gly Thr Lys Trp Ala His Pro Glu Glu
20 25 30
Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Glu Leu Thr Asp Ile Val Lys Leu Ser
35 40 45
Leu Asp Thr Val Pro Gly Ile Val His Ile Asp Ala Ala Glu Met Tyr
50 55 60
Lys Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Glu Thr Lys Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Phe Ser Ser Leu His Lys Ile
85 90 95
Ser Glu Asp Pro Lys Ser Ala Leu Glu Thr Ala Leu Lys Lys Leu Gly
100 105 110
Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Ser Pro Phe Phe Asp Lys
115 120 125
Asp Leu Asn Ile Asp Leu Glu Thr Ala Trp Lys Gln Leu Glu Glu Leu
130 135 140
Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Thr Val
145 150 155 160
Glu Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala Ile Ala Glu Ile Lys Pro Gln Val
165 170 175
Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly Ile
180 185 190
Val Glu Phe Cys Gln Lys Asn Asp Ile Leu Leu Glu Ala Tyr Ser Pro
195 200 205
Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Pro Ala Asp Ala Asp Gln Gln Pro Phe
210 215 220
Tyr Gln Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Asn Lys Thr Glu Ala
225 230 235 240
Gln Val Leu Leu Leu Trp Val Tyr Lys Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr
245 250 255
Thr Ser Ala Lys Ile Glu Arg Ile Lys Gln Ala Gln Asp Ile Phe Ser
260 265 270
Phe Asp Leu Thr Glu Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Gly Leu
275 280 285
Gln His Glu Pro Val Arg Leu Trp His Val Asp Phe Tyr Ser Lys Tyr
290 295 300
Asn Ser Glu Ala Gln Lys Leu Glu
305 310
<210> 2
<211> 936
<212> DNA
<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)
<400> 2
atgacaaacc aaaagttctt tactttatcc aatgggaaca agattccagc tgttgctgtt 60
gttggtacag gtaccaagtg ggcccacccc gaagaaaccg atgctacttt ctctcaagaa 120
ttgactgata tcgtaaagct atctttagac actgttccag gaattgttca cattgatgca 180
gccgagatgt acaagactta tccagagttg ggtgctgctt tgaaggaaac aaagaagccc 240
agggaagaga ttttcattac agacaagttt tcttccttgc acaagatttc ggaagatcct 300
aagtctgctt tagaaaccgc tttgaaaaag ctaggagttg attatgttga cttatacttg 360
attcattctc catttttcga caaggacttg aatattgatc tagagaccgc ttggaagcaa 420
ttggaagaac tatataaatc cggaaaggca aagaacattg gtgtctcaaa ctttactgtt 480
gaggatttga aaaaagtttt ggccattgct gaaattaaac ctcaagtgaa tcaaatcgag 540
ttttctccat tcttgcaaaa ccagacccca ggtatcgtgg agttttgtca aaagaacgat 600
attttactag aagcctattc tccattaggt cctctccaaa agaagccagc tgatgctgac 660
caacaaccat tctatcaata tctgaaggaa ctttctgaaa agtataacaa aactgaagct 720
caagttttgt tgttgtgggt gtacaagcgc ggtatcttgc cagttaccac ttctgccaag 780
atcgagagaa tcaagcaagc ccaagacatc ttcagctttg atcttactga agaagaggta 840
aagaaaatta ccgatttggg tttacaacat gaacctgtta gattgtggca tgttgatttc 900
tacagtaagt acaactccga agcccaaaaa ctcgag 936
<210> 3
<211> 312
<212> PRT
<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)
<400> 3
Met Thr Asn Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro
1 5 10 15
Ala Val Ala Val Val Gly Thr Gly Thr Lys Trp Ala His Pro Glu Glu
20 25 30
Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Glu Leu Thr Asp Ile Val Lys Leu Ser
35 40 45
Leu Asp Thr Val Pro Gly Ile Val His Ile Asp Ala Ala Glu Met Tyr
50 55 60
Lys Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Glu Thr Lys Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Phe Ser Ser Leu His Lys Ile
85 90 95
Ser Glu Asp Pro Lys Ser Ala Leu Glu Thr Ala Leu Lys Lys Leu Gly
100 105 110
Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Ser Pro Phe Phe Asp Lys
115 120 125
Asp Leu Asn Ile Asp Leu Glu Thr Ala Trp Lys Gln Leu Glu Glu Leu
130 135 140
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225 230 235 240
Gln Val Leu Leu Leu Trp Val Tyr Lys Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr
245 250 255
Thr Ser Ala Lys Ile Glu Arg Ile Lys Asp Ala Gln Asp Ile Phe Ser
260 265 270
Phe Asp Leu Thr Glu Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Gly Leu
