CN111019982A - 一种利用羟基酸脱氢酶制备l-草铵膦的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用羟基酸脱氢酶制备L‑草铵膦的方法，以2‑羟基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，经羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶两步催化制备L‑草铵膦。本发明具有以下有益效果：(1)本发明方法以2‑羟基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经由羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶组成的酶催化体系催化获得产物L‑草铵膦，实现了辅酶的自循环、无需要额外的辅酶再生系统以及辅酶再生原料。(2)本发明方法构建了一种全新的生物(酶)催化体系用于生产L‑草铵膦；这种生物催化体系制备L‑草铵膦的工艺路线目前尚未见报导。(3)本发明方法的最终产品中没有任何副产物的生成，从而极大地简化了L‑草铵膦的后续精制工艺，提高了产品总收率。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种利用羟基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法。
背景技术
草铵膦(Phosphinothricin，又名Glufosinate)是一种含磷氨基酸类除草剂，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是全球第三大灭生性除草剂及第二大转基因作物除草剂，其具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等特点，被广泛应用于非耕地、免耕地、农田作物、水生田等杂草的防除。
草铵膦存在两种光学构型，但只有L-型具有除草活性(Herbicidal compositions[P].Patent application US4265654A，1981)，而且在土壤中易于降解，对环境的危害较小。目前市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物，如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这将极大地提高原子经济性、降低生产和使用成本、减轻环境压力。因此，开发一种低成本、可工业化的L-草铵膦生产方法，具有极其重要的经济价值和社会价值。
制备光学纯L-草铵膦的方法主要有三种：化学不对称合成法、手性拆分法以及生物催化法。化学不对称合成法从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦，多见于实验室研究中，其工艺步骤多、收率低，所用不对称合成试剂和催化剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。手性拆分法则存在以下固有缺点，一是需要使用手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋再利用，三是单次拆分收率低，四是工艺比较复杂。
相比之下，生物催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高以及产物易分离纯化等优点，是生产L-草铵膦的潜在优势方法。这类反应中的代表就是酶催化的转氨基作用和酶催化的还原胺化，涉及到的酶分别为转氨酶和氨基酸脱氢酶。
Hoechst公司的研究人员对转氨酶工艺做了一系列研究，产品L-草铵膦浓度最高可达420mM，ee值达到99.9％(Schultz A,Taggeselle P,Tripier D,et al.Applied andEnvironmental Microbiology.Jan 1990,56(1):1-6)。中国专利CN1349561筛选得到了能够特异性地催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)的草酰乙酸转氨酶，可直接利用L-天冬氨酸为氨基供体进行转氨基反应，当底物PPO的浓度为552mmol/L、在消耗大约700mmol/L的L-天冬氨酸的情况下，只生成251.9mmol/L的产物L-草铵膦，与此同时生成了大约234.5mmol/L的杂质丙氨酸，原料PPO的转化率只有52％。此外，中国专利CN105603015公开了一种利用L-丙氨酸为氨基供体、采用特定转氨酶制备L-草铵膦的方法，原料转化率达100％，丙氨酸与底物PPO的摩尔比为1:1～6:1。总的来说，转氨酶虽然具有催化活力高、立体选择性良好等优点，但也存在两大致命缺陷，其一是转氨酶催化的反应为可逆反应，原料PPO不能完全转化为L-草铵膦，只有在过量氨基供体存在的条件下才能达到完全转化；其二是过量的氨基供体残余、以及氨基供体反应后生成的酮酸副产物都给产品的分离精制带来了很大的麻烦。
基于此，中国专利CN106916857公开了一种由转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生系统组成的三酶催化体系制备L-草铵膦，此发明方法在利用转氨酶催化活力高、立体选择性强等优点的同时，使用谷氨酸脱氢酶循环再生氨基供体L-谷氨酸，使用辅酶再生酶在消耗额外的辅酶再生底物的同时、为谷氨酸脱氢酶提供辅酶的循环再生。由此解决了转氨酶催化反应不彻底的难题，底物PPO能完全地转化为L-草铵膦，转化率可达100％，氨基供体L-谷氨酸使用量极低、且没有副产物α-酮戊二酸的积累。
另外，应用氨基酸脱氢酶制备L-草铵膦方面，最早的报道是Fang等人利用谷氨酸脱氢酶(一种氨基酸脱氢酶)和葡萄糖脱氢酶(一种辅酶再生酶)制备L-草铵膦，在消耗等量的葡萄糖产生葡萄糖酸的代价下、反应6天后，得到16.7mM产品，ee值达到89.2％(Fang JM,Lin C H,Bradshaw C W.Journal of the Chemical Society.1995,PerkinTransaction 1:967-978)。中国专利CN106978453通过筛选得到了一系列的氨基酸脱氢酶，在额外的辅酶再生体系配合反应下，制备了L-草铵膦。中国专利CN110184246则通过基因工程改造、获得到了一种酶活更高的谷氨酸脱氢酶突变体，在葡萄糖脱氢酶的配合下制备L-草铵膦，原料PPO转化率>99％，产品ee值>99％。包括谷氨酸脱氢酶在内的氨基酸脱氢酶，虽然可以直接利用无机氨作为氨基供体、还原胺化原料PPO制备L-草铵膦，无需手性氨基酸作为氨基供体；但氨基酸脱氢酶催化的反应需要消耗等当量的辅酶，由于辅酶价格昂贵，因此，还需要额外的辅酶再生体系。
目前研究较多的辅酶再生体系有：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的醇脱氢酶辅酶再生系统；或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的甲酸脱氢酶辅酶再生系统；又或者，以亚磷酸脱氢酶为辅酶再生酶、以亚磷酸盐为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的亚磷酸脱氢酶辅酶再生系统。这些辅酶再生体系都需要消耗额外的辅酶再生原料(底物)来提供还原力、用于辅酶的再生，导致整个反应体系的原子经济性不高；而且，有些辅酶再生系统的副产物与产品L-草铵膦难以分离，导致产品后处理工艺复杂、精制成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的生产L-草铵膦的方法，该方法不需要额外的辅酶再生系统以及辅酶再生原料，因此，没有副产物产生，而且原料转化率高，分离精制过程简单。
