JP2002223776A - マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の変異体、およびその用途 - Google Patents
マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の変異体、およびその用途Info
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- C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、有機溶媒存在下において高いギ酸
脱水素酵素酵素活性を維持することができる蛋白質とそ
の用途の提供を課題とする。 【解決手段】 マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸
脱水素酵素のアミノ酸配列において、１４６位および／
または２５６位のシステインに部位特異的変異を導入す
ることにより、有機溶媒耐性を示すギ酸脱水素酵素の変
異体蛋白質を構築した。該蛋白質は、有機溶媒存在下で
高いギ酸脱水素酵素活性を有する。該変異体はケトンを
原料とするアルコールの製造などに有用である。
脱水素酵素酵素活性を維持することができる蛋白質とそ
の用途の提供を課題とする。 【解決手段】 マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸
脱水素酵素のアミノ酸配列において、１４６位および／
または２５６位のシステインに部位特異的変異を導入す
ることにより、有機溶媒耐性を示すギ酸脱水素酵素の変
異体蛋白質を構築した。該蛋白質は、有機溶媒存在下で
高いギ酸脱水素酵素活性を有する。該変異体はケトンを
原料とするアルコールの製造などに有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、マイコバクテリウ
ム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素
酵素の変異体、該変異体をコードするDNA、およびこれ
らを利用した酸化型β-ニコチンアミドジヌクレオチド
（NAD+）から還元型β-ニコチンアミドジヌクレオチド
（NADH）を製造する方法に関する。
ム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素
酵素の変異体、該変異体をコードするDNA、およびこれ
らを利用した酸化型β-ニコチンアミドジヌクレオチド
（NAD+）から還元型β-ニコチンアミドジヌクレオチド
（NADH）を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、光学活性（S）-4-ハロ-3-ヒドロ
キシ酪酸エステルの製造方法として、パン酵母など微生
物を用いた不斉還元法（特開昭６１−１４６１９１、特
開平６−２０９７８２等）が知られていた。しかし、菌
体内に複数の還元酵素を有するため、生成物の光学純度
が低い、収率が悪いなど工業的な利用は困難であった。
光学活性（S）-4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステルは、
医薬品などの中間体に利用される化合物で、光学的に純
粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するか
は、産業上重要な課題となっていた。
キシ酪酸エステルの製造方法として、パン酵母など微生
物を用いた不斉還元法（特開昭６１−１４６１９１、特
開平６−２０９７８２等）が知られていた。しかし、菌
体内に複数の還元酵素を有するため、生成物の光学純度
が低い、収率が悪いなど工業的な利用は困難であった。
光学活性（S）-4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステルは、
医薬品などの中間体に利用される化合物で、光学的に純
粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するか
は、産業上重要な課題となっていた。
【０００３】また、4-ハロアセト酢酸エステルから
（S）-4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵
素としてクライベロマイセス・アエスチュアリ（Kluyve
romycesaestuarii）由来のカルボニル還元酵素（特開20
00-236883）が知られており、この酵素による（S）-4-
ハロ-3-ヒドロキシヒドロキシ酪酸エステルの合成方法
が報告された。しかし、この酵素を用いて光学活性アル
コールを製造するためには、補酵素として化学量論量の
還元型β-ニコチンアミドジヌクレオチド(NADH)を必要
とする。この補酵素は極めて高価であるため、単純に補
酵素を必要量使用する方法は、工業的規模で実施する場
合に経済的に不利であり、経済的に有利なプロセスを構
築するためには、補酵素酸化型β-ニコチンアミドジヌ
クレオチド(NAD+)をNADHに還元する反応によって、補酵
素を繰り返し利用することが重要となる。
（S）-4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵
素としてクライベロマイセス・アエスチュアリ（Kluyve
romycesaestuarii）由来のカルボニル還元酵素（特開20
00-236883）が知られており、この酵素による（S）-4-
ハロ-3-ヒドロキシヒドロキシ酪酸エステルの合成方法
が報告された。しかし、この酵素を用いて光学活性アル
コールを製造するためには、補酵素として化学量論量の
還元型β-ニコチンアミドジヌクレオチド(NADH)を必要
とする。この補酵素は極めて高価であるため、単純に補
酵素を必要量使用する方法は、工業的規模で実施する場
合に経済的に不利であり、経済的に有利なプロセスを構
築するためには、補酵素酸化型β-ニコチンアミドジヌ
