CN1373140A - 牝牛分枝杆菌甲酸脱氢酶突变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明目的是提供在有机溶剂存在下仍可保持强的甲酸脱氢酶活性的多肽,以及它们的应用。通过定点诱变取代来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶氨基酸序列中的146和/或256位的半胱氨酸,而构建甲酸脱氢酶突变体多肽,它对有机溶剂具有耐受性。这类多肽在有机溶剂存在下具有强的甲酸脱氢酶活性。此类突变体可用酮作原料生产醇等。
Description
技术领域
本发明涉及来源于牝牛分枝杆菌(Mycobaterium vaccae)的甲酸脱氢酶突变体、编码这些突变体的多核苷酸，以及通过使用它们，由氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生产还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的方法。
背景技术
以前已经有一种用于制备具有旋光性的(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的已知方法，它是一种使用微生物(例如面包酵母)的非对称还原方法(未审公开的日本专利申请No.(JP-A)Sho 61-146191；JP-A Hei 6-209782等)。但是，此方法不具有工业实用性，原因是微生物细胞中存在多种类型的还原酶，因此产品的光学纯度和产率低。旋光活性(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯可以用作药物等的中间体，因此，获得旋光纯的对映体的方法(合成或分解)已经成为工业上的一种重要挑战。
已知来源于埃利氏克鲁维氏酵母(kluyveromyces aestuarii)的羰基还原酶(JP-A2000-236883)可由4-卤乙酰乙酸酯生产(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯。曾报道了一种通过使用此酶合成(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯的方法。但是在通过使用此酶生产旋光活性醇的过程中，需要一种化学计算量的还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)充当辅酶。这种辅酶非常昂贵，因此工业化规模中采用此方法时，这种辅酶的使用量在经济上是非常不利的。因此，通过将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)还原为NADH，重复再使用这种辅酶以建立一种经济的方法，这是非常重要的。
到目前为止，使用甲酸脱氢酶(酶学方法136，9-21，1987)或葡萄糖脱氢酶(JP-A2000-236883)将辅酶NAD+还原为NADH已有报道。但是，葡萄糖脱氢酶将葡萄糖转化为葡糖酸，问题是结果产生了等量的葡糖酸和所需的旋光醇。
另一方面，甲酸脱氢酶将甲酸转化为碳酸，所产生的碳酸转化为二氧化碳而从系统中被有效地除去。因此，此方法是一种经济的方法。但是，使用甲酸脱氢酶还是有不利的方面，即此酶的稳定性不够高，因此易于失活。已知：这种失活与多种因素有关，pH值、温度、机械应力、离子强度和底物溶液中离子的类型、重金属、巯基被氧氧化等(JP-A Hei 11-225784)。对比有许多报道与使用下列突变以增强其稳定性的方法有关。
Tishkov等已经指出了来源于假单孢菌菌种(Pseudomonas sp.)101的甲酸脱氢酶的突变体，其中256位的半胱氨酸通过定点诱变被丝氨酸或蛋氨酸取代，它增加了对汞的稳定性，但却降低了对热的稳定性(生物化学与生物物理研究通讯192，4480-4485，1993)。他们还报道了对热的稳定性增强的突变体，它们是通过用丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸在131、160、168、184或228位取代丝氨酸相似地制备出来的(FEBS Letters 445，183-188，1999)。
Slusarczyk等已经指出了通过定点诱变制备的来源于博伊定氏假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶的突变体，其中23位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且262位的半胱氨酸被缬氨酸或丙氨酸取代，此突变体对铜的稳定性增加，对弱碱pH范围内的pH的稳定性增加，而对热的稳定性下降(欧洲生物化学杂志267，1280-1289，2000)。
尽管这些研究作了努力，但还有一个问题需要解决，那就是在通过使用上述酶，从诸如酮等氧化底物生产诸如醇等还原产物，并同时再生辅酶NADH的过程中，由于甲酸脱氢酶的活性降低而导致产率较低。
发明概述
本发明考虑到了上述情况，并且本发明的一个目的是提供在从氧化底物生产还原产物，同时再生辅酶NADH的过程中，活性不降低的甲酸脱氢酶。另外，本发明的另一个目的是通过使用这种酶可由氧化底物有效地生产还原产物。
为了达到上述目的，本发明人首先研究了在上述还原产物的生产过程中甲酸脱氢酶活性降低的原因。然后本发明人发现，甲酸脱氢酶在作为原料的有机溶剂例如酮的存在下迅速失活。因此，本发明人努力寻找对有机溶剂具有耐受性的甲酸脱氢酶突变体，或者有机溶剂使其活性增强的甲酸脱氢酶突变体。本发明人通过修饰来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)146位的半胱氨酸残基，终于成功地构建了具有这种性质的甲酸脱氢酶突变体，即有机溶剂存在时与没有有机溶剂存在时相比，其活性有所增强。它是通过构建多种甲酸脱氢酶突变体并对它们进行研究而获得的。
而且本发明人还发现，通过修饰256位的半胱氨酸，获得了对有机溶剂具有耐受性的甲酸脱氢酶的突变体。
另外，本发明人还通过构建含有编码甲酸脱氢酶突变体的多核苷酸和编码羰基还原酶(将酮还原为醇)的多核苷酸的表达载体，在大肠杆菌中成功地共表达了甲酸脱氢酶和羰基还原酶。使用这些表达的酶，已经使由例如酮等的氧化底物有效地生产还原产物，例如从所述底物有效地生产醇，同时再生辅酶NADH成为可能。
如上所述，本发明人创建对有机溶剂具有耐受性的甲酸脱氢酶突变体，在有机溶剂存在下它的活性增强；而且本发明人还发现了一种通过共表达此酶和羰基还原酶，从底物中有效地生产氧化底物的还原产物的方法，由此本发明人完成了本发明。
本发明特别涉及下列多肽和应用这些多肽从氧化底物有效地生产还原产物的方法。
[1]一种多肽，它在有机溶剂存在下具有强的甲酸脱氢酶活性，所述的多肽含有一种突变，即非半胱氨酸的氨基酸至少取代了SEQ ID NO：2氨基酸序列中146位和/或256位的半胱氨酸残基。
[2][1]的多肽，其中146位的取代氨基酸是丝氨酸或缬氨酸。
[3][1]的多肽，其中256位的取代氨基酸是丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
[4][1]的多肽，其中所述的多肽含有一个突变，即非半胱氨酸的氨基酸至少取代了SEQ ID NO：2氨基酸序列中146位和256位的半胱氨酸残基。
[5][4]的多肽，其中146位的取代氨基酸是丝氨酸或缬氨酸，并且256位的取代氨基酸是丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
[6][1]的多肽，其中所述的多肽还含有一个突变，即非半胱氨酸的氨基酸取代了SEQ ID NO：2氨基酸序列中6位的半胱氨酸残基。
[7][6]的多肽，其中6位的取代氨基酸是丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
[8]一种多肽，含有包含一个或多个突变的SEQ ID NO：2氨基酸序列，所述的氨基酸序列选自：
(1)一种氨基酸序列，其中6、146和256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(2)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丙氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(3)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被缬氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(4)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被丙氨酸取代；
(5)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(6)一种氨基酸序列，其中146位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(7)一种氨基酸序列，其中256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(8)一种氨基酸序列，其中146和256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(9)一种氨基酸序列，其中256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(10)一种氨基酸序列，其中146位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(11)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丙氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(12)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丙氨酸取代，146位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；以及
(13)一种氨基酸序列，其中6位和146位的半胱氨酸被丙氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代。
[9]一种多核苷酸，它编码[1]或[8]的多肽。
[10]一种载体，其中插入了[9]的多核苷酸。
[11][10]的载体，其中所述的载体中还插入了一种编码还原酶的多核苷酸。
[12][11]的载体，其中所述的还原酶是埃利民克鲁维民酵母的羰基还原酶。
[13]一种含有[10]的载体的转化体。
[14][13]的转化体，其是一种微生物。
[15]一种生产[1]或[8]的多肽的方法，所述的方法包括培养[13]的转化体的步骤。
[16]一种生产[1]或[8]的多肽和一种还原酶的方法，所述的方法包括培养一种含有[11]所述载体的转化体的步骤。
[17][16]的方法，其中所述的还原酶是埃利氏克鲁维氏酵母的羰基还原酶。
[18]一种由氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，所述的方法包括将下列(a)至(c)中的任何之一与氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸接触的步骤：
(a)[1]或[8]的多肽；
(b)[10]的转化体；以及
(c)(b)所述转化体的加工产物。
[19]一种从氧化底物生产还原型产物的方法，所述的方法包括下列步骤：
(1)通过[18]的方法生产还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；以及
(2)回收一种还原产物，该产物是通过将步骤(1)的还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和一种氧化底物与一种还原酶接触所生成的，该还原酶在还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸存在下，可以从氧化底物中生产还原产物。
[20][19]的方法，其中所述的氧化底物是一种酮，并且所述底物的还原产物是一种醇。
[21][20]的方法，其中所述的酮是4-卤乙酰乙酸酯，所述的醇为(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯。
[22][19]的方法，其中所述的还原酶是埃利民克鲁维民酵母的羰基还原酶。
[23][19]的方法，其中所述的还原酶通过[16]的方法制备。
附图说明