本发明提供了一种利用羟基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法，以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，经羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶两步催化制备L-草铵膦。
反应体系中加有辅酶，所述辅酶为NAD+。反应体系中辅酶的添加量为0.001～0.5mM。
具体原理为：羟基酸脱氢酶在消耗等量的氧化型辅酶NAD+的同时、可将原料2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸氧化为中间产物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，氧化型辅酶NAD+反应后转变为还原型辅酶NADH；随后，氨基酸脱氢酶在消耗等量的还原型辅酶NADH的同时、可将中间产物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸还原胺化为L-草铵膦，还原型辅酶NADH又变回氧化型辅酶NAD+、可供羟基酸脱氢酶使用。反应原理见图1。在此过程中，辅酶在两个酶催化反应之间自循环、无需额外辅酶再生体系，自然也就无需额外的辅酶再生原料。
作为优选，所述羟基酸脱氢酶为羟基异己酸脱氢酶、乳酸脱氢酶或扁桃酸脱氢酶中的至少一种。所述羟基酸脱氢酶为来源于甲烷球菌Methanocaldococcus jannaschiiDSM 2661的L-羟基异己酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.1；或来源于德布鲁克乳杆菌Lactobacillus delbrueckii的D-羟基异己酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.2；或来源于链球菌Streptococcus的L-乳酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.3；或来源于短乳杆菌Lactobacillus brevis ATCC 367的D-扁桃酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.4。
作为优选，反应体系中同时加入L-选择性羟基酸脱氢酶和D-选择性羟基酸脱氢酶。L-选择性羟基酸脱氢酶可以催化L-2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸生成2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸；D-选择性羟基酸脱氢酶可以催化D-2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸生成2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸。
作为优选，所述氨基酸脱氢酶为亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶中的至少一种。所述氨基酸脱氢酶为来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的亮氨酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.5；或来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440的亮氨酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.6；或来源于绿色链霉菌Streptomycesviridochromogenes DSM40736的丙氨酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.7；或来源于艰难梭菌Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.8。
作为优选，反应体系中所述羟基酸脱氢酶的添加量为不少于100U/L；所述氨基酸脱氢酶添加量为不少于500U/L。
反应体系中使用的羟基酸脱氢酶、氨基酸脱氢酶为工程菌表达的胞内酶、游离酶或固定化酶。
作为优选，反应体系中，原料2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的添加量为10～500mM，反应温度为30～45℃，控制反应pH值为7.5～9。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明方法以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经由羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶组成的酶催化体系催化获得产物L-草铵膦，实现了辅酶的自循环、无需要额外的辅酶再生系统以及辅酶再生原料。
(2)本发明方法构建了一种全新的生物(酶)催化体系用于生产L-草铵膦；这种生物催化体系制备L-草铵膦的工艺路线目前尚未见报导。
(3)本发明方法的最终产品中没有任何副产物的生成，从而极大地简化了L-草铵膦的后续精制工艺，提高了产品总收率。
附图说明
图1为本发明方法所采用的酶催化体系生产L-草铵膦的反应式。
具体实施方式
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的限制性内切酶和DNA连接酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)等购自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
本发明的催化反应通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱/AQ-C18；柱温/40℃；流速/1mL/min；检测波长/UV205nm；流动相：50mM(NH4)2HPO4，加入1％的10％四丁基氢氧化铵水溶液，用50％磷酸调pH至3.6，加入8％乙腈。
以柱前衍生化HPLC法测定产品的光学纯度，手性HPLC分析方法为色谱条件：色谱柱/
QS-C18；流动相/50mM乙酸钠溶液:乙腈＝8:0.5；检测波长/338nm；流速/0.85mL/min；柱温/30℃。衍生化试剂：分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1N-乙酰-L-半胱氨酸，用400μL乙醇助溶，再加入4mL 0.2mol/硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。衍生化反应与测定：取100μL样品加入150μL衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min，进样20μL进行分析。
