CN110791484B - 一种草铵膦脱氢酶突变体及其在生产l-草铵膦中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草铵膦脱氢酶突变体及其在多酶偶联生产2‑氨基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑L‑丁酸铵中的应用，所述草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示氨基酸第375位进行单突变获得的。本发明制备的草铵膦脱氢酶突变体DyGDH‑V375S的比酶活较母本草铵膦脱氢酶提升了11‑12倍，最大底物2‑氨基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑D/L‑丁酸铵投料达到800mM，该草铵膦脱氢酶突变体更具工业应用前景。

Description

一种草铵膦脱氢酶突变体及其在生产L-草铵膦中的应用

技术领域

本发明涉及草铵膦脱氢酶DyGDH突变体的构建，开发草铵膦脱氢酶重组菌和酶在2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-L-丁酸铵(俗称L-草铵膦)手性生物合成方面的应用。

背景技术

草铵膦是世界上第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(现归属拜耳公司)开发生产，属磷酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

草铵膦活性介于草甘膦和百草枯之间，具有高活性、低毒易降解、环境友好等优势；另外，它还可以用于筛选抗草铵膦的转基因作物，因此它应用十分广泛，普遍受到市场青睐，未来也将具有广阔的市场前景。

草铵膦由一对具有旋光性的对应异构体混合而成，可以拆分为左旋体(顺式构型D)和右旋体(反式构型L)，其中只有L-草铵膦具有杀虫活性，且在土壤中易分解，对环境的破坏力小。

氨基酸脱氢酶超家族是一类NAD(P)H依赖型的氧化还原酶，其家族成员多是多亚基聚合体，单个亚基分子量从40KDa-120KDa不等，每个亚基都具有两个结构域(底物结合结构域和辅酶结合结构域)。氨基酸脱氢酶的底物谱一般比较严格，且催化产物大多是L-构型的，草铵膦脱氢酶即为氨基酸脱氢酶家族的一种，能够特异性催化草铵膦潜手性酮酸合成L-草铵膦。

我们从蒙氏假单胞菌Pseudomonas monteilii WP_060477601.1中克隆得到草铵膦脱氢酶基因，并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现该基因的异源过量表达，该酶能够与D-氨基酸氧化酶偶联利用“一锅法”催化D，L-草铵膦(2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵，D,L-PPT)转化为L-草铵膦，但该酶对其中间前手性酮酸产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸(PPO)的活力不够高，成为了“一锅法”过程中的限速步骤，从而限制了其工业化应用。本发明通过已报道的草铵膦脱氢酶晶体结构，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的与活性相关的氨基酸位点，通过定点突变技术提高了草铵膦脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的催化活力，解除了限速环节，进而提高了L-草铵膦的产量，具有较强的工业应用价值。

发明内容

本发明目的是针对现有草铵膦脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原活性不高的问题，提供一种草铵膦脱氢酶突变体及利用该草铵膦脱氢酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于L-草铵膦手性生物合成，该催化剂的活性提高了12倍，初始底物D,L-草铵膦浓度提高了8倍。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种草铵膦脱氢酶突变体，所述草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ IDNo.2所示氨基酸第375位进行单突变获得的。SEQ ID No.2所示氨基酸为母本草铵膦脱氢酶DyGDH₁，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

进一步，优选所述草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第375位缬氨酸突变为组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸或脯氨酸中的任一种；更优选将SEQ ID No.2所示氨基酸第375位缬氨酸突变为甘氨酸(DyGDH₁-V375G)或丝氨酸(DyGDH₁-V375S)或半胱氨酸(DyGDH₁-V375C)，最优选将SEQ ID No.2所示氨基酸第375位缬氨酸突变为丝氨酸。

本发明还涉及草铵膦脱氢酶突变体的编码基因、重组载体及工程菌。优选重组表达载体pETDuet；宿主细胞优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，通过蛋白诱导表达、细胞破碎获得粗酶液，催化特性均优于母本草铵膦脱氢酶。

本发明还涉及草铵膦脱氢酶突变体在制备草铵膦脱氢酶突变体-葡萄糖脱氢酶共表达基因工程菌中的应用，所述应用为：构建含所述草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优选大肠杆菌)，获得重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有草铵膦脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶的共表达工程菌菌体细胞，与野生型共表达细胞相比，具有更高的催化活性；所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.7；所述含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因重组载体pETDuet-DyGDH-EsGDH分别通过Vazyme的

MultiS One Step Cloning Kit进行构建。

本发明还提供一种所述草铵膦脱氢酶突变体在不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-L-丁酸铵(即L-草铵膦)中的应用，具体所述应用的方法为：以含草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的上清液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，偶联辅酶再生系统，不外源性添加辅酶，再加入助剂，以蒸馏水或缓冲液(优选pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液)为反应介质构成反应体系，在30-35℃、400-600rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-L-丁酸铵；所述辅酶再生系统由辅酶再生酶和辅酶再生底物构成，所述辅酶再生系统为下列之一：(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，构成包含NADPH和NADP⁺的葡萄糖脱氢酶再生系统；(2)以乙醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的乙醇脱氢酶辅酶再生系统；(3)以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐(优选甲酸铵)为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。其中，所述葡萄糖脱氢酶以葡萄糖脱氢酶基因与草铵膦脱氢酶突变体基因共表达基因工程菌形式加入，所述草铵膦脱氢酶突变体与葡萄糖脱氢酶基因共表达基因工程菌是将草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因共同导入宿主菌，构建含草铵膦脱氢酶突变体基因的共表达基因工程菌；所述乙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶分别以乙醇脱氢酶基因工程菌或甲酸脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的上清液的形式与催化剂混合；所述甲酸脱氢酶或乙醇脱氢酶基因工程菌湿菌体与草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体均以质量比1:2混合；所述助剂为硫酸铵或甲酸铵，当辅酶再生系统为甲酸脱氢酶再生系统时，助剂和辅酶再生底物均为甲酸铵；当辅酶再生系统为葡萄糖脱氢酶或乙醇脱氢酶时，助剂为硫酸铵。