附图1显示质粒pSE-MCF15的结构。
附图2显示质粒pSFR415的结构。
发明详述
本发明提供来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体。
在本发明的一个优选实施方案中，此突变体是一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)的突变体，它至少包括一个突变，即一种非半胱氨酸的氨基酸取代了146位的半胱氨酸(在下文中称为“146突变体”)。在146位的取代氨基酸优选为丝氨酸或缬氨酸。146突变体可在氨基酸序列中非146位的任意位置含有一个或多个氨基酸突变，诸如取代、缺失、添加和/或插入，只要一种非半胱氨酸的氨基酸取代了146位的半胱氨酸即可。这样的突变可以被人工导入，也可以自发产生。本发明的突变体包括这两种类型的突变体。在此146突变体中突变的氨基酸的数目一般为50个氨基酸或者更少，优选30个氨基酸或者更少，特别优选10个氨基酸或者更少(例如5个氨基酸或者更少，3个氨基酸或者更少)。
在基本上纯的本发明的多肽中，当例如在非146或256位的位置存在氨基酸缺失、添加或插入等突变时，从N-末端开始计数的半胱氨酸的位置可以改变。在这些情况下，可以通过用非半胱氨酸的氨基酸至少取代改变的氨基酸序列中下述的位置的半胱氨酸而生产本发明的多肽，其位置等效于SEQ IDNO：2中的146和/或256位。换言之，本发明的多肽包括一种在有机溶剂存在下具有强甲酸脱氢酶活性的多肽，其中在相当于SEQ ID NO：2氨基酸序列146和/或256位的位置上的氨基酸已经被非半胱氨酸的氨基酸取代。
通过用SEQ ID NQ：2中半胱氨酸附近的氨基酸序列比对此半胱氨酸附近的氨基酸序列，可发现这样一种相当的位置。此种操作称为氨基酸序列的序列比对。用于进行这样一种序列比对的算法是例如BLAST。本领域的普通技术人员可以基于此种序列比对发现彼此长度不同的氨基酸序列中相当的氨基酸位置。
本文所用的与给定多肽相关的术语″基本上纯″的含义是：此多肽基本上不含其它生物大分子。以干重计，此基本上纯的多肽纯度至少为75％(例如至少为80、85、95或99％)。可以通过任何适宜的标准方法例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析，测定此纯度。
通过使用如Karlin和Altschul(美国国家科学院院刊90：5873-5877，1993)修改的Karlin和Altschul算法(美国国家科学院院刊87：2264-2268，1990)，确定两种氨基酸序列或两种核酸的“同一性百分率”。这样一种算法被编入Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，215：403-410，1990)。用NBLAST程序，分值＝100，字长＝12，进行BLAST核苷酸检索。例如在日本DNA数据库(DDBJ)中通过使用FASTA程序、BLAST程序等，可以容易地进行蛋白质的同源性检索。用XBLAST程序，分值＝50，字长＝3，进行BLAST蛋白质检索。在两种序列之间存在缺口(Gaps)的情况下，如Altsuchl等(核酸研究25：3389-3402，1997)所述，使用缺口BLAST。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省值参数。
优选将一种氨基酸取代突变为不同的氨基酸，其中此氨基酸侧链的性质是保守的。“保守性氨基酸取代”是指属于下述具有化学相似侧链的氨基酸残基组中一个被另一个替换。本领域中已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基的组。这些组包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在有机溶剂存在下，与来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)相比，146突变体优选具有强的甲酸脱氢酶活性。
在本发明中，“强的甲酸脱氢酶活性”的含义是指在有机溶剂的存在下，此酶的活性与没有有机溶剂存在下的酶活性相比，至少为70％或更高，例如80％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高。在有机溶剂的存在下，天然的甲酸脱氢酶仅仅具有低的酶活性。
而且，在本发明中，“对有机溶剂的耐受性”的含义是指甚至在有机溶剂存在下，经过一定的时间后，此酶仍保持了足够高的活性。例如，本发明的多肽在25℃、20μM 4-氯乙酰乙酸乙酯存在下保温20分钟后，仍保持了90％或者更高的酶活性。在这种同样的条件下，天然甲酸脱氢酶可丧失大部分的酶活性(为8％或者更低)。
本发明的另一个优选突变体在有机溶剂的存在下酶活性增强。在本发明中，这种酶活性增强的含义是指与没有有机溶剂存在下的酶活性相比，在有机溶剂存在下，此酶的活性为100％或更高的活性，优选105％或更高，例如100至250％。此外，“在有机溶剂存在下”是指相对于一种水性溶剂，有机溶剂为1μM或者更高，例如5至500μM，特别是5至50μM，更具体是10至30μM。
这样的有机溶剂包括，例如，乙酸酯例如乙酸乙酯、乙酸甲酯和乙酸丙酯；乙酰乙酸酯例如乙酰乙酸乙酯、和乙酰乙酸甲酯；和4-卤-3-氧丁酸酯例如4-氯乙酰乙酸乙酯和4-氯乙酰乙酸甲酯，但不局限于此。
146突变体应至少在一种有机溶剂中具有强的甲酸脱氢酶活性。这样的甲酸脱氢酶活性可以通过本领域普通技术人员所常用的方法测定。例如，这样的方法可以包括下列方法。使此酶在25℃下在一种含有100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、2.5mM NAD+和100mM甲酸钠的反应溶液中反应，以测定随着NADH量的增加在340nm吸光度的增加。1U被定义为能够1分钟催化增加1-μmol NADH的酶量。使用BioRad的蛋白测定试剂盒，通过染料结合进行多肽的定量测定。当所用的底物是有机溶剂时，特别是4-氯乙酰乙酸乙酯，而不是甲酸钠时，在这种条件下，不能看出340nm吸光度的变化。
在本发明的另一个优选实施方案中，此突变体是来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)的一种突变体，它包含至少一个突变，即一种非半胱氨酸的氨基酸取代了256位的半胱氨酸(下文称为“256突变体”)。256位的取代氨基酸优选为丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。256突变体可在氨基酸序列中非256位的任意位置含有一个或多个氨基酸突变，诸如取代、缺失、添加和/或插入，只要一种非半胱氨酸的氨基酸取代了256位的半胱氨酸即可。这种突变可人工导入或者可自发产生。本发明的突变体包括这两种类型的突变体。256突变体中的突变氨基酸数目一般地为50个氨基酸或者更少，优选为30个氨基酸或更少，而且更优选为10个氨基酸或更少(例如5个氨基酸或更少，3个氨基酸或更少)。
与来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)比较，256突变体优选地表现出对有机溶剂具有高的耐受性。这种有机溶剂例如包括，4-卤-3-氧丁酸酯，诸如4-氯乙酰乙酸乙酯、4-溴乙酰乙酸乙酯、4-碘乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸甲酯、4-氯乙酰乙酸丙酯；卤乙酰苯，诸如氯乙酰苯和溴乙酰苯；以及3-卤-1-苯-2-丙酮衍生物，诸如3-氯-1-苯-2-丙酮和3-溴-1-苯-2-丙酮，但是并不局限于此。256突变体应当对至少一种有机溶剂表现出强的耐受性。可按照下面的方法测定甲酸脱氢酶对有机溶剂的耐受性，例如对4-氯乙酰乙酸乙酯的耐受性。
将含有100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、20mM 4-氯乙酰乙酸乙酯和甲酸脱氢酶的反应溶液在25℃保温20分钟，然后加入NAD+和甲酸钠，它们的浓度分别为2.5mM和100mM。在25℃保温此反应溶液后，测定伴随NADH增加在340nm吸光度的增高。在对照试验中，将含有100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和甲酸脱氢酶的反应溶液在25℃保温20分钟后，加入NAD+、甲酸钠和4-氯乙酰乙酸乙酯，它们的终浓度分别为2.5mM、100mM和20mM。在25℃保温此反应溶液后，测定伴随NADH增加在340nm吸光度的增高。
在本发明的另一个优选实施方案中，此突变体是来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)的一种突变体，它至少包含上面提到的146和256两个位置的半胱氨酸被非半胱氨酸的氨基酸取代的突变(下文称为“146-256突变体”)。146位的取代氨基酸优选为丝氨酸或缬氨酸，256位的取代氨基酸优选为丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。对146和256位氨基酸残基以外的氨基酸残基的突变类型没有特别的限制，只要非半胱氨酸的氨基酸取代了146和256两个位置的半胱氨酸残基即可。
与来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)相比，此146-256突变体优选在有机溶剂的存在下具有强的甲酸脱氢酶活性，并且显示出对有机溶剂具有高的耐受性。
在本发明的另一个实施方案中，突变体是一种上述来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，它除了在146位和/或256位有上述突变外，还含有第6位的半胱氨酸被一个非半胱氨酸的氨基酸取代的突变。在位置6的取代氨基酸优选丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。优选在有机溶剂存在下与来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)相比具有强的甲酸脱氢酶活性和/或显示出对有机溶剂的高耐受性的突变体。
本发明的优选突变体的具体实例显示如下：
(a)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，146位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(b)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(c)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(d)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，146位的半胱氨酸被丝氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(e)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，146位的半胱氨酸被丝氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被丙氨酸取代；
(f)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，146位的半胱氨酸被丝氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(g)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，6位的半胱氨酸被丝氨酸取代；146位的半胱氨酸被丝氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(h)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，6位的半胱氨酸被丙氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(i)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，6位的半胱氨酸被缬氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(j)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，6位的半胱氨酸被丝氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被丙氨酸取代；