图1为本发明方法所采用的酶催化体系生产L-草铵膦的反应式。
实施例1羟基酸脱氢酶
1.1表达羟基酸脱氢酶的基因工程菌的构建
通过查询基因数据库NCBI，获得一系列羟基酸脱氢酶的基因序列，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pET-28a(+)上，将目的基因置于酶切位点为Nco I和Xho I之间，基因序列信息如表1所示。重组质粒经测序验证无误后、转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于羟基酸脱氢酶的表达。
表1羟基酸脱氢酶
1.2微生物的培养
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将含有相关基因的工程菌E.coli BL21(DE3)接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/mL Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.3mM，28℃下诱导培养20h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。
1.3粗酶液的制备
将培养结束后收集到的菌体细胞，用50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲液洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于Tris-HCl(50mM，pH 7.5，20mM咪唑，0.3M NaCl，5mM二硫苏糖醇)缓冲液中，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到的上清为相应酶的粗酶液。
1.4酶活力的测定
酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(25℃)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
羟基酸脱氢酶酶活测定：取底物溶液(20mM 2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液，事先用氨水调pH到8.0)950μL，加入10mM NAD+溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、340nm吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据NADH摩尔吸光系数，即可计算酶活。
以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸和NAD+为底物，测定这些基因工程菌株表达的羟基酸脱氢酶的活力，筛选具有催化活力的酶，结果见表2。其中E1为L-选择性羟基异己酸脱氢酶、E3为L-选择性乳酸脱氢酶，这两个L-选择性的羟基酸脱氢酶可以催化L-2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸生成2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸；而E2为D-选择性羟基异己酸脱氢酶、E4为D-选择性扁桃酸脱氢酶，二者可以催化D-2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸生成2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸。
表2羟基酸脱氢酶的来源与酶活
实施例2氨基酸脱氢酶
2.1表达氨基酸脱氢酶的基因工程菌的构建
通过查询基因数据库NCBI，获得一系列氨基酸脱氢酶的基因序列，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pET-28a(+)上，如表3所示。重组质粒经测序验证无误后、转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于羟基酸脱氢酶的表达。
微生物的培养、粗酶液的制备等方法同实施例1。
表3氨基酸脱氢酶
2.2酶活力的测定
氨基酸脱氢酶酶活测定：取底物溶液(20mM 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液，事先用氨水调pH到8.0)950μL，加入10mM NADH溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、340nm吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据NADH摩尔吸光系数，即可计算酶活。
以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸和NADH为底物，测定这些基因工程菌株表达的氨基酸脱氢酶的活力，筛选具有催化活力的酶，结果见表4。
表4氨基酸脱氢酶的来源与酶活
实施例3
分别培养表达酶E1的基因工程菌、表达酶E2的基因工程菌以及表达酶E5的基因工程菌，经微生物培养后收集细胞(菌体)，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例1和2。
将含有2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸10mM的溶液置于30℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝7.5，再加入NAD+0.001mM；然后依次加入E1粗酶液100U/L、E2粗酶液100U/L、E5粗酶液1000U/L，开始反应，用氨水控制pH＝7.5，反应26小时，液相检测2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为0.23mM，原料转化率为97.7％；产品L-草铵膦为9.7mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。
实施例4
分别培养表达酶E1的基因工程菌、表达酶E2的基因工程菌以及表达酶E6的基因工程菌，经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例1和2。
将含有2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸100mM的溶液置于35℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝8.5，再加入NAD+0.1mM；然后依次加入E1粗酶液500U/L、E2粗酶液500U/L、E6粗酶液5000U/L，开始反应，用氨水控制pH＝8.5，反应40小时，液相检测2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为1.7mM，原料转化率为97.3％；产品L-草铵膦为96.1mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。反应过程数据如表5所示.