进一步，所述反应体系中，底物终浓度100-800mM(优选800mM)，辅酶再生底物终浓度150mM-1.2M(优选1.2M)，助剂终浓度100mM-3.6M(优选1.2M)，催化剂和辅酶再生酶用量以破碎前湿菌体总重量计为10-100g/L(优选25g/L)。

进一步，所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶时，反应体系由草铵膦脱氢酶突变体基因与葡萄糖脱氢酶基因的共表达基因工程菌湿菌体或湿菌体破碎上清液作为催化剂、底物、辅酶再生底物和助剂构成，pH7.4；所述辅酶再生底物为葡萄糖，所述助剂为硫酸铵；所述上清液是将湿菌体用反应介质(优选pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液)重悬后超声破碎，取上清液。所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.7。

进一步，所述辅酶再生酶为乙醇脱氢酶时，反应体系由草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体与乙醇脱氢酶基因工程菌湿菌体以质量比2:1的混合菌体或混合菌体破碎(反应介质重悬)上清液作为催化剂、底物、辅酶再生底物和助剂构成，pH7.4；所述辅酶再生底物为异丙醇(优选终浓度1.2M)，所述助剂为硫酸铵(优选终浓度1.2M)；具体为：将草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌经诱导获得的湿菌体和乙醇脱氢酶基因工程菌经诱导获得的湿菌体以质量比2:1混合后用pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液重悬，经过超声破碎后取破碎上清液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，以异丙醇为辅酶再生底物，添加硫酸铵为助剂构成反应体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；底物终浓度100-800mM(优选800mM)，异丙醇终浓度150-1200mM(优选1200mM)，催化剂用量以破碎前湿菌体总量计为10-100g/L(优选37.5g/L)；助剂终浓度100mM-2.4M(优选1.2M)。所述乙醇脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.10。

进一步，所述辅酶再生酶为甲酸脱氢酶时，反应体系由草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体与甲酸脱氢酶基因工程菌湿菌体以质量比2:1的混合菌体或混合菌体破碎(反应介质重悬)上清液作为催化剂、底物、辅酶再生底物和助剂构成，pH7.4；所述助剂和辅酶再生底物均为甲酸铵(优选终浓度3.6M)，具体为：将草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌经诱导获得的湿菌体和甲酸脱氢酶基因工程菌经诱导获得的湿菌体以质量比2:1混合后用pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液重悬，经过超声破碎后取破碎上清液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，添加甲酸铵为辅酶再生底物和助剂构成反应体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；底物终浓度100-800mM(优选800mM)，甲酸铵终浓度1500-5000mM(优选3600mM)，催化剂用量以破碎前湿菌体总量计为10-100g/L(优选35-75g/L，最优选45g/L)。所述甲酸脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.8。

进一步，本发明所述超声破碎条件均为：在冰水混合物上超声破碎15分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停5秒。

进一步，所述含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的共表达基因工程菌湿菌体按如下方法制备：将含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的共表达基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，18℃培养20小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的共表达工程菌湿菌体。

进一步，所述含D-氨基酸氧化酶基因、甲酸脱氢酶基因或乙醇脱氢酶基因的工程菌湿菌体按如下方法制备：将所述含D-氨基酸氧化酶、甲酸脱氢酶基因或乙醇脱氢酶基因的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养12小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含D-氨基酸氧化酶基因、甲酸脱氢酶基因或乙醇脱氢酶基因的工程菌相应湿菌体。

进一步，所述纯酶制备方法为：将基因工程菌湿菌体用结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 7.4、100mM磷酸钠缓冲液)悬浮(悬浮用结合缓冲液体积以湿菌体计为10ml/g)，超声破碎20分钟(冰浴，功率400W，破碎1秒、暂停5秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清，作为样品；使用Ni亲和柱纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 7.4、100mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 7.4、100mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 7.4、100mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白，将目的蛋白置于pH 7.4、10mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，收集截留液，获得纯酶。

本发明还提供一种利用所述草铵膦脱氢酶突变体拆分2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-L-丁酸铵的应用，所述的应用为：以2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵为底物，以草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体偶联D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体或破碎上清液为催化剂，加入辅酶再生系统、过氧化氢酶和助剂，以蒸馏水或pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行拆分反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述助剂为硫酸铵或甲酸铵；所述辅酶再生系统为下列之一：(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，构成包含NADPH和NADP⁺的葡萄糖脱氢酶再生系统；(2)以乙醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的乙醇脱氢酶辅酶再生系统；(3)以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统；所述转化体系中，草铵膦脱氢酶突变体工程菌湿菌体、辅酶再生酶工程菌湿菌体和D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体总加入量为10-100g/L(优选35-80g/L)，底物终浓度100-800mM(优选800mM)，辅酶再生底物终浓度150-1200mM(优选1000-1200mM)，助剂终浓度为150-1200mM(优选1200mM)，过氧化氢酶终浓度为20-200U/L，其中葡萄糖脱氢酶以与草铵膦脱氢酶基因共表达形式加入，甲酸脱氢酶和乙醇脱氢酶以各自湿菌体与草铵膦脱氢酶湿菌体质量比2:1形式混合加入，所述D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体与草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体质量比为0.5-2:1。