(k)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，6位的半胱氨酸被丝氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(l)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，6位的半胱氨酸被丙氨酸取代；146位的半胱氨酸被丝氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(m)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ IDNO：2的氨基酸序列中，6位的半胱氨酸被丙氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(n)一种来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的突变体，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，6位的半胱氨酸被丙氨酸取代；146位的半胱氨酸被丙氨酸取代；并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
在上述(a)至(n)的突变体中，突变体(a)在有机溶剂存在下显示出高的甲酸脱氢酶活性。突变体(b)、(c)、(h)、(i)、(j)、(k)和(m)显示出对有机溶剂的强耐受性。突变体(d)、(f)、(g)、(l)和(n)在有机溶剂存在下具有强的甲酸脱氢酶的活性和对有机溶剂的高的耐受性。
例如，可以通过修饰来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的氨基酸序列，获得本发明的上述突变体。可以通过一种本领域普通技术人员通常使用的方法例如定点诱变(Hashimoto-Gotoh，T.等(1995)，基因，152，271-275；Zoller，MJ，和Smith，M.(1983)，酶学方法，100，468-500)，制备这些多肽。具体地，它们可以通过下面实施例中所述的方法获得。申请人保藏了含有显示于附图2的pSFR415的大肠杆菌(JM109(pSFR415))和含有pSFR426的大肠杆菌(JM109(pSFR426))。插入质粒中的多核苷酸适用于制备本发明的突变体。
来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶中256位半胱氨酸残基附近的区域，在其它的甲酸脱氢酶中是一个保守的区域。例如，256位的半胱氨酸，与来源于构巢曲霉(现在被称为Emericella nidulans)的酶中224位的半胱氨酸，与来源于多形汉逊氏酵母(现在被称为Pichia angusta)的酶(SWISS：P33677)中228位的半胱氨酸，与来源于粗糙链孢霉的酶(SWISS：NEUFDHA)中228位的半胱氨酸，和来源于假单孢菌菌种101的酶(SWISS：P33160)中255位的半胱氨酸相对应。
另外，来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶中146位的半胱氨酸残基附近的区域，在其它的甲酸脱氢酶中也是一个保守的区域；例如此残基与来源于假单孢菌菌种101的酶(SWISS：P33160)(应用微生物与生物技术44，479-483，1995)中145位的半胱氨酸残基相对应。预计在这些已知酶中，通过定点诱变修饰，可以提高对有机溶剂的耐受性和/或有机溶剂的激活效应。
另外，本发明涉及编码甲酸脱氢酶突变体的分离的多核苷酸。
在此处所用的“分离的多核苷酸”是这样一种多核苷酸，它的结构与任意天然的多核苷酸的结构不同，或者与天然的跨越3个以上独立基因的基因组多核苷酸的任意片段的结构不同。因此这个名词包括：例如：(a)一种DNA，它具有生物体基因组中部分天然基因组DNA分子的序列；(b)一种被掺入载体或者原核生物或真核生物的基因组DNA中的多核苷酸，所用掺入方式使所得分子与任意天然的载体或基因组DNA不同；(c)一种分离的分子，诸如cDNA、基因组片段、由聚合酶链反应(PCR)生成的片段或者限制性片段；以及(d)一种重组核苷酸序列，它是杂合基因即编码融合多肽的基因的一部分。从此定义中特别除外的是存在于不同的(i)DNA分子、(ii)转染细胞或(iii)细胞克隆的混合物中的DNA分子的多核苷酸；例如，在诸如cDNA文库或基因组DNA文库等DNA文库中出现的这些多核苷酸。
相应地，在一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，它编码此处所述的多肽或其片段。优选这种分离的多肽包括与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更优选，这种分离的核酸分子至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多地与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列相同。对于长于参照序列(例如SEQ ID NO：1)或与其长度相等的分离的多核苷酸，用此参照序列的全长进行对比。对于短于参照序列，例如短于SEQ ID NO：1的分离的多核苷酸，用参照序列中相同长度的节段(同源性计算所需要的任意环除外)进行对比。
例如通过定点诱变将核苷酸取代导入编码SEQ ID NO：1的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的多核苷酸可获得本发明的编码甲酸脱氢酶突变体的多核苷酸，此处的定点诱变是本领域技术人员常用的方法。
通过将编码本发明甲酸脱氢酶突变体的多核苷酸(按这种方法获得的)插入一种已知的表达载体，本发明可提供甲酸脱氢酶突变体的表达载体。通过培养已用此表达载体转化的转化体，可获得本发明的甲酸脱氢酶突变体，它为一种重组多肽。
本发明还提供甲酸脱氢酶突变体和还原酶的表达载体，它可通过将编码本发明甲酸脱氢酶突变体的多核苷酸和编码还原酶的多核苷酸插入一种已知的表达载体而获得。通过培养已用此表达载体转化的转化体，可获得本发明的甲酸脱氢酶突变体和还原酶，它们为重组多肽。这种还原酶优选为一种羰基还原酶。特别地，这种还原酶包括，例如，来源于下列微生物的羰基还原酶。
·棒状杆菌ST-10(应用环境微生物学63，3783-3788，1997)
·近平滑假丝酵母IFO 1396(JP-A Hei 07-231785)
·真养产碱杆菌N9A(细菌学杂志.170，5248-5256，1988)
·土生丛毛单孢菌(Biochim.Biophys.Acta661，74-86，1981)
·白地霉IFO 4597(已审查并公布的日本专利申请(JP-B)No.Hei 01-27715)
·Hansenula ofunaensis AKU 4328(生物科学与生物工程杂志.88，148-152，1999)
·红粉诺卡氏菌ATCC 4277(应用环境微生物学61，3729-3722，1995)
·褐色诺卡氏菌
·毕赤氏酵母NRRL-Y-11328(应用生物化学杂志3，218-232，1981)
·假单胞菌PED(ATCC 49794)(US 5385833)
·红串红球菌DSM743(生物技术杂志.33，283-292，1994)
·红串红球菌(Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 115，239-243，1996)
·球形红假单胞菌(Tetrahedron Asym.4，1259-1269，1993)
·硫磺矿硫化叶菌MT-4(生物技术通讯.13，31-34，1991)
·Pichia finlandica DSM 70280(WO 01/61024)
在本发明中，对用于转化以表达甲酸脱氢酶突变体和/或还原酶的微生物类型没有特别限制，只要用含有编码这种甲酸脱氢酶突变体的多核苷酸和/或编码还原酶的多核苷酸的重组载体可将这种微生物转化，而且这种微生物可表达这种甲酸脱氢酶变体和/或还原酶即可。生产本发明的甲酸脱氢酶突变体和/或还原酶的方法也在本发明的范围之内，此方法包括这种转化体和培养这种转化体的步骤。可用于充当这种转化体宿主生物体的微生物包括，例如，下面的微生物：
·用于开发宿主载体系统的细菌，诸如属于埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、链球菌属或乳芽孢杆菌属的那些细菌；
·用于开发宿主载体系统的放线菌，诸如属于红球菌属或链霉菌属的那些放线菌；
·用于开发宿主载体系统的酵母菌，诸如属于糖酵母属、克鲁维氏酵母属、裂殖糖酵母属、接合糖酵母属、Yarrowia、丝孢酵母属、红冬孢属、毕赤氏酵母属或假丝酵母属的那些酵母菌；和
·用于开发宿主载体系统的真菌，诸如属于链孢霉属、曲霉属、头孢属或木霉属的那些真菌。
生产转化体和构建适于宿主的重组载体的方法可按照分子生物学、生物工程学和基因工程学领域已知的标准技术进行(例如：Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室)。为在微生物细胞中表达本发明的甲酸脱氢酶突变体基因和/或还原酶基因，首先将本发明的多核苷酸插入此微生物中稳定存在的质粒载体或phase载体，并转录和翻译其遗传信息。将调控转录和翻译的启动子插入本发明多核苷酸的5’-上游；优选还将一种终止子插入此多核苷酸的3’-下游。此启动子和终止子将在用作宿主细胞的微生物中起作用。例如，在各种微生物中起作用的载体、启动子和终止子描述在“BiseibutsugakuKisokouza(微生物学的基本教程(Basic Course of Microbiology))第8卷Idenshikougaku(基因工程)，Kyoritsu shuppan Co.Ltd.”中，特别是对于酵母菌，描述在“Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)，酵母菌8，423-488(1992)”等中。
例如，诸如pBR和pUC系列的质粒载体以及诸如β半乳糖苷酶(lac)、色氨酸操纵子(trp)、tac、trc(lac和trp的融合体)的那些启动子和来源于λ-噬菌体PL、PR等的那些启动子可用于埃希氏杆菌属，特别是大肠杆菌。也可应用来源于trpA、噬菌体和rrnB核糖体RNA的终止子。
诸如pUB110和pC194系列的载体可用于芽孢杆菌属，并且可整合入染色体中。可应用诸如碱性蛋白酶(apr)、中性蛋白酶(npr)和amy(α-淀粉酶)等的那些启动子和终止子。
已经开发了用于假单胞菌属，尤其是恶臭假单胞菌和葱头假单胞菌的宿主载体系统。可应用一种基于质粒TOL的广宿主范围载体pKT240(包含来源于RSF1010的自主复制必需的基因)，质粒TOL参与甲苯化合物的降解。可应用一种脂肪酶基因(JP-A Hei 5-284973)等等的启动子和终止子。
诸如pAJ43(基因39，281(1985))等的质粒载体可用于短杆菌属，尤其是乳发酵短杆菌。用于埃希氏杆菌属的启动子和终止子可用于这种微生物。
诸如pCS11(JP-A Sho 57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984))的质粒载体可用于棒状杆菌属，尤其是谷氨酸棒状杆菌。
诸如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.，26，239(1985))和pGK1(Appl.Znviron Microbiol.(应用环境微生物学)，50，94(1985))等质粒载体可用于链球菌属。
用于链球菌属而开发的pAMβ1(细菌学杂志.137，614(1979))可用于乳酸杆菌属，并且用于埃希氏杆菌属的某些启动子也可应用。
一种从紫红红球菌等分离的质粒载体可用于红球菌属(普通微生物学杂志，138，1003(1992))。
可按照“Genetic Manipulation of Streptomyces：A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratories by Hopwood et al.(1985)”中所述的方法构建在链霉菌属中起作用的质粒。例如，可应用pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478(1986))、pKC1064(基因103，97-99(1991))和pUWL-KS(基因165，149-150(1995))，特别是将它们用于变青链霉菌。这种质粒也可用于维及尼链霉菌(Actinomycetol.11，46-53(1997))。