表5使用羟基异己酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶制备L-草铵膦
实施例5
分别培养表达酶E3的基因工程菌、表达酶E4的基因工程菌以及表达酶E7的基因工程菌，经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例1和2。将粗酶液离心(12000rpm，30min)去除细胞碎片，以获得的上清酶液进行酶的固定化，获得固定化的E3酶、固定化的E4酶、以及固定化的E7酶。(酶的固定化方法参考NicoleEnd·Kai-Uwe Schoning Immobilized Biocatalysts in Industrial Research andProduction.Topics in Current Chemistry(2004)242:273–317)。
将含有2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸10mM的溶液置于40℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝8.0，再加入NAD+0.01mM；然后依次加入E3固定化酶500U/L、E4固定化酶500U/L、E7固定化酶500U/L，开始反应，用氨水控制pH＝8.0，反应6小时，液相检测2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为0.21mM，原料转化率为97.9％；产品L-草铵膦为98.9mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。
实施例6
分别培养表达酶E3的基因工程菌、表达酶E4的基因工程菌以及表达酶E8的基因工程菌，经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例1和2。
将含有2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸500mM的溶液置于45℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝9.0，再加入NAD+0.1mM；然后依次加入E3粗酶液5000U/L、E4粗酶液5000U/L、E5粗酶液10000U/L，开始反应，用氨水控制pH＝9.0，反应72小时，液相检测2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为16.2mM，原料转化率为96.8％；产品L-草铵膦为480.3mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。反应过程数据如表6所示。
表6使用L-乳酸脱氢酶、D-扁桃酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶制备L-草铵膦
对比例1只有羟基酸脱氢酶参与的反应
分别培养表达酶E3的基因工程菌和表达酶E4的基因工程菌，经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例1。
将含有2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸10mM的溶液置于45℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝9.0，再加入NAD+0.5mM；然后依次加入E3粗酶液500U/L和E4粗酶液500U/L，开始反应，用氨水控制pH＝9.0，反应72小时，液相检测2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为9.43mM，原料转化率为5.7％；产品L-草铵膦为0.0mM，中间产物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸0.45mM。
对比例2只有氨基酸脱氢酶参与的反应
培养表达酶E8的基因工程菌，经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例2。
将含有2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸10mM的溶液置于45℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝9.0，再加入NAD+0.5mM；然后依次加入E8粗酶液500U/L，开始反应，用氨水控制pH＝9.0，反应72小时，液相检测2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为9.95mM，原料转化率为0.5％；产品L-草铵膦为0.0mM，中间产物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸0.0mM。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种利用羟基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 344
<212> PRT
<213> 甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)
<400> 1
Met Ile Leu Lys Pro Glu Asn Glu Lys Lys Leu Ile Ile Asp Val Leu
1 5 10 15
Lys Lys Phe Gly Val Pro Glu Glu Asp Ala Lys Ile Thr Ala Asp Val
20 25 30
Phe Val Asp Ala Asp Leu Lys Gly Phe Thr Ser His Gly Ile Gly Arg
35 40 45
Phe Pro Gln Tyr Ile Thr Ala Leu Lys Leu Gly Asn Ile Asn Pro Lys
50 55 60
Pro Asp Ile Lys Ile Val Lys Glu Ser Pro Ala Thr Ala Val Ile Asp
65 70 75 80
Gly Asp Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Gly Lys Lys Ala Met Glu Leu
85 90 95
Ala Ile Lys Lys Ala Lys Asn Val Gly Val Gly Val Val Ala Thr Arg
100 105 110
Asn Ala Asn His Phe Gly Ile Ala Gly Tyr Tyr Ser Glu Leu Ala Met
115 120 125
Asn Gln Asp Met Ile Gly Ile Thr Ile Thr Asn Thr Glu Pro Ala Met
130 135 140
Ala Pro Phe Gly Gly Lys Glu Lys Ile Leu Gly Thr Asn Pro Ile Ala
145 150 155 160
Ile Ala Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Lys Phe Ser Leu Asp Met Ala Thr
165 170 175
Ala Ser Ile Ala Arg Gly Lys Ile Leu Glu Ala Leu Arg Lys Lys Ile
180 185 190
Lys Ile Pro Glu Gly Cys Ala Val Asp Lys Asp Gly Lys Pro Thr Thr
195 200 205
Asp Pro Ala Lys Ala Leu Glu Gly Cys Ile Leu Pro Phe Gly Gly Pro
210 215 220
Lys Gly Tyr Gly Leu Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Ser Ala Ile Gly
225 230 235 240
Gly Ala Glu Val Gly Thr Lys Val Lys Gly Thr Ala Asn Pro Glu Glu
245 250 255
Arg Cys Thr Lys Gly Asp Leu Phe Ile Ala Ile Asn Pro Glu Phe Phe