更优选利用所述草铵膦脱氢酶突变体拆分2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-L-丁酸铵的应用：以2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵为底物，以草铵膦脱氢酶突变体基因共表达葡萄糖脱氢酶基因工程菌湿菌体偶联D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体或湿菌体破碎上清液为催化剂，加入葡萄糖为辅酶再生底物，以过氧化氢酶为助酶，以硫酸铵为助剂，以蒸馏水或pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行拆分反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；底物终浓度100-800mM(优选800mM)，葡萄糖终浓度150-1200mM(优选1000-1200mM)，硫酸铵终浓度为150-1200mM(优选1200mM)，催化剂用量以破碎前共表达湿菌体和D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体总量计为10-100g/L(优选35-80g/L，最优选45g/L)，所述过氧化氢酶加入终浓度为20-200U/L，优选100U/L。所述D-氨基酸氧化酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.9。具体所述的应用方法为：将草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的共表达基因工程菌经诱导获得的湿菌体和D-氨基酸氧化酶基因工程菌经诱导获得的湿菌体以重量比1:0.5-2混合后用pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液重悬，经过超声破碎后取破碎上清液为催化剂，以2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵(D,L-草铵膦)为底物，以葡萄糖为辅酶再生底物，以硫酸铵为助剂，外源性添加过氧化氢酶为助酶构成转化体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述草铵膦脱氢酶突变体基因共表达葡萄糖脱氢酶基因工程菌湿菌体与D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体重量比为1:0.5-2；所述底物终浓度为700-800mM，所述葡萄糖终浓度为1.0-1.2M，所述硫酸铵终浓度为1.0-1.2M，所述过氧化氢酶终浓度为100U/L。

本发明草铵膦脱氢酶母本DyGDH₁及草铵膦脱氢酶突变体碱基序列全长均为1341bp，从第一个碱基起至第1341个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA；草铵膦脱氢酶母本DyGDH₂及草铵膦脱氢酶突变体碱基序列全长均为1338bp，从第一个碱基起至第1338个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA；草铵膦脱氢酶母本DyGDH₃及草铵膦脱氢酶突变体碱基序列全长均为1338bp，从第一个碱基起至第1338个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

本发明所述草铵膦脱氢酶突变体的获取是采用定点饱和突变技术，使用该技术对所述SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6草铵膦脱氢酶基因进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用粗酶液催化中间产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备L-草铵膦，具体方法如下：第一步将原始菌活化，分别获得了母本E.coli BL21(DE3)pETDuet-dygdh_1,2,3-esgdh，提取质粒模板pETDuet-dygdh_1,2,3-esgdh，并保存待用。第二步通过NCBI与DyGDH比较，获得同源建模的模板蛋白PDB编号，在PDB数据库中查找模板蛋白晶体结构，利用Modeller9.20同源建模，并进行分子对接，选择合适的突变位点，选点主要是催化位点附近和底物结合口袋附近的氨基酸残基，设计突变的引物，分别以pETDuet-dygdh_1,2,3-esgdh为模板质粒，进行突变PCR，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，将优势突变体测序检测并保存。

本发明草铵膦脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶基因共表达基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。所述葡萄糖脱氢酶来源于Exiguobacteriumsibiricum，葡萄糖脱氢酶基因序列号(GenBank：No.KM817194.1)，所用载体pETDuet-1，构建重组共表达载体pETDuet-dygdh_1,2,3-esgdh。所述D-氨基酸氧化酶来源于yeastRhodotorula gracilis，D-氨基酸氧化酶基因序列号(GenBank：NO.XM_016418953.1)，所用载体pET-24b(+)，构建重组表达载体pET-24b-daao。所述甲酸脱氢酶来源于Lactobacillus buchneri，甲酸脱氢酶基因序列号(GenBank：No.WP_013726924.1，所用载体pET-28b(+)，构建重组表达载体pET-28b-fdh。将来源于布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)ATCC 14869＝DSM 20054的乙醇脱氢酶(GenBank：No.CAD66648.1，核苷酸序列为SEQ ID No.10)，用载体pET-28b(+)，构建重组表达载体pET-28b-adh，以E.coli BL21(DE3)为宿主菌，构建工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-adh。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明制备的草铵膦脱氢酶突变体DyGDH₁-V375S的比酶活较母本草铵膦脱氢酶提升了12倍；解除了“一锅法”过程中的限速步骤，最大初始底物2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵投料达到800mM，较突变前提高了8倍，该草铵膦脱氢酶突变体更具工业应用前景。

附图说明

图1是草铵膦脱氢酶突变体偶联D-氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶手性拆分2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备L-草铵膦的反应示意图。

图2是草铵膦脱氢酶突变体偶联葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、乙醇脱氢酶不对称胺化还原中间产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦的反应示意图。

图3是草铵膦脱氢酶定点饱和突变的核酸电泳图。M：标准核酸分子量；泳道1：pETDuet-dygdh₁-esgdh；泳道2：pETDuet-dygdh₁/V375-esgdh；泳道3：pETDuet-dygdh₂-esgdh；泳道4：pETDuet-dygdh₂/V375-esgdh；泳道5：pETDuet-dygdh₃-esgdh；泳道6：pETDuet-dygdh₃/V375-esgdh；

图4是草铵膦脱氢酶突变体粗酶液(A)和纯酶液(B)的SDS-PAGE图。M：标准蛋白分子量；泳道1：pDyGDH₁-EsGDH；泳道2：pDyGDH₁/V375S-EsGDH；泳道3：pDyGDH₁/V375G-EsGDH泳道4：pDyGDH₁/V375C-EsGDH；泳道5：pDyGDH₂-EsGDH；泳道6：pDyGDH₂/V375S-EsGDH；泳道7：pDyGDH₂/V375G-EsGDH泳道8：pDyGDH₂/V375C-EsGDH；泳道9：pDyGDH₃-EsGDH；泳道10：pDyGDH₃/V375S-EsGDH；泳道11：pDyGDH₃/V375G-EsGDH泳道12：pDyGDH₃/V375C-EsGDH。

图5是利用草铵膦脱氢酶突变体共表达葡萄糖脱氢酶不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸铵制备L-草铵膦时间进程图。

图6是利用草铵膦脱氢酶突变体，偶联甲酸脱氢酶不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦时间进程图。