诸如YRp、YEp、YCp和YIp系列的质粒可用于糖酵母属，尤其是啤酒糖酵母。应用与基因组DNA中的多拷贝核糖体DNA的同源重组的整合载体(诸如EP 537456)是非常有用的，这是因为所述整合载体可将多拷贝的基因导入宿主基因组中，并稳定地保持这种基因。而且也可应用乙醇脱氢酶(ADH)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、酸性磷酸酶(PHO)、β-半乳糖苷酶(GAL)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、烯醇化酶(ENO)等等的启动子和终止子。
诸如来源于啤酒糖酵母的2μm质粒系列、pKD1质粒系列(细菌学杂志.145，382-390(1981))、来源于与杀伤活性有关的pGK11的质粒、来源于克鲁维氏酵母属包含自主复制基因的KARS质粒系列，以及通过与核糖体DNA同源重组而可整合入染色体的载体质粒(诸如EP 537456)等的质粒可用于克鲁维氏酵母属，特别是乳克鲁维氏酵母。可应用来源于ADH和PGK的启动子和终止子。
包含来源于粟酒裂殖糖酵母的ARS(与自主复制有关的基因)和包含补充啤酒糖酵母的营养缺陷型的选择性标志的质粒载体可用于裂殖糖酵母属(分子细胞生物学6，80(1986))。而且来源于粟酒裂殖糖酵母的ADH启动子也是可利用的(EMBO J.6，729(1987))。特别是pAUR224可从Takara Shuzo购买到。
诸如来源于Zygosaccharomyces rouxii的pSB3(核酸研究，13，4267(1985))质粒载体可用于接合糖酵母属。来源于啤酒糖酵母的PHO5和来源于Zygosaccharomyces rouxii的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP-Zr)(农业生物化学，54，2521(1990))等的启动子是可以利用的。
已经为毕赤氏酵母属中的Pichia angusta(原来的名称为；多形汉逊氏酵母)开发了一种宿主-载体系统。可用的载体包括与自主复制相关的来源于Pichia angusta的基因(HARS1和HARS2)，但相对来说它们是不稳定的。因此，将多拷贝的此基因整合至染色体中是有效的(酵母，7，431-443(1991))。由甲醇等诱导的AOX(乙醇氧化酶)和FDH(甲酸脱氢酶)启动子也是可利用的。已经应用来源于毕赤氏酵母属的与自主复制相关的PARS1和PARS2等基因开发了用于巴斯德毕赤氏酵母的宿主载体系统(分子细胞生物学，5，3376(1985))。诸如由高密度培养物和甲醇诱导的具有强启动子活性的AOX启动子的启动子是可利用的(核酸研究，15，3859(1987))。
对于假丝酵母属，已经开发了用于麦芽糖假丝酵母、白色假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母等的宿主载体系统。已经开发了应用ARS的麦芽糖假丝酵母的载体，ARS是由此菌株克隆的(农业生物化学，51，51，1587(1987)。已经开发了用于产朊假丝酵母的可整合至染色体的载体的强启动子(JP-A Hei 08-173170)。
在曲霉属中，已经对黑色曲霉和米曲霉进行了广泛地研究。可整合至染色体的质粒是可用的。来源于胞外蛋白酶和淀粉酶的启动子是可用的(生物技术的趋势，7，283-287(1989))。
对于木霉属，研究开发了基于Trichoderma reesei的宿主载体系统，而且来源于胞外纤维素酶基因的启动子是可以用的(生物技术，7，596-603(1989))。
除了应用于微生物的宿主载体系统外，已经开发了各种应用于植物和动物的宿主载体系统。特别是，已经开发了在昆虫中，特别是蚕中生产大量外源多肽的表达系统(自然，315，592-594(1985))，以及在诸如油菜籽、玉米和马铃薯等的植物中生产大量外源多肽的表达系统，而且它们是可以利用的。
可用于本发明的能够生产甲酸脱氢酶突变体的微生物包括能够生产甲酸脱氢酶突变体的牝牛分枝杆菌的突变株、它的变种以及它的转化菌株，它们是通过应用基因操作而产生的，它们具有了生产本发明的酶的能力。
本发明还提供应用本发明甲酸脱氢酶突变体由NAD+(氧化型的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)生产辅酶NADH(还原型的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的方法，此甲酸脱氢酶突变体是本发明的一种转化体或此转化体的一种加工产物。辅酶NADH可用作各种羰基还原酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶的还原辅酶；因此它是这些酶还原活性的一种必需辅酶。
另外，本发明还提供一种方法，当从NAD+再生NADH时，此方法可有效地生产一种还原产物，所述NAD+是在氧化底物的还原产物的生产过程中，经过应用本发明的甲酸脱氢酶突变体将甲酸转化为碳酸的反应，通过NADH-依赖性还原酶从所述底物生产的。此NADH依赖性还原酶是指参与NADH充当辅酶的还原反应的一种酶，它可以为，例如，一种既能催化还原反应，又能催化氧化反应的酶，诸如醇脱氢酶。而且在上面的方法中，可以应用本发明的一种转化体，或者该转化体的加工产物代替本发明甲酸脱氢酶突变体。
上面提到的NADH依赖性还原酶、它的氧化底物、由此底物产生的还原产物包括，例如，下面的组合，但是它们并不仅限于此。
·由酮产生醇，它是通过一种酶(E.C.1.1.1.-)将羰基作为一种底物而产生醇。
·由羧酸产生醛，它是通过一种酶(E.C.1.2.1.-)将羧酸作为一种底物而产生醛。
·由含有碳-碳双键的化合物产生含有碳-碳单键的化合物，它是通过一种酶(E.C.1.3.1.-)经碳-碳双键的还原反应产生碳-碳单键。
·由酮酸产生氨基酸，它是通过一种酶(E.C.1.4.1.-)经过将一种羰基用作底物的还原胺化作用产生一种氨基。
·由烯烃产生的二醇，它是通过一种酶(E.C.1.14.12.-)经过将氧加至碳-碳双键而产生二醇。
在这里，归类入E.C.1.1.1.-的酶包括，例如，醇脱氢酶、D-羟基异己酸脱氢酶、L-羟基异己酸脱氢酶、D-扁桃酸脱氢酶、L-扁桃酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶。归类入E.C.1.2.1.-的酶包括，例如，醛脱氢酶。归类入E.C.1.3.1.-的酶包括，例如，烯酰-CoA还原酶和富马酸还原酶。归类入E.C.1.4.1.-的酶包括，例如，苯丙氨酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶。归类入E.C.1.14.2.-的酶包括，例如，苯双加氧酶。
对这些酶底物的类型没有特别限制，只要它是这些酶作用的一种化合物。这样的底物包括，例如，含有分子内卤素、硫和/或磷等的化合物；含有羟基、氨基等的化合物；碳链为支链的化合物；碳链为不饱和的化合物；以及含有包括杂环的芳香环的化合物。
因为本发明的甲酸脱氢酶突变体对有机溶剂具有耐受性和/或可被有机溶剂激活，它的活性可保持一长段时间和/或可有足够高的活性，例如甚至在酮和醇存在的情况下；并且因此它在生产醇的工业过程中是有利的。另外，对羰基还原酶的类型没有特别的限制，只要在NADH用作辅酶的情况下它可由酮产生醇即可。通过将酶分子、它的加工产物、含酶分子的培养物或产生此酶的微生物转化体等与反应溶液接触，可完成这种所需的酶反应。所用的转化体形式可以是培养液；通过过滤、离心等方法从培养基中分离的细胞；或者经离心分离和冲洗而后再悬浮在缓冲液、水等中的细胞。所用分离的细胞可以是回收的细胞、破裂的细胞、用丙酮或甲苯处理的细胞或者冷冻干燥的细胞。当此酶是在胞外产生时，在通过常用的方法将它从转化体分离后，也可应用转化体的培养基。酶和反应溶液的接触形式并不局限于这些特殊实例。反应溶液是通过将这种酶反应所需要的底物和辅酶NADH溶解在适宜于这种酶活性的溶剂中而制备的。含有本发明甲酸脱氢酶一种突变体的微生物的加工产物，或者含有羰基还原酶的微生物的加工产物特别包括细胞膜通透性已经被去污剂或诸如甲苯的有机溶剂改变的微生物，还包括用玻璃珠或酶处理破碎微生物细胞而获得的无细胞提取物，以及它的部分纯化物质。
对于在本发明醇的生产中充当原料的酮的类型没有特别限制，只要它可被所用的羰基还原酶还原即可。当应用来源于埃利氏克鲁维氏酵母的羰基还原酶时，适宜应用4-卤乙酰乙酸酯。4-卤乙酰乙酸酯的还原产生(S)-4-卤-3-羟丁酸酯。4-卤乙酰乙酸酯中的卤素包括，例如，溴、氯、碘等等，而且特别优选氯。此酯包括，例如，含有直链、支链和芳香取代的醇酯，诸如甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、辛酯和苄酯；乙酯最适宜。4-卤乙酰乙酸酯衍生物包括，例如，含有烷基链和卤素的衍生物，其中烷基链在第2位上含有直链或支链，并且卤素诸如为氯、溴和碘。
应用本发明酶的反应可在水、不溶于水有机溶剂诸如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、环己烷、1-辛醇、正己烷、正辛烷，或含有水溶剂的非均相双溶剂系统中进行。另外，它也可在一种混合溶剂系统中进行，其中含诸如缓冲液的水性溶剂和诸如甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和丙酮的水溶性溶剂。此反应也可在一种反相胶束系统(reversed micelle system)中进行。这种系统包括，例如，Aerosol OT充当洗涤剂的异辛烷/水反相胶束系统。
本发明的反应可通过应用例如固定化酶、膜反应器等完成。当要固定本发明的酶、它的加工产物、含有此酶分子的培养物或者产生此酶的微生物转化体等时，可通过已知的方法完成这种固定，已知的方法诸如为含硫多糖(例如κ-角叉菜胶)、藻酸钙、琼脂凝胶法和聚丙烯酰胺凝胶法。
而且本发明的反应可在任意反应条件下进行，只要在这些条件下本发明的酶可以起作用即可。反应的温度可以是4至60℃，优选10至37℃；反应的pH值可为3至11，优选为5至8；底物的浓度范围可为0.01至90％，优选为0.1至30％。当要在此反应中应用微生物细胞或其加工产物时，如果需要，可将辅酶NAD+或NADH加入此反应系统中，浓度为0.001至100mM，优选为0.01至10mM。而且，可在反应的开始加入底物，但优选连续地或逐步地加入它，以便反应混合物中底物的浓度不会太高。
可通过适当地联合应用微生物细胞和多肽的离心分离、应用膜处理等的分离、通过溶剂提取、蒸馏、结晶等方法，对按照本发明经酮的还原而产生的醇进行纯化。例如，可通过离心分离含有微生物细胞的反应混合物，以除去微生物细胞；通过超滤除去多肽；通过将诸如乙酸乙酯或甲苯的溶剂加入滤液，以将4-卤-3-羟丁酸酯提取至溶剂层中；并且然后进行相分离后，通过在减压下进行浓缩，这样可纯化高纯度的4-卤-3-羟丁酸酯。
本发明提供的是甲酸脱氢酶的突变体，它们对有机溶剂具有耐受性和/或可被有机溶剂激活。应用本发明的酶可从氧化形式的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸有效地生产还原形式的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。另外，通过应用本发明的酶从氧化形式的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸有效地再生还原形式的辅酶β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，可在通过羰基还原酶的介导从酮生产醇的过程中高产量地生产醇。
在这里引用的任何专利、专利申请和出版物皆列入本文作为参考。
下面根据实施例详细地举例说明本发明，但并不是要将本发明限制于此。
本文中，除非进行特殊说明，用于浓度的“％”是指重量/体积百分比。
实施例1
来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的亚克隆
从一个参考文献中(应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.))，44，479-483(1995))已述的质粒pMcFDH(E-P)亚克隆甲酸脱氢酶。基于文献所示的结构基因的5’末端和3’末端序列合成引物MCF-ATG2(5’-CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTGTGTTC-3’/SEQ ID NO：3)和MCF-TAA3(5’-CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG-3’/SEQ ID NO：4)，以克隆仅含甲酸脱氢酶开放阅读框的区域。将质粒(pMcFDH(E-P))作为模板进行PCR，循环30遍(95℃，45秒、50℃，1分钟、75℃，7分钟)，获得特异性扩增DNA。用NcoI和XbaI两个限制性内切核酸酶将所得DNA片段进行双酶切。用NcoI和XbaI将质粒载体pSE420D(JP-A 2000-189170)进行双酶切，并用T4 DNA连接酶将用这些酶双酶切的PCR扩增DNA片段与之连接；因此获得pSE-MCF15。质粒的图谱显示在附图1(pSE-MCF15)中。插入的DNA片段的核苷酸序列分析表明编码此蛋白质的序列与参考文献中所述的DNA序列一致。测定的甲酸脱氢酶核苷酸序列显示在McFDH-ORF(SEQ IDNO：1)中，此基因编码的蛋白质氨基酸序列显示在McFDH-ORF-p(SEQ IDNO：2)。