260 265 270
Met Gly Lys Glu Glu Phe Lys Arg Lys Val Asp Glu Leu Leu Asp Glu
275 280 285
Ile Lys Asn Ser Glu Pro Ala Glu Gly Phe Glu Ile Leu Ile Pro Gly
290 295 300
Glu Ile Glu Glu Arg Asn Lys Met Lys Arg Lys Asp Gly Phe Glu Ile
305 310 315 320
Asp Lys Asn Leu Tyr Asn Gln Leu Lys Glu Ile Cys Asn Glu Leu Gly
325 330 335
Leu Asn Ile Glu Asp Tyr Ile Glu
340
<210> 2
<211> 333
<212> PRT
<213> 德布鲁克乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)
<400> 2
Met Thr Lys Ile Ala Met Tyr Asn Val Ser Pro Ile Glu Val Pro Tyr
1 5 10 15
Ile Glu Asp Trp Ala Lys Lys Asn Asp Val Glu Ile Lys Thr Thr Asp
20 25 30
Gln Ala Leu Thr Ser Ala Thr Val Asp Leu Ala Glu Gly Cys Ser Ser
35 40 45
Val Ser Leu Lys Pro Leu Gly Pro Val Asp Glu Glu Val Val Tyr Gln
50 55 60
Lys Leu Ser Glu Tyr Gly Val Lys Cys Ile Gly Leu Arg Ile Val Gly
65 70 75 80
Phe Asn Thr Ile Asn Phe Asp Trp Thr Lys Lys Tyr Asn Leu Leu Val
85 90 95
Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Ala Glu Met Thr Val
100 105 110
Thr Gln Ala Met Tyr Leu Leu Arg Lys Ile Gly Glu Phe Arg Tyr Arg
115 120 125
Met Asp His Asp His Asp Phe Thr Trp Pro Ser Asn Leu Ile Ser Asn
130 135 140
Glu Ile Tyr Asn Leu Thr Val Gly Leu Ile Gly Val Gly His Ile Gly
145 150 155 160
Ser Ala Val Ala Glu Ile Phe Ser Ala Met Gly Ala Lys Val Ile Ala
165 170 175
Tyr Asp Val Ala Tyr Asn Pro Glu Phe Glu Pro Phe Leu Thr Tyr Thr
180 185 190
Asp Phe Asp Thr Val Leu Lys Glu Ala Asp Ile Val Ser Leu His Thr
195 200 205
Pro Leu Phe Pro Ser Thr Glu Asn Met Ile Gly Glu Lys Gln Leu Lys
210 215 220
Glu Met Lys Lys Ser Ala Tyr Leu Ile Asn Cys Ala Arg Gly Glu Leu
225 230 235 240
Val Asp Thr Gly Ala Leu Ile Lys Ala Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala
245 250 255
Gly Ala Gly Leu Asp Thr Leu Ala Gly Glu Ser Ser Tyr Phe Gly His
260 265 270
Thr Gly Leu Thr Asp Ser Glu Ile Pro Glu Asp Tyr Lys Thr Leu Ala
275 280 285
Lys Met Pro Asn Val Val Ile Thr Pro His Ser Ala Phe Tyr Thr Glu
290 295 300
Thr Ser Ile Arg Asn Met Val Gln Ile Cys Leu Thr Asp Gln Leu Thr
305 310 315 320
Ile Ala Lys Gly Gly Arg Pro Arg Ser Ile Val Asn Leu
325 330
<210> 3
<211> 328
<212> PRT
<213> 链球菌(Streptococcus)
<400> 3
Met Thr Ser Thr Lys Gln His Lys Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly
1 5 10 15
Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Leu Val Asn Gln Gly Ile Ala
20 25 30
Gln Glu Leu Gly Ile Ile Glu Ile Pro Gln Leu His Glu Lys Ala Val
35 40 45
Gly Asp Ala Leu Asp Leu Ser His Ala Leu Ala Phe Thr Ser Pro Lys
50 55 60
Lys Ile Tyr Ala Ala Gln Tyr Ser Asp Cys Ala Asp Ala Asp Leu Val
65 70 75 80
Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp
85 90 95
Leu Val Gly Lys Asn Leu Ala Ile Asn Lys Ser Ile Val Thr Gln Val
100 105 110
Val Glu Ser Gly Phe Lys Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val
115 120 125
Asp Val Leu Thr Tyr Ser Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Glu
130 135 140
Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Gln
145 150 155 160
Ala Leu Ala Glu Lys Leu Asp Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr
165 170 175
Ile Met Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Val Trp Ser His Ala
180 185 190
Asn Ile Ala Gly Val Asn Leu Glu Glu Phe Leu Lys Asp Thr Gln Asn
195 200 205
Val Gln Glu Ala Glu Leu Ile Glu Leu Phe Glu Gly Val Arg Asp Ala
210 215 220
Ala Tyr Thr Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala
225 230 235 240
Val Ala Leu Ala Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asp Asp Glu Asn Ala
245 250 255
Val Leu Pro Leu Ser Val Phe Gln Glu Gly Gln Tyr Gly Val Glu Asn
260 265 270
Val Phe Ile Gly Gln Pro Ala Val Val Gly Ala His Gly Ile Val Arg
275 280 285
Pro Val Asn Ile Pro Leu Asn Asp Ala Glu Thr Gln Lys Met Gln Ala