图7是利用草铵膦脱氢酶突变体，偶联乙醇脱氢酶不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦时间进程图。

图8是利用草铵膦脱氢酶母本共表达葡萄糖脱氢酶，偶联D-氨基酸氧化酶“一锅法”手性拆分D,L-草铵膦制备L-草铵膦。

图9是利用草铵膦脱氢酶突变体共表达葡萄糖脱氢酶，偶联D-氨基酸氧化酶“一锅法”手性拆分D,L-草铵膦制备L-草铵膦。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

实施例1：草铵膦脱氢酶突变体文库的构建及筛选

将从蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)WP_060477601.1中克隆得到的草铵膦脱氢酶基因dygdh₁(核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，氨基酸序列SEQ ID No.2所示)、从Pseudomonas japonicaWP_042124798.1克隆得到的草铵膦脱氢酶基因dygdh₂(核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，氨基酸序列SEQ ID No.4所示)、从Thiopseudomonas denitrificansWP_101496154克隆得到的草铵膦脱氢酶基因dygdh₃(核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，氨基酸序列SEQ ID No.6所示)，分别构建表达载体pETDuet-dygdh₁，pETDuet-dygdh₂，pETDuet-dygdh₃，保留载体本身的His-Tag基因，转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，分别获得草铵膦脱氢酶母本工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-dygdh₁(记为pDyGDH₁)、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-dygdh₂(记为pDyGDH₂)、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-dygdh₃(记为pDyGDH₃)。

再从微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)ZJBML01011中克隆得到葡萄糖脱氢酶基因esgdh(核苷酸序列为SEQ ID No.7所示)，通过Vazyme的

MultiS OneStep Cloning Kit分别构建至重组表达载体pETDuet-dygdh₁，pETDuet-dygdh₂，pETDuet-dygdh₃上，分别获得共表达载体pETDuet-dygdh₁-esgdh，pETDuet-dygdh₂-esgdh，pETDuet-dygdh₃-esgdh，转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，分别获得草铵膦脱氢酶母本与葡萄糖脱氢酶出发共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-dygdh₁-esgdh，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-dygdh₂-esgdh，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-dygdh₃-esgdh。

草铵膦脱氢酶突变体文库的制备通过1轮定点饱和突变来实现，引物设计如表1，分别以载体pETDuet-dygdh₁-esgdh，pETDuet-dygdh₂-esgdh，pETDuet-dygdh₃-esgdh为模板，分别以表1中序列(V₁375、V₂375、V₃375)为引物，经饱和突变PCR，将SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6所示草铵膦脱氢酶氨基酸序列的第375位缬氨酸突变为其余19种氨基酸，同出发菌株共表达载体构建方法，构建突变体共表达载体，并转化E.coli BL21(DE3)，涂布含50μg/mL氨苄霉素的LB平板，挑取菌株按实施例3方法进行优势菌株筛选，获得草铵膦脱氢酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达菌株

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375S-EsGDH、

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₂/V375S-EsGDH、

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₃/V375S-EsGDH、

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375G-EsGDH、

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₂/V375G-EsGDH、

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₃/V375G-EsGDH、

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375C-EsGDH、

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₂/V375C-EsGDH、

E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₃/V375C-EsGDH。

同样条件下，构建没有共表达葡萄糖脱氢酶的草铵膦脱氢酶突变体工程菌及草铵膦脱氢酶出发工程菌。

突变PCR体系(100μL)为：2倍Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μL，补ddH₂O至50μL。PCR条件为：95℃预变性5分钟，经30个循环：90℃30秒，62℃30秒，72℃7分钟，最后72℃终延伸5分钟。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行DpnI酶消化模板，37℃，1小时，220转/分钟，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)活化，置于37℃、220转/分钟，培养1小时，涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，对获得的突变体按实施例3方法进行优势突变体的筛选，将获得的优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司进行测序确认，并保存。

表1草铵膦脱氢酶定点饱和突变引物设计

实施例2：草铵膦脱氢酶母本工程菌、草铵膦脱氢酶突变体工程菌、甲酸脱氢酶工程菌、D-氨基酸氧化酶工程菌、乙醇脱氢酶工程菌的诱导表达

1、工程菌构建

D-氨基酸氧化酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pET24b-daao的构建：

将来源于羸弱红酵母(yeastRhodotorula gracilis)的D-氨基酸氧化酶基因序列(GenBank：NO.XM_016418953.1，核苷酸序列为SEQ ID No.9)，导入载体pET-24b(+)，构建重组表达载体pET-24b-daao，以E.coli BL21(DE3)为宿主菌，构建工程菌E.coli BL21(DE3)/pET24b-daao。

甲酸脱氢酶工程菌构建：

将来源于布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的甲酸脱氢酶基因序列(GenBank：No.WP_013726924.1，核苷酸序列为SEQ ID No.8)，用载体pET-28b(+)，构建重组表达载体pET-28b-fdh，以E.coli BL21(DE3)为宿主菌，构建工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-fdh。

乙醇脱氢酶工程菌的构建：

将来源于布氏乳杆菌(Lactobacillus brevis)ATCC 14869＝DSM 20054的乙醇脱氢酶基因序列(GenBank：No.CAD66648.1，核苷酸序列为SEQ ID No.10)，用载体pET-28b(+)，构建重组表达载体pET-28b-adh，以E.coli BL21(DE3)为宿主菌，构建工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-adh。

2、诱导表达

将实施例1中的草铵膦脱氢酶母本工程菌、草铵膦脱氢酶突变体工程菌、草铵膦脱氢酶母本与葡萄糖脱氢酶出发共表达菌株和草铵膦脱氢酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达菌株分别接种到含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养8小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，18℃培养20小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体。

将D-氨基酸氧化酶工程菌E.coli BL21(DE3)/pET24b-daao接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养2小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含D-氨基酸氧化酶的湿菌体。