实施例2
来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶和来源于埃利氏克鲁维氏酵母的羰基还原酶的共表达载体pSFR415的构建
为了通过PCR克隆仅含来源于埃利民克鲁维氏酵母的羰基还原酶开放阅读框的区域，合成引物KAR-BSG5-3(5’-TAATCTAGAGGAATTCAATAATGGATCCAACAATGACGTTTC-3’/SEQ ID NO：5)和KAR-BSG3(5’-TAGAAGCTTAAGCTATTAAACGCAAGTGTACCCAC-3’/SEQ ID NO：6)。将pSE-KAR1(JP-A 2000-236883)作为模板进行PCR，循环30遍(95℃，30秒、50℃，1分钟、75℃，5分钟)，以获得特异性扩增的DNA。用XbaI和HindIII两个限制性内切核酸酶对所得DNA片段进行双酶切。用XbaI和HindIII两个限制性内切核酸酶对实施例1中构建的含有来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的质粒pSE-MCF15进行双酶切，并用T4 DNA连接酶将用这些酶双酶切的PCR扩增DNA片段与之连接；因此获得pSFR415，它可共表达甲酸脱氢酶和羰基还原酶。质粒pSFR415的图谱显示在附图2中。含有此质粒的大肠杆菌(JM109(pSFR415))保藏如下：
保藏机构的名称和地址
名称：国家高级工业科学和技术协会(AIST)，专利和生物资源中心
(前名称：日本通商产业省工业技术院，工学工业技术研究所)
地址：日本，Ibaraki，Tsukuba，Higashil-1-3，AISTTsukuba中心6号
(邮政编码：305-8566)
保藏日期(原始保藏日期)：2000年11月10日
入藏号：FERM BP-7391
实施例3
通过PCR将突变导入来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶
在实施例2构建的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶和来源于埃利民克鲁维氏酵母的羰基还原酶的共表达载体pSFR415的基础上，合成在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶6位上用丝氨酸取代半胱氨酸的引物MCF-ATG3(5’-CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTCTGTTC-3’/SEQID NO：7)和在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶256位上用丝氨酸取代半胱氨酸的引物McFDH-7mut01(5’-GTATCCGGTTTGCGACGTCGTGACGCTGAACTCCCCGCTGCACCCCGAA-3’/SEQ ID NO：8)和引物McFDH-7mut02(5’-TTCGGGGTGCAGCGGGGAGTTCAGCGTCACGACGTCGCAAACCGGATAC-3’/SEQ ID NO：9)。在下文中在6位上用丝氨酸取代半胱氨酸称为″C6S″。按照这个规则，在256位上用丝氨酸取代半胱氨酸称为″C256S″。
应用模板质粒pSFR415和一组引物MCF-ATG3和McFDH-7mut02以及一组引物McFDH-7mut01和MCF-TAA3进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-TAA3(SEQ IDNO：4)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。用限制性内切核酸酶NcoI和XbaI双酶切所得扩增PCR片段。用两个限制性内切核酸酶NcoI和XbaI双酶切pSFR415，并用T4 DNA连接酶将用相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR411，此质粒可共表达已导入突变C6S和C256S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例4
含有C6S、C146S和C256S突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
在实施例3所得的质粒pSFR411基础上，合成引物McFDH-12F(5’-CGGAAGTCACCTACTCAAACTCGATCAGCGTCG-3’/SEQ ID NO：10)和McFDH-12R(5’-CGACGCTGATCGAGTTTGAGTAGGTGACTTCCG-3’/SEQID NO：11)，它们在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶146位上用丝氨酸取代半胱氨酸。
应用模板质粒pSFR411和一组引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和McFDH-12R(SEQ ID NO：11)以及一组引物McFDH-12F(SEQ ID NO：10)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。用两个限制性内切核酸酶NcoI和XbaI双酶切所得扩增PCR片段。用两个限制性内切核酸酶NcoI和XbaI双酶切pSFR411，并用T4 DNA连接酶将用相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR412，此质粒可共表达已导入突变C6S、C146S和C256S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例5
含有C6S、C249S和C256S突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
在实施例3所得的质粒pSFR411基础上，合成引物McFDH-13F(5’-GACATGTATCCGGTTTCTGACGTCGTGACGCTG-3’/SEQ ID NO：12)和McFDH-13R(5’-CAGCGTCACGACGTCAGAAACCGGATACATGTC-3’/SEQID NO：13)，它们在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶位置249上用丝氨酸取代半胱氨酸。
应用模板质粒pSFR411和一组引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和McFDH-13R(SEQ ID NO：13)以及一组引物McFDH-13F(SEQ ID NO：12)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。用两个限制性内切核酸酶NcoI和XbaI双酶切所得扩增PCR片段。用两个限制性内切核酸酶NcoI和XbaI双酶切pSFR411，并用T4 DNA连接酶将用相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR413，此质粒可共表达已导入突变C6S、C249S和C256S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例6
含有C6S、C256S和C355S突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
在所得质粒pSFR411基础上，合成引物McFDH-14F(5’-CGAGATCCTGGAGTCATTCTTCGAAGGCCGTCCGA-3’/SEQ ID NO：14)和McFDH-14R(5’-TCGGACGGCCTTCGAAGAATGACTCCAGGATCTCG-3’/SEQ ID NO：15)，它们在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶355位上用丝氨酸取代半胱氨酸。
应用模板质粒pSFR411和一组引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和McFDH-14R(SEQ ID NO：15)以及一组引物McFDH-14F(SEQ ID NO：14)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。用两个限制性内切核酸酶NcoI和XbaI双酶切所得扩增PCR片段。用两个限制性内切核酸酶NcoI和XbaI双酶切pSFR411，并用T4 DNA连接酶将用相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR414，此质粒可共表达已导入突变C6S、C256S和C355S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例7
含有C6A和C256S突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
在实施例3所得质粒pSFR411基础上，合成引物MCF-416F(5’-ATGGCAAAAGTTTTAGCTGTTCTTTACGAT-3’/SEQ ID NO：16)和MCF-416R(5’-ATCGTAAAGAACAGCTAAAACTTTTGCCAT-3’/SEQ ID NO：17)，它们在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶6位上用丙氨酸取代一个残基，以及合成引物170F (5’-GGCAAATATTCTGAAATGAGC-3’/SEQ ID NO：18)和MCF-777R(5’-TCACGACGTCGCAAACCGGA-3’/SEQ ID NO：19)。
应用模板质粒pSFR411和一组引物170F(SEQ ID NO：18)和MCF-416R(SEQ ID NO：17)以及一组引物MCF-416F(SEQ ID NO：16)和MCF-777R(SEQ ID NO：19)进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物170F(SEQ ID NO：18)和MCF-777R(SEQ ID NO：19)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。
用两个限制性内切核酸酶NheI和BglII双酶切所得扩增PCR片段。用两个限制性内切核酸酶NheI和BglII双酶切pSFR411，并用T4 DNA连接酶将用相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR416，此质粒可共表达已导入突变C6A和C256S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例8
含有C6V和C256S突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
在实施例3所得质粒pSFR411基础上，合成引物MCF-417F(5’-ATGGCAAAAGTTTTAGTAGTTCTTTACGAT-3’/SEQ 20 ID NO：20)和MCF-417R(5’-ATCGTAAAGAACTACTAAAACTTTTGCCAT-3’/SEQ ID NO：21)，它们在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶6位上用缬氨酸取代一个残基。
应用模板质粒pSFR411和一组引物170F(SEQ ID NO：18)和MCF-417R(SEQ ID NO：21)以及一组引物MCF-417F(SEQ ID NO：20)和MCF-777R(SEQ ID NO：19)进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物170F(SEQ ID NO：18)和MCF-777R(SEQ ID NO：19)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。