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Leu Gln Ala Ile Ile Asp Glu Ala Trp Lys Asn Pro
305 310 315 320
Glu Phe Gln Glu Ala Ser Lys Asn
325
<210> 4
<211> 309
<212> PRT
<213> 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)
<400> 4
Met Lys Ile Ala Ile Ala Gly Ala Gly Ala Met Gly Ser Arg Phe Gly
1 5 10 15
Val Lys Leu Gln Glu Ala Gly Asn Gln Val Thr Leu Ile Asp Asn Trp
20 25 30
Ser Ala His Val Asp Gln Ile Asn Gln Ala Gly Leu Thr Val Thr Thr
35 40 45
Asp Asp Gly Val Asp His Val Tyr Thr Met Thr Ala Gln His Pro Glu
50 55 60
Ala Val Thr Asp Gln Phe Asp Leu Ile Ile Leu Phe Thr Lys Thr Met
65 70 75 80
Gln Met Asp Ala Met Leu Gln Gln Leu Ala Pro Val Leu Thr Asn His
85 90 95
Pro Ile Val Leu Thr Leu Ala Asn Gly Ile Gly Asn Ile Glu Thr Ile
100 105 110
Glu Arg His Val Pro Lys Asn Gln Ile Val Val Gly Thr Thr Val Trp
115 120 125
Ser Ser Gly Leu Thr Gly Pro Gly His Ile Thr Val Thr Gly Thr Gly
130 135 140
Ser Ile Ser Leu Gln Ala Val Val Pro Asp Gln Phe Pro Asn Leu Ala
145 150 155 160
Asp Leu Ile Thr Thr Leu Asn Ala Ala Gly Leu Asn Ala Ser Ala Ala
165 170 175
Asp Asn Val Leu Ala Ala Ile Trp Lys Lys Ala Gly Leu Asn Ser Val
180 185 190
Leu Asn Thr Tyr Cys Thr Leu Phe Asp Cys Asn Ile Gly Glu Phe Gly
195 200 205
Ala Leu Lys Asn Trp Gln Thr Leu Thr Ala Thr Val Leu Asp Glu Phe
210 215 220
Gln Ala Val Ala Asp Ala Ala Gln Ile Gln Phe Ser Ala Ala Ala Val
225 230 235 240
Thr Asp Leu Ile Ala Ala Gln Phe Pro Ala Ala Val Asn Gly Asn His
245 250 255
Tyr Pro Ser Met His Gln Asp Met Ala Asn Gln Arg Pro Thr Glu Ile
260 265 270
Asp Phe Leu Asn Gly Tyr Val Ala Lys Leu Gly Gln Gln Leu His Val
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Asn Ala Leu Leu Thr Gln Leu Ile His Ser Gln Glu
290 295 300
Gln Leu Lys Gln Ile
305
<210> 5
<211> 364
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 5
Met Glu Leu Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Phe Cys Gln Asp Glu Gln Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Glu Asn Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe
85 90 95
Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Glu Asp Met Asp Ile Ile His Asp
115 120 125
Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Ala Ala Phe Gly Thr Asp Ser Leu Glu Gly Lys Thr Ile
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr Asn Leu Cys Arg His Leu
180 185 190
His Glu Glu Gly Ala Asn Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Gln Ser
195 200 205
Val Gln Arg Ala Val Glu Asp Phe Gly Ala Arg Ala Val Asp Pro Asp
210 215 220
Asp Ile Tyr Ser Gln Asp Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Thr Ile Asn Asp Asp Thr Ile Lys Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Thr Arg His Gly Asp Gln
260 265 270
Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Ala Glu
290 295 300
Arg Ala Leu Lys Lys Val Glu Gly Ile Tyr Gly Asn Ile Glu Arg Val
305 310 315 320
Leu Glu Ile Ser Gln Arg Asp Gly Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Ala Asp
325 330 335
Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Glu Arg Met Arg Arg Ser Arg Ser Gln
340 345 350
Phe Leu Gln Asn Gly His Ser Val Leu Ser Arg Arg
355 360
<210> 6
<211> 339
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 6
Met Phe Ala Leu Met Gln Ser Thr Arg Thr Gln Ser Leu His Leu Phe
1 5 10 15
Asn Asp Pro Pro Thr Gly Leu Lys Ala Val Val Ala Ile His Ser Glu
20 25 30
His Leu Gly Pro Ala Met Gly Gly Cys Arg Tyr Leu Pro Tyr Ala Asp
35 40 45
Asp Glu Ser Ala Met Thr Asp Ala Ile Arg Leu Ala Gln Gly Met Ser
50 55 60
Tyr Lys Ala Ala Leu Ala Gly Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Ala Val
65 70 75 80
Ile Met Arg Asn Pro His Val Glu Asn Arg Ala Ala Leu Phe Glu Ala
85 90 95
Phe Gly Arg Phe Ile Asp Thr Leu His Gly Arg Phe Ile Ile Ala Val
100 105 110