甲酸脱氢酶湿菌体、乙醇脱氢酶湿菌体的获得同D-氨基酸氧化酶制备方法相同。

以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化手性拆分D,L-草铵膦制备L-草铵膦。

实施例3：突变文库筛选

以实施例2方法制备的草铵膦脱氢酶母本与葡萄糖脱氢酶出发共表达湿菌体或草铵膦脱氢酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达湿菌体为催化剂，以中间产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，以葡萄糖为辅酶再生底物，加入硫酸铵，不添加外源性NADPH或NADP+，运用菌体内源性NADPH，以pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系，催化剂用量以湿菌体终浓度计25g/L，底物终浓度300mM，葡萄糖终浓度450mM，硫酸铵终浓度750mM，30℃、600转/分钟反应5min，取反应液100μL，加5μL盐酸终止反应，以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，取200μl稀释后的反应液+400μL衍生化试剂(含15mM邻苯二甲醛、15mM N-乙酰-L-半胱氨酸的pH9.8的硼酸缓冲液)30℃衍生化5min，再加400μL超纯水补足至1mL，12000转/分钟离心1分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，收集滤液作为液相样品，HPLC检测2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸、L-草铵膦、D-草铵膦及e.e.值。以产物L-草铵膦和e.e.为指标，筛选优势突变体，实验结果示于表2。

2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸液相检测条件：色谱柱

C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相乙腈：50mM磷酸二氢铵溶液(pH3.8，含10％四丁基氢氧化铵)体积比为12:88。流速为1mL/min，检测波长为232nm，进样量10μL，柱温30℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸保留时间为：9.7分钟。

草铵膦液相检测条件：色谱柱

C18(4.6×250mm，Acchrom，China)柱，流动相甲醇:0.05M乙酸铵(pH5.7)体积比为10:90，流速1.0mL/min，检测波长Ex＝＝340nm、Em＝450nm，进样量10μL，柱温35℃。L-草铵膦、D-草铵膦、保留时间分别为：10.6分钟，12.6分钟。

表2pDyGDH及其突变体的催化性能和立体选择性

实施例4：草铵膦脱氢酶母本及其突变体的纯化

将实施例1构建的草铵膦脱氢酶工程菌及优势突变体(表2中pDyGDH_1,2,3-V375C，pDyGDH_1,2,3-V375G，pDyGDH_1,2,3-V375S)按实施例2方法制备相应湿菌体。分别取草铵膦脱氢酶母本工程菌及草铵膦脱氢酶突变体工程菌的湿菌体各2g，分别用20ml结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 7.4、100mM磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎20分钟(冰浴，功率400W，破碎1秒、暂停5秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清，作为样品。使用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化蛋白，具体操作如下：①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 7.4、50mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH7.4、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 7.4、50mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH 7.4、20mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，收集截留液，分别获得草铵膦脱氢酶母本纯酶10ml和草铵膦脱氢酶突变体纯酶10ml；⑤5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗Ni柱直至基线稳定，用5倍柱体积含20％乙醇的超纯水保存Ni柱。

实施例5：草铵膦脱氢酶母本及其突变体比酶活测定

酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 7.4条件下，每分钟每生成1μmol的L-草铵膦所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。

酶活检测标准条件：100mM 2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，10mM NADPH，0.02ug/uL的酶液(实施例4方法制备)，30℃、pH7.4，600转/分钟条件下反应10分钟，采用实施例3方法进行HPLC检测分析。

蛋白浓度用BCA蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定，如表3所示。

表3草铵膦脱氢酶母本及其突变体比酶活

a：在标准条件下，每个草铵膦脱氢酶母本的初始酶活均指定为100％。

实施例6：草铵膦脱氢酶母本及其突变体动力学参数测定

考察草铵膦脱氢酶母本及其突变体的动力学参数，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸作为底物，浓度设置为2-10mM(2、4、6、8、10mM)，外源性辅酶NADPH浓度设置为1-5mM(1、2、3、4、5mM)，加入100uL的纯酶液(实施例4方法收集)。

反应体系选择为500μL，实施例4收集的纯酶液以pH7.4、100mM磷酸盐缓冲液稀释10倍后取100uL，加入底物和外源性辅酶NADPH，pH 7.4、100mM磷酸盐缓冲液为反应介质，35℃、600转/分钟反应10min取样，取反应液HPLC检测L-草铵膦浓度(同实施例3)。

根据草铵膦脱氢酶催化反应机制遵循顺序强制反应机制，通过双倒数作图可计算得出v_max、K_m ^A、K_m ^B，结果如表4所示，通过比较k_cat和K_m，可以发现，pDyGDH₁对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸和NADPH的Km值分别是3.45mM、0.11mM，其余突变体对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸和NADPH的亲和力有增加趋势。突变体pDyGDH₁-V375S对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的催化效率k_cat/K_m ^B达到33.40s^-1·mM^-1，较母本(k_cat/K_m ^B＝12.41s^-1·mM^-1)提高3倍，对辅酶NADPH的催化效率达到5345s^-1·mM^-1，较母本(k_cat/K_m ^A＝385.67s^-1·mM^-1)提高13.8倍。

表4母本pDyGDH及其突变体动力学参数比较

实施例7：草铵膦脱氢酶突变体pDyGDH₁-V375S偶联葡萄糖脱氢酶不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸

将实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375S-EsGDH湿菌体1g，用40mL、pH 7.4、磷酸缓冲液(100mM)重悬，加入终浓度800mM的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，终浓度1.2M的葡萄糖，终浓度1.2M硫酸铵构成反应体系40mL，在35℃、磁力搅拌转速为300rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4。以实施例3所示液相方法检测反应过程中产物L-草铵膦的生成和e.e.值的变化，反应进程曲线如图5所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，2h内反应完成，底物转化率大于99％，产物e.e.值始终保持在99.5％以上，说明突变体pDyGDH₁-V375S催化中间产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸效果明显。