用两个限制性内切核酸酶NheI和BglII双酶切所得扩增PCR片段。用两个限制性内切核酸酶NheI和BglII双酶切pSFR411，并用T4 DNA连接酶将用相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR417，此质粒可共表达已导入突变C6V和C256S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例9
含有C6S和C256A突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
在实施例3所得质粒pSFR411基础上，合成引物MCF-418F(5’-GTGACGCTGAACGCTCCGCTGCACCCC-3’/SEQ ID NO：22)和MCF-418R(5’-GGGGTGCAGCGGAGCGTTCAGCGTCAC-3’/SEQ ID NO：23)，它们在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶256位上用丙氨酸取代一个残基。
应用模板质粒pSFR411和一组引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-418R(SEQ ID NO：23)以及一组引物MCF-418F(SEQ ID NO：22)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。
用两个限制性内切核酸酶BglII和XbaI双酶切所得扩增PCR片段。用两个限制性内切核酸酶BglII和XbaI双酶切pSFR411，并用T4 DNA连接酶将相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR418，此质粒可共表达已导入突变C6S和C256A的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例10
含有C6S和C256V突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
在实施例3所得质粒pSFR411基础上，合成引物MCF-419F(5’-GTGACGCTGAACGTTCCGCTGCACCCC-3’/SEQ ID NO：24)和MCF-419R(5’-GGGGTGCAGCGGAACGTTCAGCGTCAC-3’/SEQ ID NO：25)，它们在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶256位上用缬氨酸取代一个残基。
应用模板质粒pSFR411和一组引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-418R(SEQ ID NO：23)以及一组引物MCF-418F(SEQ ID NO：22)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒，25次循环)。用两个限制性内切核酸酶BglII和XbaI双酶切所得扩增PCR片段。用两个限制性内切核酸酶BglII和XbaI双酶切pSFR411，并用T4 DNA连接酶将用相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR419，此质粒可共表达已导入突变C6S和C256V的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例11
含有C146S突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
用两个限制性内切核酸酶BglII和BsrBRI酶切实施例2中构建的pSFR415，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约6kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶BglII和BsrBRI酶切实施例4中构建的pSFR412，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约0.4kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。这两个DNA片段混合在一起(摩尔量相等)，然后用T4 DNA连接酶将它们彼此连接。然后获得一种质粒pSFR420，此质粒可共表达已导入突变C146S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例12
含有C256S突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
用两个限制性内切核酸酶MluI和BsrBRI酶切实施例2中构建的pSFR415，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约1.5kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶MluI和BsrBRI酶切实施例4中构建的pSFR412，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约4.8kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。这两个DNA片段混合在一起(摩尔量相等)，然后用T4DNA连接酶将它们彼此连接。然后获得一种质粒pSFR421，此质粒可其表达已导入突变C256S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例13
含有C146S和C256S突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
用两个限制性内切核酸酶MluI和BglII酶切实施例2中构建的pSFR415，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约1.3kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶MluI和BglII酶切实施例4中构建的pSFR412，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约5.1kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。这两个DNA片段混合在一起(摩尔量相等)，然后用T4 DNA连接酶将它们彼此连接。然后获得一种质粒pSFR422，此质粒可共表达已导入突变C146S和C256S的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例14
含有C256V突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
用两个限制性内切核酸酶MluI和BglII酶切实施例2中构建的pSFR415，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约1.3kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶MluI和BglII酶切实施例10中构建的pSFR419，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约5.1kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。这两个DNA片段混合在一起(摩尔量相等)，然后用T4 DNA连接酶将它们彼此连接。然后获得一种质粒pSFR423，此质粒可共表达已导入突变C256V的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例15
含有C146S和C256V突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
用两个限制性内切核酸酶MluI和BglII酶切实施例2中构建的pSFR415，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约1.3kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶MluI和BsrBRI酶切实施例4中构建的pSFR412，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约0.4kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶MluI和BsrBRI酶切实施例10中构建的pSFR419，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约4.7kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。这两个DNA片段混合在一起(摩尔量相等)，然后用T4 DNA连接酶将它们彼此连接。然后获得一种质粒pSFR424，此质粒可共表达已导入突变C146S和C256V的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例16
含有C6A和C256V突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
用两个限制性内切核酸酶MluI和BglII酶切实施例7中构建的pSFR416，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约1.3 kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶MluI和BglII酶切实施例10中构建的pSFR419，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约5.1kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。这两个DNA片段混合在一起(摩尔量相等)，然后用T4 DNA连接酶将它们彼此连接。然后获得一种质粒pSFR425，此质粒可共表达已导入突变C6A和C256V的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例17
含有C6A、C146S和C256V突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
用两个限制性内切核酸酶MluI和BglII酶切实施例7中构建的pSFR416，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约1.3kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶MluI和BsrBRI酶切实施例4中构建的pSFR412，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约0.4kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。用两个限制性内切核酸酶MluI和BsrBRI酶切实施例10中构建的pSFR419，并用乙醇沉淀后，对其进行琼脂糖电泳。切下大约4.7kbp的带，应用Sephaglas BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收此带中的所含的DNA。这两个DNA片段混合在一起(摩尔量相等)，然后用T4 DNA连接酶将它们彼此连接。然后获得一种质粒pSFR426，此质粒可共表达已导入突变C6A、C146S和C256V的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。含有此质粒的大肠杆菌(JM109(pSFR426))保藏如下：
保藏机构的名称和地址
名称：国家高级工业科学和技术协会(AIST)，专利和生物资源中心
(前名称：日本通商产业省工业技术院，工学工业技术研究所)
地址：日本，Ibaraki，Tsukuba，Higashil-1-3，AISTTsukuba中心6号
(邮政编码：305-8566)
保藏日期(原始保藏日期)：2000年11月10日
入藏号：FERM BP-7392