Asp Ser Gly Thr Ser Thr Leu Asp Met Asp Cys Ile Ala His Ser Thr
115 120 125
Pro Tyr Val Thr Ser Thr Thr Ala Ser Gly Asp Pro Ser Pro His Ala
130 135 140
Ala Met Gly Val Phe Ala Gly Ile Arg Ala Thr Thr Ser Phe Arg Leu
145 150 155 160
Gly Ser Asp Asp Leu Arg Gly Leu Arg Val Ala Val Gln Gly Leu Gly
165 170 175
Asn Val Gly Tyr Ala Leu Ala Glu Gln Leu His Ala Val Gly Ala Glu
180 185 190
Leu Leu Val Ser Asp Leu Asp Pro Gly Arg Val Arg Leu Ala Met Glu
195 200 205
Gln Phe Asp Ala Lys Pro Val Thr Asn Asp Ala Leu Ile Ser Thr Pro
210 215 220
Cys Asp Ile Phe Ala Pro Cys Gly Val Gly Pro Val Leu Asn Gly Gln
225 230 235 240
Ser Val Met Gln Leu Arg Cys Ala Ala Val Ala Gly Ala Ala Asn Asn
245 250 255
Gln Leu Thr Thr Leu Gln Val Ala Asp Gln Leu Glu Ser Arg Gly Ile
260 265 270
Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala Gly Gly Leu Ile Tyr Val
275 280 285
Ala Leu Thr His Arg Gly Glu Asp Gln Arg Thr Ile Thr Ala His Leu
290 295 300
Ala Arg Ile Pro Ser Arg Leu Thr Glu Val Phe Gly His Ala Gln Ala
305 310 315 320
Glu Lys Arg Ser Pro Ala Arg Val Ala Gln Met Leu Ala Glu Arg Leu
325 330 335
Leu Tyr Gly
<210> 7
<211> 371
<212> PRT
<213> 绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)
<400> 7
Met Lys Val Gly Ile Pro Arg Glu Val Lys Asn Asn Glu Phe Arg Val
1 5 10 15
Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val His Glu Leu Val Arg His Gly His Gln
20 25 30
Val Val Ile Glu Arg Gly Ala Gly Val Gly Ser Ser Ile Val Asp Glu
35 40 45
Glu Tyr Val Ala Ala Gly Gly Arg Ile Leu Asp Thr Ala Asp Lys Val
50 55 60
Trp Ala Thr Ala Asp Leu Leu Leu Lys Val Lys Glu Pro Val Ala Glu
65 70 75 80
Glu Tyr His Arg Leu Arg Lys Asp Gln Thr Leu Phe Thr Tyr Leu His
85 90 95
Leu Ala Ala Ser Lys Glu Cys Thr Asp Ala Leu Leu Glu Ser Gly Thr
100 105 110
Thr Ala Ile Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Pro Ser Arg Ala Leu Pro
115 120 125
Leu Leu Ala Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Leu Ala Pro Gln Val
130 135 140
Gly Ala Tyr His Leu Met Arg Ala Asn Gly Gly Arg Gly Val Leu Pro
145 150 155 160
Gly Gly Val Pro Gly Val Leu Ala Gly Arg Ala Val Val Ile Gly Gly
165 170 175
Gly Val Ser Gly Trp Gln Ala Ala Gln Ile Ala Ile Gly Leu Gly Phe
180 185 190
His Val Thr Leu Leu Asp Lys Asp Val Asn Lys Leu Arg Glu Ala Asp
195 200 205
Arg Ile Phe Gly Thr Lys Ile Gln Thr Val Val Ser Asn Thr Leu Glu
210 215 220
Leu Glu Lys Ala Cys Leu Glu Ala Asp Leu Val Ile Gly Ala Val Leu
225 230 235 240
Ile Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Asn Glu Leu Val Ser
245 250 255
Arg Met Lys Pro Gly Ser Val Leu Val Asp Ile Ala Ile Asp Gln Gly
260 265 270
Gly Cys Phe Glu Asp Ser Arg Pro Thr Thr His Ala Glu Pro Thr Phe
275 280 285
Gln Val His Asn Ser Val Phe Tyr Cys Val Ala Asn Met Pro Gly Ala
290 295 300
Val Pro Asn Thr Ser Thr Tyr Ala Leu Thr Asn Ala Thr Leu Pro Tyr
305 310 315 320
Ile Val Glu Leu Ala Asn His Gly Trp Ala Gly Ala Leu Arg Arg Asp
325 330 335
Pro Ala Leu Ala Lys Gly Leu Asn Thr His Asp Gly Lys Val Val Tyr
340 345 350
Arg Glu Val Ala Glu Ala His Gly Ala Glu His Val Glu Leu Ser Ser
355 360 365
Leu Leu Gly
370
<210> 8
<211> 421
<212> PRT
<213> 艰难梭菌(Clostridium difficile)
<400> 8
Met Ser Gly Lys Asp Val Asn Val Phe Glu Met Ala Gln Ser Gln Val
1 5 10 15
Lys Asn Ala Cys Asp Lys Leu Gly Met Glu Pro Ala Val Tyr Glu Leu
20 25 30
Leu Lys Glu Pro Met Arg Val Ile Glu Val Ser Ile Pro Val Lys Met
35 40 45
Asp Asp Gly Ser Ile Lys Thr Phe Lys Gly Phe Arg Ser Gln His Asn
50 55 60
Asp Ala Val Gly Pro Thr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His Gln Asn Val
65 70 75 80
Ser Arg Asp Glu Val Lys Ala Leu Ser Ile Trp Met Thr Phe Lys Cys
85 90 95
Ser Val Thr Gly Ile Pro Tyr Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Ile Val
100 105 110