实施例8：草铵膦脱氢酶突变体pDyGDH₁-V375S偶联甲酸脱氢酶不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸

将实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375S湿菌体1.2g和甲酸脱氢酶湿菌体0.6g混合，用40mL、pH 7.4、磷酸缓冲液(100mM)重悬，按照实施例4方法将细胞破碎，取上清得到含相应酶的粗酶液，加入终浓度800mM的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，终浓度3.6M的甲酸铵构成反应体系40mL，在35℃、磁力搅拌转速为300rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4。以实施例3所示液相方法检测反应过程中产物L-草铵膦的生成和e.e.值的变化，反应进程曲线如图6所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，4h内反应完成，底物转化率大于99％，产物e.e.值始终保持在99.5％以上，说明突变体pDyGDH₁-V375S偶联甲酸脱氢酶催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的效果明显。

实施例9：草铵膦脱氢酶突变体pDyGDH₃-V375S偶联乙醇脱氢酶不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸

将实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375S湿菌体1g和乙醇脱氢酶湿菌体0.5g，用40mL、pH 7.4、磷酸缓冲液(100mM)重悬，按照实施例4方法将细胞破碎，取上清液，得到相应的含草铵膦脱氢酶突变体和乙醇脱氢酶的粗酶液，加入终浓度800mM的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，终浓度1.2M的异丙醇，终浓度1.2M硫酸铵构成反应体系40mL，在35℃、磁力搅拌转速为300rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4。以实施例3所示液相方法检测反应过程中产物L-草铵膦的生成和e.e.值的变化，6h内反应完成，如图7所示。底物转化率大于99％，产物e.e.值大于99.5％，说明突变体pDyGDH₁-V375S偶联乙醇脱氢酶催化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸效果明显。

实施例10：在2L反应釜中以草铵膦脱氢酶突变体pDyGDH_1-V375S偶联葡萄糖脱氢酶不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦

1、在2L反应釜中以草铵膦脱氢酶突变体pDyGDH_1-V375S-EsGDH不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草酸膦

将实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375S-EsGDH的湿菌体50g用蒸馏水洗涤3遍，加入2L反应釜中，向其中加入284.9g的2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸(终浓度800mM)，475.6g葡萄糖(终浓度1.2M)，317.14g硫酸铵(终浓度1.2M)，以蒸馏水为溶剂构成反应体系2000ml，在35℃、磁力搅拌转速为500rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4。反应2h以后，获得反应液，按照实施例3所示液相方法检测L-草铵膦以及底物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸。其结果显示，L-草铵膦与2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的比值大于90％，产物L-草铵膦e.e.值始终保持在99％以上。

2、从含2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸、L-草铵膦的反应液中分离纯化得到高纯度L-草铵膦

步骤1反应结束后，将反应液8000rpm离心30min，取上清进一步加热至90℃，保持10min，然后迅速下降至20-30℃，8000rpm离心10min，以除去反应液中少量的不溶物。取上清加入适量的37％HCl溶液调pH至1.0，得到预处理液。

分别使用已经预处理好的DOWEX、50WX8阳离子交换树脂各2kg与预处理液1500ml混合30min，然后用过滤器将树脂分离出来，将两部分树脂混合，先用水清洗，然后再用4MNH₄OH水溶液洗脱，取样进行茚三酮显色反应(反应过程为取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，用吹风机吹干，若滤纸上出现紫色，则表示流出液含有L-草铵膦，若无紫色则表示流出液没有L-草铵膦)，收集流出液(茚三酮反应显紫色的一段时间的流出液)，洗脱至洗脱液中不含有底物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸。

收集到的流出液1500ml用6000ml水稀释，加入4M NH₄OH水溶液调节pH接近9，加入处理过的DOWEX树脂1.0kg，搅拌约40分钟，装到玻璃柱(高径比15:1)上，向柱上加入800mL水，用0.1M醋酸水溶液洗脱，收集全部流出液，减压浓缩至恒重(269.3g)，加入200ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.0g聚丙烯酰胺，加热至30℃使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重251.78g，计算收率为79％，纯度为99％。

实施例11：草铵膦脱氢酶母本pDyGDH₁偶联葡萄糖脱氢酶、D-氨基酸氧化酶“一锅法”手性拆分2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备L-草铵膦。

将实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁-EsGDH的湿菌体1g与D-氨基酸氧化酶菌体2g，并用40ml、pH7.4、磷酸缓冲液(100mM)重悬，按照实施例4方法破碎，取上清得到粗酶液为催化剂，加入终浓度100mM的2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵，终浓度100U/L过氧化氢酶干粉(购自Sigma公司)，终浓度150mM的葡萄糖、终浓度150mM的硫酸铵构成转化体系40ml，在30℃、磁力搅拌转速为500rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4。以实施例3所示液相方法检测反应过程中底物的消耗、产物L-草铵膦的生成，反应进程曲线如图8所示。反应液中D-草铵膦浓度逐渐降低，产物L-草铵膦浓度随时间的推移而逐渐升高，反应8h后实现外消旋草铵膦的完全拆分。

实施例12：草铵膦脱氢酶突变体pDyGDH₁-V375S偶联葡萄糖脱氢酶、D-氨基酸氧化酶“一锅法”手性拆分2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备L-草铵膦。

1、将实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375S-EsGDH的湿菌体1g与D-氨基酸氧化酶菌体2g，并用40ml、pH7.4、磷酸缓冲液(100mM)重悬，按照实施例4方法破碎，取上清得到粗酶液为催化剂，加入终浓度800mM的2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵，终浓度100U/L过氧化氢酶干粉，终浓度1.2M的葡萄糖、终浓度1.2M的硫酸铵构成转化体系40ml，在30℃、磁力搅拌转速为500rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4。以实施例3所示液相方法检测反应过程中底物的消耗、产物L-草铵膦的生成，反应进程曲线如图9所示。反应液中D-草铵膦浓度逐渐降低，产物L-草铵膦浓度随时间的推移而逐渐升高。说明突变体pDyGDH₁-V375S在“一锅法”中的催化效果明显。与实施例11相比，初始底物D,L-草铵膦浓度提高了8倍。