275 280 285
Gln His Glu Pro Val Arg Leu Trp His Val Asp Phe Tyr Ser Lys Tyr
290 295 300
Asn Ser Glu Ala Gln Lys Leu Glu
305 310
<210> 4
<211> 954
<212> DNA
<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)
<400> 4
atgacaaacc aaaagttctt tactttatcc aatgggaaca agattccagc tgttgctgtt 60
gttggtacag gtaccaagtg ggcccacccc gaagaaaccg atgctacttt ctctcaagaa 120
ttgactgata tcgtaaagct atctttagac actgttccag gaattgttca cattgatgca 180
gccgagatgt acaagactta tccagagttg ggtgctgctt tgaaggaaac aaagaagccc 240
agggaagaga ttttcattac agacaagttt tcttccttgc acaagatttc ggaagatcct 300
aagtctgctt tagaaaccgc tttgaaaaag ctaggagttg attatgttga cttatacttg 360
attcattctc catttttcga caaggacttg aatattgatc tagagaccgc ttggaagcaa 420
ttggaagaac tatataaatc cggaaaggca aagaacattg gtgtctcaaa ctttactgtt 480
gaggatttgg agaaagtttt ggccattgct gaaattaaac ctcaagtgaa tcaaatcgag 540
tttcacccat tcttgcaaaa ccagacccca ggtatcgtgg agttttgtca aaagaacgat 600
attttactag aagcctattc tccattaggt cctctccaaa agaagccagc tgatgctgac 660
caacaaccat tctatcaata tctgaaggaa cttgcggaaa agtataacaa aactgaagct 720
caagttttgt tgttgtgggt gtacaagcgc ggtatcttgc cagttaccac ttctgccaag 780
atcgagagaa tcaaggacgc ccaagacatc ttcagctttg atcttactga agaagaggta 840
aagaaaatta ccgatttggg tttacaacat gaacctgtta gattgtggca tgttgatttc 900
tacagtaagt acaactccga agcccaaaaa ctcgagcacc accaccacca ccac 954
<210> 5
<211> 786
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 5
atgtacaagg accttgaggg aaaggtcgtc gtcattactg gatcttctac tggactggga 60
aagtctatgg ctattcgatt cgctactgag aaggctaagg tcgtcgtgaa ctaccgatct 120
aaggaggacg aggctaactc tgtccttgag gagattaaga aggtcggagg agaggctatt 180
gctgtcaagg gtgacgtcac tgtcgagtct gacgtcatta acctggtcca gtctgctatt 240
aaggagttcg gaaagctgga cgtcatgatt aacaacgctg gacttgagaa ccctgtgtcc 300
tctcacgaga tgtctctgtc tgactggaac aaggtcattg acactaacct gactggtgct 360
ttcctgggat ctcgagaggc tattaagtac ttcgtcgaga acgacattaa gggaactgtc 420
attaacatgt cctctgtcca cgagaagatt ccttggcctc tgttcgtcca ctacgctgct 480
tctaagggtg gaatgaagct gatgactaag actctggctc ttgagtacgc tcctaagggt 540
attcgagtca acaacattgg acctggtgct attaacactc ctattaacgc tgagaagttc 600
gctgaccctg agcagcgagc tgacgtcgag tctatgattc ctatgggtta cattggagag 660
cctgaggaga ttgctgctgt cgctgcttgg ctggcttctt ctgaggcttc ttacgtcact 720
ggaattactc tgttcgctga cggtggaatg actctttacc cttcgttcca ggctggacga 780
ggatag 786
<210> 6
<211> 261
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 6
Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Thr Gly Leu Gly Lys Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala
20 25 30
Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Asp Glu Ala Asn Ser Val
35 40 45
Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly
50 55 60
Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val
100 105 110
Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260
<210> 7
<211> 936
<212> DNA
<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)
<400> 7
atgacaaacc aaaagttctt tactttatcc aatgggaaca agattccagc tgttgctgtt 60
gttggtacag gtaccaagtg ggcccacgct gaagaaaccg atgctacttt ctctcaagaa 120
ttgactgata tcgtaaagct atctttagac actgttccag gaattgttca cattgatgca 180
gccgagatgt acaagactta tccagagttg ggtgctgctt tgaaggaaac aaagaagccc 240
agggaagaga ttttcattac agacaagttt tcttccttgc acaagatttc ggaagatcct 300
aagtctgctt tagaaaccgc tttgaacaag ctaggagttg attatgttga cttatacttg 360
attcattctc catttttcga caaggacttg aatattgatc tagagaccgc ttggaagcaa 420
ttggaagaac tatataaatc cggaaaggca aagaacattg gtgtctcaaa ctttactgtt 480
gaggatttga aaaaagtttt ggccattgct gaaattaaac ctcaagtgaa tcaaatcgag 540
ttttctccat tcttgcaaaa ccagacccca ggtatcgtgg agtttagcca aaagaacgat 600
attttactag aagcctattc tccattaggt cctctccaaa agaagccagc tgatgctgac 660
caacaaccat tctatcaata tctgaaggaa ctttctgaaa agtataacaa aactgaagct 720
caagttttgt tgttgtgggt gtacaagcgc ggtatcttgc cagttaccac ttctgccaag 780