实施例18
含有C6A、C146A和C256V突变的来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的构建
在实施例15所得质粒pSFR426基础上，合成引物MCF-427F(SEQ IDNO：26)和MCF-427R(SEQ ID NO：27)，它们在来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶146位上用丙氨酸取代一个残基。
MCF-427F(SEQ ID NO：26)
GAAGTCACCTACGCTAACTCGATCAGC
MCF-427R(SEQ ID NO：27)
GCTGATCGAGTTAGCGTAGGTGACTTC
应用模板质粒pSFR426和一组引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-427R(SEQ ID NO：27)以及一组引物MCF-427F(SEQ ID NO：26)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)进行第一轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，60秒，25次循环)。然后，稀释并混合第一轮PCR扩增的DNA片段，并将引物MCF-ATG3(SEQ ID NO：7)和MCF-TAA3(SEQ ID NO：4)加入其中。然后，进行第二轮PCR(94℃，30秒、50℃，30秒、72℃，60秒，25次循环)。
用两个限制性内切核酸酶BglII和XbaI双酶切所得扩增PCR片段。
用两个限制性内切核酸酶BglII和XbaI双酶切pSFR426，并用T4 DNA连接酶将用相同酶酶切的PCR扩增片段与之连接。因此获得一种质粒pSFR427，此质粒可共表达已导入突变C6A、C146A和C256V的甲酸脱氢酶和羰基还原酶。对所得质粒进行核苷酸序列分析，以证实它含有所需要的突变。
实施例19
来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶和来源于埃利民克鲁维氏酵母的羰基还原酶在大肠杆菌中的共表达
用实施例2至18中构建的共表达来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶和来源于埃利民克鲁维氏酵母的羰基还原酶的每一种质粒转化大肠杆菌W3110菌株。将每种重组大肠杆菌接种至液体培养基中(1％bacto-triptone、0.5％细菌培养用酵母提取物、1.0％氯化钠；下文称为LB培养基)，并在30℃培养过夜。然后将异丙基硫代-β-半乳糖苷(下文称为IPTG)加入此培养基中，并继续进行培养。通过离心分离收获这些细菌细胞，然后将这些细胞悬浮在含0.02％2-巯基乙醇和10mM乙二胺四乙酸二钠的100mM磷酸钾缓冲液中(pH 7.0)。通过用一种气密超声仪UCD-200TM(Cosmo Bio)处理3分钟，使这些细菌细胞破裂。通过离心分离细菌细胞的裂解物，回收所得上清液，作为细菌细胞提取物。测定甲酸脱氢酶活性和还原4-氯乙酰乙酸乙酯的活性。通过一种Bio-Rad蛋白测定试剂盒(Bio-Rad)测定蛋白质的量。所用的标准蛋白质是牛血浆白蛋白。由每种重组大肠杆菌所得的粗酶溶液中的酶活性显示在表1中。表1
U/mg蛋白质粒 6-半胱氨酸 146-半胱氨酸 256-半胱氨酸 FDH ECAA-RpSFR415 半胱氨酸 半胱氨酸 [半胱氨酸] 1.46 1.99pSFR412 *丝氨酸* *丝氨酸* *丝氨酸* 0.127 2.15pSFR416 #丙氨酸# 半胱氨酸 *丝氨酸* 0.751 1.85pSFR417 ＝缬氨酸＝ 半胱氨酸 *丝氨酸* 0.659 1.56pSFR418 *丝氨酸* 半胱氨酸 #丙氨酸# 0.193 1.35pSFR419 *丝氨酸* 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 0.258 1.18pSFR420 半胱氨酸 *丝氨酸* [半胱氨酸] 1.22 2.68pSFR421 半胱氨酸 半胱氨酸 *丝氨酸* 1.40 2.61pSFR422 半胱氨酸 *丝氨酸* *丝氨酸* 0.960 4.35pSFR423 半胱氨酸 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 1.47 2.08pSFR424 半胱氨酸 *丝氨酸* ＝缬氨酸＝ 0.967 2.13pSFR425 #丙氨酸# 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 1.16 2.05pSFR426 #丙氨酸# *丝氨酸* ＝缬氨酸＝ 0.716 1.66pSFR427 #丙氨酸# #丙氨酸# ＝缬氨酸＝ 0.311 1.51
ECAA-R代表来源于埃利民克鲁维氏酵母的羰基还原酶的活性；FDH代表甲酸脱氢酶的活性。
实施例20
来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶对4-氯乙酰乙酸乙酯耐受性的测定
一种溶液含有10mU实施例19中获得的每种重组细菌的甲酸脱氢酶、20μmol 4-氯乙酰乙酸乙酯、100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和牛白蛋白(Fraction V；Sigma)，这种溶液中所含的牛白蛋白可使其蛋白质总量为100μg。将这种溶液在25℃保温20分钟，然后加入2.5μmolNAD+和100μmol甲酸钠，以测定340nm吸光度的变化，通过这些步骤而测定甲酸脱氢酶对4-氯乙酰乙酸乙酯的耐受性。在不含4-氯乙酰乙酸乙酯的条件下，在25℃进行保温20分钟，然后加入20μmol 4-氯乙酰乙酸乙酯、2.5μmolNAD+和100μmol甲酸钠，以测定340nm吸光度的变化，通过这些步骤进行对照试验。
由每种重组大肠杆菌制备的酶溶液中甲酸脱氢酶的活性显示在表2中。处理20分钟后的剩余活性显示在“比率”列中。在256位用丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸取代半胱氨酸使其具有对4-氯乙酰乙酸乙酯的耐受性。表2质粒 6-半胱氨酸 146-半胱氨酸 256-半胱氨酸 比率pSFR415 半胱氨酸 半胱氨酸 [半胱氨酸] [7.43％]pSFR412 *丝氨酸* *丝氨酸* *丝氨酸* 116％pSFR416 #丙氨酸# 半胱氨酸 *丝氨酸* 97.4％pSFR417 ＝缬氨酸＝ 半胱氨酸 *丝氨酸* 92.1％pSFR418 *丝氨酸* 半胱氨酸 #丙氨酸# 120％pSFR419 *丝氨酸* 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 94.0％pSFR420 半胱氨酸 *丝氨酸* [半胱氨酸] [7.67％]pSFR421 半胱氨酸 半胱氨酸 *丝氨酸* 99.3％pSFR422 半胱氨酸 *丝氨酸 *丝氨酸* 118％pSFR423 半胱氨酸 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 100％pSFR424 半胱氨酸 *丝氨酸* ＝缬氨酸＝ 104％pSFR425 #丙氨酸# 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 94.5％pSFR426 #丙氨酸# *丝氨酸* ＝缬氨酸＝ 108％p5FR427 #丙氨酸# #丙氨酸# ＝缬氨酸＝ 106％
实施例21
测定通过乙酸乙酯来激活源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶
通过在5％乙酸乙酯存在的条件下测定实施例19中所得的甲酸脱氢酶的活性而试验乙酸乙酯对甲酸脱氢酶的激活。
在乙酸乙酯存在下，由每种重组大肠杆菌所得的酶溶液中酶活性显示在表3中。在146位用丝氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸使乙酸乙酯对其产生激活作用。表3质粒 6-半胱氨酸 146-半胱氨酸 256-半胱氨酸 比率pSFR415 半胱氨酸 半胱氨酸 [半胱氨酸] 121％pSFR412 *丝氨酸* *丝氨酸* *丝氨酸* [225％]pSFR416 #丙氨酸# 半胱氨酸 *丝氨酸* 109％pSFR417 ＝缬氨酸＝ 半胱氨酸 *丝氨酸* 105％pSFR418 *丝氨酸* 半胱氨酸 #丙氨酸# 125％pSFR419 *丝氨酸* 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 110％pSFR420 半胱氨酸 *丝氨酸* [半胱氨酸] [181％]pSFR421 半胱氨酸 半胱氨酸 *丝氨酸* 125％pSFR422 半胱氨酸 *丝氨酸* *丝氨酸* [224％]pSFR423 半胱氨酸 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 111％pSFR424 半胱氨酸 *丝氨酸* ＝缬氨酸＝ [185％]pSFR425 #丙氨酸# 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 111％pSFR426 #丙氨酸# *丝氨酸* ＝缬氨酸＝ [208％]rSFR427 #丙氨酸# #丙氨酸# ＝缬氨酸＝ [219％]
实施例22
通过重组的大肠杆菌合成(S)-4-氯-3-羟丁酸乙酯
用实施例2至18中构建的共表达来源于牝牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶和来源于埃利民克鲁维氏酵母的羰基还原酶的每一种质粒转化大肠杆菌W3110菌株。将每种重组大肠杆菌接种至液体LB培养基中，并在30℃培养过夜。然后将这种大肠杆菌接种至一种培养基中(2％bacto-triptone、1％细菌培养用酵母提取物、1.0％氯化钠，pH7.2)，并在30℃培养过夜。加入IPTG后，继续进行培养。收获所得大肠杆菌细胞。通过用它们而进行4-氯乙酰乙酸乙酯的还原。
在20℃，将含有由20mL这种培养液制备的每种大肠杆菌细胞、500mM磷酸钾缓冲液(pH6.3)、3％4-氯乙酰乙酸乙酯和365mM甲酸钠的20mL反应溶液保温过夜，同时进行搅拌。应用装有5％液体Thermon 3000、载体Chromosorb W(60-80目)AW-DMCS(Thermon 3000 5％chromosorb W60-80(AW-DMCS)，Shinwa化学工业有限公司)的一种3.2mm×2.1m玻璃柱和火焰电离检测器(FID)，在柱温度150℃下，通过气相色谱法将所产生的4-氯-3-羟丁酸乙酯进行定量。每种重组大肠杆菌所产生的(S)-4-氯-3-羟丁酸乙酯的量显示在表4中。在6位用丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸取代半胱氨酸，在146位用丝氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸和在256位用丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸取代半胱氨酸，提高了转化效率。表4质粒 6-半胱氨酸 146-半胱氨酸 256-半胱氨酸 g/LpSFR415 半胱氨酸 半胱氨酸 [半胱氨酸] 17.5pSFR412 *丝氨酸* *丝氨酸* *丝氨酸* 24.5pSFR416 #丙氨酸# 半胱氨酸 *丝氨酸* 25.8pSFR417 ＝缬氨酸＝ 半胱氨酸 *丝氨酸* 25.2pSFR418 *丝氨酸* 半胱氨酸 #丙氨酸# 22.4pSFR419 *丝氨酸* 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 25.5pSFR420 半胱氨酸 *丝氨酸* [半胱氨酸] 19.1pSFR421 半胱氨酸 半胱氨酸 *丝氨酸* 30.5p5FR422 半胱氨酸 *丝氨酸* *丝氨酸* 25.5pSFR423 半胱氨酸 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 30.6pSFR424 半胱氨酸 *丝氨酸* ＝缬氨酸＝ 31.0pSFR425 #丙氨酸# 半胱氨酸 ＝缬氨酸＝ 29.6pSFR426 #丙氨酸# *丝氨酸* ＝缬氨酸＝ 32.2pSFR427 #丙氨酸# #丙氨酸# ＝缬氨酸＝ 27.7