クレオチド(NAD+)をNADHに還元する反応によって、補酵
素を繰り返し利用することが重要となる。
【０００４】これまでのところ、補酵素NAD+をNADHに還
元するために、ギ酸脱水素酵素を使用した例（Methods
in Enzymology 136,9-21, 1987）や、グルコース脱水素
酵素（特開2000-236883）を使用した例が報告されてい
る。しかしながら、グルコース脱水素酵素はグルコース
からグルコン酸への変換を行うために、目的とする光学
活性アルコールと等量のグルコン酸が生成するという問
題があった。
元するために、ギ酸脱水素酵素を使用した例（Methods
in Enzymology 136,9-21, 1987）や、グルコース脱水素
酵素（特開2000-236883）を使用した例が報告されてい
る。しかしながら、グルコース脱水素酵素はグルコース
からグルコン酸への変換を行うために、目的とする光学
活性アルコールと等量のグルコン酸が生成するという問
題があった。
【０００５】一方、ギ酸脱水素酵素はギ酸から炭酸への
変換であり、生成した炭酸は二酸化炭素として系内から
効率的に除去されるために、経済的にも有利なプロセス
となりうる。しかし、ギ酸脱水素酵素を使用することの
欠点は、酵素自身の安定性が高くないために、失活が起
こりやすいことであった。この失活は、種々のファクタ
ー、pH値、温度、機械的負荷、基質溶液のイオン強度お
よびイオン種、重金属、酸素によるチオール基の酸化な
どによって影響を及ぼされることが知られている（特開
平 １１−２２５７８４）。このため、以下に挙げた突
然変異により安定性をあげる方法が知られている。
変換であり、生成した炭酸は二酸化炭素として系内から
効率的に除去されるために、経済的にも有利なプロセス
となりうる。しかし、ギ酸脱水素酵素を使用することの
欠点は、酵素自身の安定性が高くないために、失活が起
こりやすいことであった。この失活は、種々のファクタ
ー、pH値、温度、機械的負荷、基質溶液のイオン強度お
よびイオン種、重金属、酸素によるチオール基の酸化な
どによって影響を及ぼされることが知られている（特開
平 １１−２２５７８４）。このため、以下に挙げた突
然変異により安定性をあげる方法が知られている。
【０００６】ティシュコフ（Tishkov）らは、シュード
モナス（Pseudomonas）sp.101 からのギ酸脱水素酵素を
部位特異的変異により、２５６位のシステインをセリン
やメチオニンに置換し、水銀に対する安定性を増大させ
たが、熱安定性が減少することを示した（Biochem. Bio
phys. Res. Commun. 192, 4480−4485, 1993）。同じく
１３１位、１６０位、１６８位、１８４位、２２８位の
セリンをアラニンやバリン、ロイシンに置換し、熱安定
性を増大させた変異体に関しても報告している（FEBS L
etters 445, 183-188, 1999）。
モナス（Pseudomonas）sp.101 からのギ酸脱水素酵素を
部位特異的変異により、２５６位のシステインをセリン
やメチオニンに置換し、水銀に対する安定性を増大させ
たが、熱安定性が減少することを示した（Biochem. Bio
phys. Res. Commun. 192, 4480−4485, 1993）。同じく
１３１位、１６０位、１６８位、１８４位、２２８位の
セリンをアラニンやバリン、ロイシンに置換し、熱安定
性を増大させた変異体に関しても報告している（FEBS L
etters 445, 183-188, 1999）。
【０００７】また、スルザルクジク（Slusarczyk）ら
は、キャンディダ ボイジニイからのギ酸脱水素酵素を
部位特異的変異により、２３位のシステインをセリン
に、２６２位のシステインをバリン、アラニンに置換す
ることにより、銅に対する安定性、弱アルカリ領域での
安定性を増大させたが、熱安定性が減少することを示し
た（Eur. J. Biochem. 267, 1280-1289, 2000）。
は、キャンディダ ボイジニイからのギ酸脱水素酵素を
部位特異的変異により、２３位のシステインをセリン
に、２６２位のシステインをバリン、アラニンに置換す
ることにより、銅に対する安定性、弱アルカリ領域での
安定性を増大させたが、熱安定性が減少することを示し
た（Eur. J. Biochem. 267, 1280-1289, 2000）。
【０００８】このような研究努力にも関わらず、上記の
酵素を利用して補酵素NADHを再生しながらケトンなどの
酸化型基質からアルコールなどの還元型生成物を製造す
る過程において、ギ酸脱水素酵素の活性が低下し、収率
が低くなるという問題が存在していた。
酵素を利用して補酵素NADHを再生しながらケトンなどの
酸化型基質からアルコールなどの還元型生成物を製造す
る過程において、ギ酸脱水素酵素の活性が低下し、収率
が低くなるという問題が存在していた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、補酵素
NADHを再生しながら酸化型基質から還元型生成物を製造
する過程においても活性の低下しないギ酸脱水素酵素を
提供することにある。さらに、本発明は、このような酵
素を利用して効率的に酸化型基質から還元型生成物を製
造することをも目的とする。
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、補酵素
NADHを再生しながら酸化型基質から還元型生成物を製造
する過程においても活性の低下しないギ酸脱水素酵素を
提供することにある。さらに、本発明は、このような酵
素を利用して効率的に酸化型基質から還元型生成物を製
造することをも目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、まず、上記還元型生成物の製造過程
におけるギ酸脱水素酵素の活性の低下の原因の究明を行
った。その結果、原料であるケトンに代表される有機溶