atcgagagaa tcaagcaagc ccaagacatc ttcagctttg atcttactga agaagaggta 840
aagaaaatta ccgatttggg tttacaacat gaacctgtta gattgtggca tgttgatttc 900
tacaccaagt acaactccga agcccaaaaa ctcgag 936
<210> 8
<211> 312
<212> PRT
<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)
<400> 8
Met Thr Asn Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro
1 5 10 15
Ala Val Ala Val Val Gly Thr Gly Thr Lys Trp Ala His Ala Glu Glu
20 25 30
Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Glu Leu Thr Asp Ile Val Lys Leu Ser
35 40 45
Leu Asp Thr Val Pro Gly Ile Val His Ile Asp Ala Ala Glu Met Tyr
50 55 60
Lys Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Glu Thr Lys Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Phe Ser Ser Leu His Lys Ile
85 90 95
Ser Glu Asp Pro Lys Ser Ala Leu Glu Thr Ala Leu Asn Lys Leu Gly
100 105 110
Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Ser Pro Phe Phe Asp Lys
115 120 125
Asp Leu Asn Ile Asp Leu Glu Thr Ala Trp Lys Gln Leu Glu Glu Leu
130 135 140
Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Thr Val
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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225 230 235 240
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260 265 270
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275 280 285
Gln His Glu Pro Val Arg Leu Trp His Val Asp Phe Tyr Thr Lys Tyr
290 295 300
Asn Ser Glu Ala Gln Lys Leu Glu
305 310

Claims (9)

1.一种醛酮还原酶KmAKR突变体，其特征在于，所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQID NO.1所示氨基酸序列进行下列之一突变：(1)第164位赖氨酸突变为谷氨酸；(2)第182位丝氨酸突变为组氨酸；(3)第232位丝氨酸突变为丙氨酸；(4)第266位谷氨酰胺突变为天冬氨酸；(5)第164位赖氨酸突变为谷氨酸，且第232位丝氨酸突变为丙氨酸；(6)第164位赖氨酸突变为谷氨酸，第232位丝氨酸突变为丙氨酸且第182位丝氨酸突变为组氨酸；(7)第164位赖氨酸突变为谷氨酸，第232位丝氨酸突变为丙氨酸，第182位丝氨酸突变为组氨酸且第266位谷氨酰胺突变为天冬氨酸。
2.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体编码基因构建的重组基因工程菌。
3.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体在不对称还原6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后的混合菌体作为催化剂，以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～40℃、400～800rpm条件下进行反应，反应液分离纯化，获得6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯；所述葡萄糖脱氢酶基因工程菌以SEQ ID NO.5所示葡萄糖脱氢酶基因转入宿主菌E.coli BL21(DE3)构建而成。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体以干重比1～5:1混合；所述转化体系中，底物加入终浓度30～400g/L，葡萄糖加入终浓度30～400g/L，催化剂加入量以混合菌体总干重计为0.1～20g DCW/L。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体按如下方法制备：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10小时，以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含醛酮还原酶突变体基因的湿菌体。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶作为催化剂，以6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，添加NADPH，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～40℃、400～800rpm条件下进行反应，反应液分离纯化，获得6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转化体系中，纯酶加入量以蛋白含量计为0.01～1mg/mL，NADPH加入终浓度为0.5～5mM，底物加入终浓度为0.1～20mM。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述纯酶按如下方法制备：(1)将醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体按50g/L的量用pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液重悬，置于冰水混合物中，破碎10min；破碎条件：功率为350W，破碎1s，暂停1s，得到粗酶液；(2)将粗酶液经4℃、8000rpm条件下离心10min，去沉淀，上清液经0.22μm的滤膜过滤后，滤液作为上样液使用镍柱纯化酶蛋白，步骤为：
先用超纯水冲洗管路中的杂质与空气，并除去镍柱中的20％无水乙醇；
平衡基线：用5～10倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱，使基线平衡；所述结合缓冲液为含0.3M的NaCl的20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液；
样品上样：将滤液以0.25ml/min的流速上样；
洗脱杂蛋白：用5～10倍柱体积的冲洗缓冲液洗脱杂蛋白，流速1mL/min，直至基线平衡；所述冲洗缓冲液为含0.3M NaCl，20mM咪唑的20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液；
洗脱目的蛋白：用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速为1mL/min；当紫外吸收检测值相对于基线向上扬起时收集流出液，当紫外吸收检测值回到基线时停止收集，将收集的目的蛋白置于冰上保存；所述洗脱缓冲液为含0.3M NaCl，500mM咪唑的20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液；
透析：将收集的目的蛋白装入透析袋，置于pH 7.0、20mM的PBS溶液中，并放入4℃透析12h，透析完成后截留液即为纯酶。
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