2、从含D/L-PPT、2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的反应液分离纯化得到较高纯度L-草铵膦

采用实施例10方法，将实施例12步骤1中的反应液收集起来，8000rpm离心30min，取上清进一步加热至90℃，保持10min，然后迅速下降至20-30℃，8000rpm离心10min，以除去反应液中少量的不溶物。取上清加入适量的37％HCl溶液，调pH至1.0，得到预处理液。

使用已经预处理好的DOWEX、50WX8阳离子交换树脂各2份对预处理液按顺序进行处理，每次将溶液和树脂混合30min，然后用过滤器将树脂分离出来，将两部分树脂混合，先用水清洗，然后再用4M NH₄OH洗脱，洗脱至洗脱液中不含有中间产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸。

收集到的洗脱液用水稀释，加入4M NH₄OH调节pH接近9，加入处理过的DOWEX树脂1.0kg，搅拌约40分钟，加入等量的DOWEX树脂后装到玻璃柱上，向柱上加入800mL水，用0.1M醋酸洗脱，得到L-草铵膦流出液。

L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(235.45g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重226.78g，计算收率为85％，纯度为90％。

实施例13：在2L反应釜中以草铵膦脱氢酶突变体pDyGDH₁-V375S偶联葡萄糖脱氢酶、D-氨基酸氧化酶“一锅法”手性拆分2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备L-草酸膦。

1、将实施例2方法制备的E.coli BL21(DE3)/pDyGDH₁/V375S-EsGDH的湿菌体50g与D-氨基酸氧化酶湿菌体25g，用超纯水洗涤3遍，加入2L反应釜中，向其中加入277.2g的2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵(终浓度700mM)，396.4g葡萄糖(终浓度1M)，终浓度100U/L过氧化氢酶干粉，264.28g硫酸铵(终浓度1M)，以蒸馏水为溶剂构成转化体系2L，在30℃、磁力搅拌转速为500rpm下进行反应，流加氨水使反应液pH维持在7.4，反应过程中额外通入0.3VVM(每分钟单位反应体积中氧气的体积)的氧气，加入10ml异丙醇来消除反应过程中产生的气泡。反应8h以后，按照实施例3所示液相方法检测D-草铵膦、L-草铵膦以及中间产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸。其结果显示，L-草铵膦与中间产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的比值大于90％，产物L-草铵膦e.e.值在99％以上，产率大于123g/L。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种草铵膦脱氢酶突变体及其在生产L-草铵膦中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1341

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgattgaaa gcgtcgactc atttttagca cgcttacaac aacgcgatcc aggtcaacct 60

gagtttcacc aagccgtgga ggaagttctg cgcacgttgt ggccgtttct ggaagccaac 120

ccgcgctatt tgcaaagcgg tatcctggaa cgtatggtcg agccagaacg tgctgtcttg 180

tttcgcgtaa gctgggtaga cgaccaaggg aaagttcagg tgaaccgtgg ttatcgtatt 240

caaatgagca gcgcgattgg accctataag ggaggtttgc gttttcaccc ttccgtgaat 300

ctgagtgtac tgaaattctt ggcctttgaa caagttttta aaaattcgct gacttccctt 360

cctatgggag ggggtaaggg gggatctgat tttgatccga agggtaaatc tgacgcggag 420

gtaatgcgct tttgccaggc gtttatgtcg gagttgtacc gccacattgg ggcggactgc 480

gacgtgccag cgggggatat tggagtagga gcccgcgaga ttgggtttat gttcggacaa 540

tacaagcgtt tggcaaatca attcacatcg gttttgaccg ggaaagggat gacgtatggg 600

ggcagtttaa ttcgtcctga agcaacggga tacggttgcg tatacttcgc ggaggaaatg 660

cttaaacgtc aaggccttcg cgtagatggc cgccgcgttg ctatcagcgg ctctgggaac 720

gtcgctcagt atgcagcgcg caaagtgatg gacttgggcg gcaaagtcat ctctctttcc 780

gattcggaag gtaccttata tgcagagggt gggttgaccg aagcacaatg ggaagcggtg 840

atgcaattga aaaacgtagc gcgcggacgc atttcagagc ttgctgaagc cttcggtctg 900

gaattccgca agggccagac tccgtggagc ttaccatgtg acattgcatt gccgtgtgcg 960

acgcaaaatg agctgggtat cgaagatgcg cgcacccttc ttcgcaatgg ttgtatttgc 1020

gtggctgagg gagctaatat gccgacgacg ttggccgcgg tggacctgtt catcgacgct 1080

ggtatccttt atgcaccggg aaaggcaagt aacgctggcg gtgtggccgt ttcggggtta 1140

gagatgagtc aaaacgcgat gcgtcttctt tggacagcgg gcgaagtcga tagcaagttg 1200

cataatatta tgcagtccat tcaccatgcc tgtgttcact atggtgagga ggctgacgga 1260

aaagtgaatt acgttaaagg agctaacatt gcgggctttg ttaaagtcgc cgacgcaatg 1320

cttgcccagg gagtagtcta a 1341

<210> 2

<211> 446

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Ile Glu Ser Val Asp Ser Phe Leu Ala Arg Leu Gln Gln Arg Asp

1 5 10 15

Pro Gly Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Thr

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro Arg Tyr Leu Gln Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Ala Val Leu Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp Gln Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

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Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Cys

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Phe

165 170 175

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Thr Gly Lys Gly Met Thr Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

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Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Gln

210 215 220

Gly Leu Arg Val Asp Gly Arg Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Glu Gly Gly Leu