序列表<110>大赛璐化学工业株式会社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)<120>牝牛分枝杆菌甲酸脱氢酶突变体及其用途<130>D1-A0011Y1<140><141><150>JP 2001-254631<151>2001-8-24<150>JP 2000-363894<151>2000-11-29<160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1206<212>DNA<213>牝牛分枝杆菌<400>1atggcaaaag ttctgtgtgt tctttacgat gatccggtcg acggctaccc gaagacctat 60gcccgcgacg atcttccgaa gatcgaccac tatccgggcg gccagatctt gccgacgccg 120aaggccatcg acttcacgcc cgggcagttg ctcggctccg tctccggcga gctcggcctg 180cgaccatatc tcgagtccaa cggccacacc ctggtcgtga cctccgacaa ggacggcccc 240gactcggtgt tcgagcgcga gctggtcgat gcggatgtcg tcatctccca gcccttctgg 300ccggcctatc tgacgcccga gcgcatcgcc aaggccaaga acctgaagct cgcgctcacc 360gccggcatcg gttccgacca cgtcgatctt cagtcggcta tcgaccgcaa cgtcaccgtg 420gcggaagtca cctactgcaa ctcgatcagc gtcgccgagc atgtggtgat gatgatcctg 480tcgctggtgc gcaactatct gccctcgcac gaatgggcgc ggaagggcgg ctggaacatc 540gccgactgcg tctcccacgc ctacgacctc gaggcgatgc atgtcggcac cgtggccgcc 600ggccgcatcg gtctcgcggt gctgcgccgt ctggcgccgt tcgacgtgca cctgcactac 660accgaccgtc accgcctgcc ggaatcggtc gagaaggagc tcaacctcac ctggcacgcg 720acccgcgagg acatgtatcc ggtttgcgac gtggtgacgc tgaactgccc gctgcacccc 780gaaaccgagc acatgatcaa tgacgagacg ctgaagctgt tcaagcgtgg cgcctacatc 840gtcaacaccg cccgcggcaa gctgtgcgac cgcgatgccg tggcacgtgc gctcgaatcc 900ggccggctgg ccggctatgc cggcgacgtg tggttcccgc agccggcgcc gaaggaccac 960ccctggcgga cgatgcccta taacggcatg accccgcaca tctccggcac cacgctgacc 1020gcgcaggcgc gttatgcggc gggcacccgc gagatcctgg agtgcttctt cgagggccgt 1080ccgatccgcg acgaatacct catcgtgcag ggcggcgctc ttgccggcac cggcgcgcat 1140tcctactcga agggcaatgc caccggcggt tcggaagagg ccgccaaatt caaaaaagcg 1200gtctaa 1206<210>2<211>401<212>PRT<213>牝牛分枝杆菌<400>2Met Ala Lys Val Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr1 5 10 15Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro
20 25 30Gly Gly Gln Ile Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly
35 40 45Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Pro Tyr Leu
50 55 60Glu Ser Asn Gly His Thr Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro65 70 75 80Asp Ser Val Phe Glu Arg Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser
85 90 95Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala
100 105 110Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val
115 120 125Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Asn Val Thr Val Ala Glu Val Thr130 135 140 145Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu
150 155 160Ser Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Glu Trp Ala Arg Lys Gly
165 170 175Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser His Ala Tyr Asp Leu Glu Ala
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195 200 205Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val His Leu His Tyr Thr Asp Arg His210 215 220 225Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr Trp His Ala
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Claims (23)
1.一种有机溶剂存在下具有强的甲酸脱氢酶活性的多肽，所述的多肽含有一种突变，其中非半胱氨酸的氨基酸至少取代在SEQ ID NO：2氨基酸序列的146位和/或256位的半胱氨酸残基。
2.权利要求1所述的多肽，其中在146位的取代氨基酸是丝氨酸或缬氨酸。
3.权利要求1所述的多肽，其中在256位的取代氨基酸是丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
4.权利要求1所述的多肽，其中所述的多肽含有一个突变，其中非半胱氨酸的氨基酸至少取代在SEQ ID NO：2氨基酸序列的146位和256位的半胱氨酸残基。
5.权利要求4所述的多肽，其中在146位的取代氨基酸是丝氨酸或缬氨酸，在256位的取代氨基酸是丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
6.权利要求1所述的多肽，其中所述的多肽还含有一个突变，其中非半胱氨酸的一个氨基酸在SEQ ID NO：2氨基酸序列的6位取代半胱氨酸残基。
7.权利要求6所述的多肽，其中在6位的取代氨基酸是丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
8.一种多肽，含有包含一个或多个突变的SEQ ID NO：2氨基酸序列，所述的氨基酸序列选自下组：
(1)一种氨基酸序列，其中6、146和256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(2)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丙氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(3)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被缬氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(4)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被丙氨酸取代；
(5)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(6)一种氨基酸序列，其中146位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(7)一种氨基酸序列，其中256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(8)一种氨基酸序列，其中146和256位的半胱氨酸被丝氨酸取代；
(9)一种氨基酸序列，其中256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(10)一种氨基酸序列，其中146位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(11)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丙氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
(12)一种氨基酸序列，其中6位的半胱氨酸被丙氨酸取代，146位的半胱氨酸被丝氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；以及
(13)一种氨基酸序列，其中6位和146位的半胱氨酸被丙氨酸取代，并且256位的半胱氨酸被缬氨酸取代；
9.一种多核苷酸，其编码权利要求1或8所述的多肽。
10.一种载体，其中插入了权利要求9所述的多核苷酸。
11.权利要求10所述的载体，其中所述的载体中还插有一种编码一种还原酶的多核苷酸。
12.权利要求11所述的载体，其中所述的还原酶是一种来源于埃利氏克鲁维氏酵母的羰基还原酶。
13.一种含有权利要求10所述的载体的转化体。
14.权利要求13所述的转化体，其中的转化体是一种微生物。
15.一种生产权利要求1或8所述多肽的方法，所述的方法包括培养权利要求13所述的转化体的步骤。
16.一种生产权利要求1或8所述的多肽和一种还原酶的方法，所述的方法包括培养一种含有权利要求11所述载体的转化体的步骤。
17.权利要求16的方法，其中所述的还原酶是来源于埃利氏克鲁维氏酵母的羰基还原酶。
18.一种从氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中生产还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，所述的方法包括将下列(a)至(c)中的任何之一与氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸接触的步骤：
(a)权利要求1或8所述的多肽；
(b)权利要求10所述的转化体；以及
(c)(b)中转化体的一种加工产物。
19.一种从氧化底物中生产还原型产物的方法，所述的方法包括下列步骤：
(1)通过权利要求18的方法生产还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；以及
(2)回收一种还原产物，该产物是通过将步骤(1)的还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和一种氧化底物与一种还原酶接触所生成的，该还原酶在还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸存在下，可以从氧化底物中生产还原产物。
20.权利要求19所述的方法，其中所述的氧化底物是一种酮，并且所述底物的还原产物是一种醇。
21.权利要求20所述的方法，其中所述的酮是4-卤乙酰乙酸酯，所述的醇为(S)-4-卤-3-羟基丁酸酯。
22.权利要求19所述的方法，其中所述的还原酶是来源于埃利氏克鲁维氏酵母的羰基还原酶。
23.权利要求19所述的方法，其中所述的还原酶通过权利要求16所述的方法制备。
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