媒の存在によってギ酸脱水素酵素の失活が速やかに起こ
るためであることを見出した。そこで本発明者らは、有
機溶媒に耐性を示す、もしくは有機溶媒によって活性が
増大するようなギ酸脱水素酵素の変異体の探索を試み
た。ギ酸脱水素酵素の変異体を種々構築し、探索した結
果、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素
（配列番号：２）の１４６位のシステイン残基を改変す
ることによって、有機溶媒非存在下と比較して有機溶媒
存在下により活性が増大する性質を示すギ酸脱水素酵素
の変異体を構築することに成功した。
を解決するために、まず、上記還元型生成物の製造過程
におけるギ酸脱水素酵素の活性の低下の原因の究明を行
った。その結果、原料であるケトンに代表される有機溶
媒の存在によってギ酸脱水素酵素の失活が速やかに起こ
るためであることを見出した。そこで本発明者らは、有
機溶媒に耐性を示す、もしくは有機溶媒によって活性が
増大するようなギ酸脱水素酵素の変異体の探索を試み
た。ギ酸脱水素酵素の変異体を種々構築し、探索した結
果、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素
（配列番号：２）の１４６位のシステイン残基を改変す
ることによって、有機溶媒非存在下と比較して有機溶媒
存在下により活性が増大する性質を示すギ酸脱水素酵素
の変異体を構築することに成功した。
【００１１】また、２５６位のシステイン残基を改変す
ることによっても、有機溶媒に対して耐性を示すギ酸脱
水素酵素の変異体を得ることができることを見出した。
ることによっても、有機溶媒に対して耐性を示すギ酸脱
水素酵素の変異体を得ることができることを見出した。
【００１２】さらに本発明者らは、これら酵素変異体を
コードするDNA、およびケトンからアルコールへの還元
反応を司るカルボニル還元酵素をコードするDNAを有す
る発現ベクターを構築し、ギ酸脱水素酵素とカルボニル
還元酵素の両方を大腸菌において同時に発現させること
に成功した。これら発現させた酵素を用いることによ
り、補酵素NADHを再生しながら酸化型基質、例えばケト
ンから該基質の還元型生成物、例えばアルコールの効率
的な製造が可能となった。
コードするDNA、およびケトンからアルコールへの還元
反応を司るカルボニル還元酵素をコードするDNAを有す
る発現ベクターを構築し、ギ酸脱水素酵素とカルボニル
還元酵素の両方を大腸菌において同時に発現させること
に成功した。これら発現させた酵素を用いることによ
り、補酵素NADHを再生しながら酸化型基質、例えばケト
ンから該基質の還元型生成物、例えばアルコールの効率
的な製造が可能となった。
【００１３】本発明者らは上記の如く、有機溶媒存在下
により活性が増大し、有機溶媒に耐性を示すギ酸脱水酵
素変異体を構築し、さらに該酵素およびカルボニル還元
酵素を同時に発現させることにより、効率的に酸化型基
質から該基質の還元型生成物を製造する方法を見出し、
本発明を完成させた。
により活性が増大し、有機溶媒に耐性を示すギ酸脱水酵
素変異体を構築し、さらに該酵素およびカルボニル還元
酵素を同時に発現させることにより、効率的に酸化型基
質から該基質の還元型生成物を製造する方法を見出し、
本発明を完成させた。
【００１４】即ち本発明は、以下の蛋白質、並びに該蛋
白質を利用して効率的に酸化型基質から還元型生成物を
製造する方法に関する。 〔１〕 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、
少なくとも１４６位および／または２５６位のシステイ
ン残基が、システイン以外のアミノ酸へ置換された変異
を含む蛋白質であって、有機溶媒存在下で高いギ酸脱水
素酵素活性を有する蛋白質。 〔２〕 １４６位の置換アミノ酸がセリンまたはバリン
である〔１〕に記載の蛋白質。 〔３〕 ２５６位の置換アミノ酸が、セリン、アラニ
ン、またはバリンのいずれかのアミノ酸である〔１〕に
記載の蛋白質。 〔４〕 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、
少なくとも１４６位および２５６位のシステイン残基
が、システイン以外のアミノ酸へ置換された変異を含む
〔１〕に記載の蛋白質。 〔５〕 １４６位の置換アミノ酸がセリンまたはバリン
であり、２５６位の置換アミノ酸がセリン、アラニン、
またはバリンのいずれかのアミノ酸である〔４〕に記載
の蛋白質。 〔６〕 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、
更に６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸
へ置換された変異を含む、〔１〕に記載の蛋白質。 〔７〕 ６位の置換アミノ酸が、セリン、アラニン、ま
たはバリンのいずれかのアミノ酸である、〔６〕に記載
の蛋白質。 〔８〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、下
記（１）〜（１３）からなる群から選択されたいずれか
の変異を有するアミノ酸配列からなる蛋白質。 （１）６位、１４６位、および２５６位のシステイン残
基が共にセリンに置換されたアミノ酸配列、（２）６位
のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン
残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
（３）６位のシステイン残基がバリンに、２５６位のシ
ステイン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配
列、（４）６位のシステイン残基がセリンに、２５６位
のシステイン残基がアラニンにそれぞれ置換されたアミ
ノ酸配列、（５）６位のシステイン残基がセリンに、２