Asp Pro Ser Thr Leu Ser Gln Gly Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly
115 120 125
Tyr Ile Asp Gly Ile Tyr Lys Leu Ile Gly Glu Lys Val Asp Val Pro
130 135 140
Ala Pro Asp Val Asn Thr Asn Gly Gln Ile Met Ser Trp Met Val Asp
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Lys Leu Thr Gly Gln Ser Ser Ile Gly Val Ile Thr Gly
165 170 175
Lys Pro Val Glu Phe Gly Gly Ser Leu Gly Arg Thr Ala Ala Thr Gly
180 185 190
Phe Gly Val Ala Val Thr Ala Arg Glu Ala Ala Ala Lys Leu Gly Ile
195 200 205
Asp Met Lys Lys Ala Lys Ile Ala Val Gln Gly Ile Gly Asn Val Gly
210 215 220
Ser Tyr Thr Val Leu Asn Cys Glu Lys Leu Gly Gly Thr Val Val Ala
225 230 235 240
Met Ala Glu Trp Cys Lys Ser Glu Gly Ser Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu
245 250 255
Asn Gly Leu Asp Gly Gln Ala Met Leu Asp Tyr Met Lys Glu His Gly
260 265 270
Asn Leu Leu Asn Phe Pro Gly Ala Lys Arg Ile Ser Leu Glu Glu Phe
275 280 285
Trp Ala Ser Asp Val Asp Ile Val Ile Pro Ala Ala Leu Glu Asn Ser
290 295 300
Ile Thr Lys Glu Val Ala Glu Ser Ile Lys Ala Lys Leu Val Cys Glu
305 310 315 320
Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Pro Glu Ala Asp Glu Val Phe Ala Glu
325 330 335
Arg Gly Ile Val Leu Thr Pro Asp Ile Leu Thr Asn Ala Gly Gly Val
340 345 350
Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Leu Tyr Gly Tyr Tyr Trp
355 360 365
Ser Glu Glu Glu Val Glu Gln Lys Glu Glu Ile Ala Met Val Lys Ala
370 375 380
Phe Glu Ser Ile Trp Lys Ile Lys Glu Glu Tyr Asn Val Thr Met Arg
385 390 395 400
Glu Ala Ala Tyr Met His Ser Ile Lys Lys Val Ala Glu Ala Met Lys
405 410 415
Leu Arg Gly Trp Tyr
420
Claims (10)
1.一种利用羟基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法，其特征在于，以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，经羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶两步催化制备L-草铵膦。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中加有辅酶，所述辅酶为NAD+。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，反应体系中辅酶的添加量为0.001～0.5mM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羟基酸脱氢酶为羟基异己酸脱氢酶、乳酸脱氢酶或扁桃酸脱氢酶中的至少一种。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述羟基酸脱氢酶为来源于甲烷球菌Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661的L-羟基异己酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ IDNO.1；或来源于德布鲁克乳杆菌Lactobacillus delbrueckii的D-羟基异己酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.2；或来源于链球菌Streptococcus的L-乳酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ IDNO.3；或来源于短乳杆菌Lactobacillus brevis ATCC 367的D-扁桃酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.4。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系中同时加入L-选择性羟基酸脱氢酶和D-选择性羟基酸脱氢酶。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸脱氢酶为亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶中的至少一种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氨基酸脱氢酶为来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的亮氨酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.5；或来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440的亮氨酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ ID NO.6；或来源于绿色链霉菌Streptomyces viridochromogenes DSM40736的丙氨酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ IDNO.7；或来源于艰难梭菌Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶，氨基酸序列SEQ IDNO.8。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中所述羟基酸脱氢酶的添加量为不少于100U/L；所述氨基酸脱氢酶添加量为不少于500U/L。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中，原料2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的添加量为10～500mM，反应温度为30～45℃，控制反应pH值为7.5～9。
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| CN113583988A (zh) * | 2020-04-30 | 2021-11-02 | 沈阳药科大学 | 氨基酸脱氢酶突变体及其应用 |
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| CN111019982B (zh) | 2021-10-15 |
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