260 265 270

Thr Glu Ala Gln Trp Glu Ala Val Met Gln Leu Lys Asn Val Ala Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Ser Glu Leu Ala Glu Ala Phe Gly Leu Glu Phe Arg Lys

290 295 300

Gly Gln Thr Pro Trp Ser Leu Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Gly Ile Glu Asp Ala Arg Thr Leu Leu Arg Asn

325 330 335

Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Ala

340 345 350

Ala Val Asp Leu Phe Ile Asp Ala Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Ala Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu

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His Asn Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Ala Asp Gly Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly

420 425 430

Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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caaatgtcat ccgctatcgg tccgtataaa ggcgggttgc gctttcaccc gtcagtcaat 300

atcggggtgc tgaaatttct ggcgttcgag caggttttta agaacagttt aacttcattg 360

cctatgggcg gtggaaaggg gggttcggat tttgatccca aggggaagag cgatgcagag 420

gtcatgcgtt tctgccaagc atttatgtct gaattgtacc gccatatcgg agctgactta 480

gatgtaccag ccggcgacat tggtgtcggt gcacgtgaga tcgggtttat gtttgggcaa 540

tataagcgct tggctaatca gttcactagc gtgttaacag gtaaaggaat gaactacggt 600

ggttcattaa tccgccctga ggcgaccggg tacggttgcg tctatttcgc agaagaaatg 660

cttaaacgtg aggataaacg catcgatggt cgtcgtgtcg ccatctctgg tagtggtaac 720

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<212> PRT

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Pro Ala Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser

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Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro His Tyr Leu Glu Ala Gly Ile

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Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Phe

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Asp Lys Arg Ile Asp Gly Arg Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

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Thr Asp Glu Gln Trp Asn Ala Leu Met Glu Leu Lys Asn Val Lys Arg

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Gly Arg Leu Ser Glu Leu Ala Thr Gln Phe Gly Leu Glu Phe Arg Ala

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Gly Gln Arg Pro Trp Asn Leu Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

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Thr Gln Asn Glu Leu Asp Leu Ala Asp Ala Arg Ala Leu Leu Ala Asn

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Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

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<211> 1338

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

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gcgtttggcc cggttagcac cctggttaac aacgcgggta ttgcggtgaa caagagcgtt 300

gaggaaacca ccaccgcgga gtggcgtaaa ctgctggcgg tgaacctgga tggtgttttc 360

tttggcaccc gtctgggtat ccaacgtatg aagaacaaag gtctgggcgc gagcatcatt 420

aacatgagca gcattgaagg tttcgttggt gacccgagcc tgggtgcgta caacgcgagc 480

aagggtgcgg ttcgtatcat gagcaaaagc gcggcgctgg attgcgcgct gaaggactac 540

gatgtgcgtg ttaacaccgt gcacccgggc tatattaaaa ccccgctggt tgacgatctg 600

ccgggtgcgg aggaagcgat gagccagcgt accaagaccc cgatgggtca catcggcgaa 660

ccgaacgaca tcgcgtacat ttgcgtttat ctggcgagca acgagagcaa attcgcgacc 720

ggtagcgaat ttgtggttga tggtggctat accgcgcaat aa 762

Claims (9)

1.一种草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于所述草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第375位缬氨酸突变为丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸中的任一种。

2.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

3.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体在不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的上清液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，偶联辅酶再生系统，再加入助剂，以蒸馏水或缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-35℃、400-600rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述助剂为硫酸铵或甲酸铵；所述辅酶再生系统由辅酶再生酶基因工程菌湿菌体和辅酶再生底物构成，所述辅酶再生系统为下列之一：(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，构成包含NADPH和NADP⁺的葡萄糖脱氢酶再生系统；(2)以乙醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的乙醇脱氢酶辅酶再生系统；(3)以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物终浓度100-800mM，辅酶再生底物终浓度150mM-1.2M，助剂终浓度100mM-3.6M，催化剂和辅酶再生酶用量以破碎前湿菌体总重量计为10-100g/L。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶以葡萄糖脱氢酶基因与草铵膦脱氢酶突变体基因共表达基因工程菌形式加入；所述乙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶分别以乙醇脱氢酶基因工程菌或甲酸脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的上清液的形式与催化剂混合；所述甲酸脱氢酶或乙醇脱氢酶基因工程菌湿菌体与草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体以质量比1:2混合。

7.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体在手性拆分2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备L-草铵膦中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵为底物，以草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体偶联D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体或破碎上清液为催化剂，加入辅酶再生系统、过氧化氢酶和助剂，以蒸馏水或pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行拆分反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述助剂为硫酸铵或甲酸铵；所述辅酶再生系统由辅酶再生酶基因工程菌湿菌体和辅酶再生底物构成，所述辅酶再生系统为下列之一：(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，构成包含NADPH和NADP⁺的葡萄糖脱氢酶再生系统；(2)以乙醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的乙醇脱氢酶辅酶再生系统；(3)以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统；所述转化体系中，草铵膦脱氢酶突变体工程菌湿菌体、辅酶再生酶工程菌湿菌体和D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体总加入量为10-100g/L，底物终浓度100-800mM，辅酶再生底物终浓度150-1200mM，助剂终浓度为150-1200mM，过氧化氢酶终浓度为20-200U/L，其中葡萄糖脱氢酶以与草铵膦脱氢酶基因共表达形式加入，甲酸脱氢酶和乙醇脱氢酶以各自湿菌体与草铵膦脱氢酶湿菌体质量比2:1形式混合加入，所述D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体与草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体质量比为0.5-2:1。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：以2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵为底物，以草铵膦脱氢酶突变体基因共表达葡萄糖脱氢酶基因工程菌湿菌体偶联D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体为催化剂，加入葡萄糖、过氧化氢酶和硫酸铵，以蒸馏水或pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行拆分反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦。

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