５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換された
アミノ酸配列、（６）１４６位のシステイン残基がセリ
ンに置換されたアミノ酸配列、（７）２５６位のシステ
イン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列、（８）１
４６位および２５６位のシステイン残基が共にセリンに
置換されたアミノ酸配列、（９）２５６位のシステイン
残基がバリンに置換されたアミノ酸配列、（１０）１４
６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイ
ン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
（１１）６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位
のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ
酸配列、（１２）６位のシステイン残基がアラニンに、
１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシス
テイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配
列、（１３）６位および１４６位のシステイン残基がア
ラニンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞ
れ置換されたアミノ酸配列、
白質を利用して効率的に酸化型基質から還元型生成物を
製造する方法に関する。 〔１〕 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、
少なくとも１４６位および／または２５６位のシステイ
ン残基が、システイン以外のアミノ酸へ置換された変異
を含む蛋白質であって、有機溶媒存在下で高いギ酸脱水
素酵素活性を有する蛋白質。 〔２〕 １４６位の置換アミノ酸がセリンまたはバリン
である〔１〕に記載の蛋白質。 〔３〕 ２５６位の置換アミノ酸が、セリン、アラニ
ン、またはバリンのいずれかのアミノ酸である〔１〕に
記載の蛋白質。 〔４〕 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、
少なくとも１４６位および２５６位のシステイン残基
が、システイン以外のアミノ酸へ置換された変異を含む
〔１〕に記載の蛋白質。 〔５〕 １４６位の置換アミノ酸がセリンまたはバリン
であり、２５６位の置換アミノ酸がセリン、アラニン、
またはバリンのいずれかのアミノ酸である〔４〕に記載
の蛋白質。 〔６〕 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、
更に６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸
へ置換された変異を含む、〔１〕に記載の蛋白質。 〔７〕 ６位の置換アミノ酸が、セリン、アラニン、ま
たはバリンのいずれかのアミノ酸である、〔６〕に記載
の蛋白質。 〔８〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、下
記（１）〜（１３）からなる群から選択されたいずれか
の変異を有するアミノ酸配列からなる蛋白質。 （１）６位、１４６位、および２５６位のシステイン残
基が共にセリンに置換されたアミノ酸配列、（２）６位
のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン
残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
（３）６位のシステイン残基がバリンに、２５６位のシ
ステイン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配
列、（４）６位のシステイン残基がセリンに、２５６位
のシステイン残基がアラニンにそれぞれ置換されたアミ
ノ酸配列、（５）６位のシステイン残基がセリンに、２
５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換された
アミノ酸配列、（６）１４６位のシステイン残基がセリ
ンに置換されたアミノ酸配列、（７）２５６位のシステ
イン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列、（８）１
４６位および２５６位のシステイン残基が共にセリンに
置換されたアミノ酸配列、（９）２５６位のシステイン
残基がバリンに置換されたアミノ酸配列、（１０）１４
６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイ
ン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
（１１）６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位
のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ
酸配列、（１２）６位のシステイン残基がアラニンに、
１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシス
テイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配
列、（１３）６位および１４６位のシステイン残基がア
ラニンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞ
れ置換されたアミノ酸配列、
〔９〕 〔１〕または〔８〕に記載の蛋白質をコードす
るDNA。 〔１０〕
るDNA。 〔１０〕
〔９〕に記載のDNAが挿入されたベクター。 〔１１〕 更に還元酵素をコードするDNAが挿入された
〔１０〕に記載のベクター。 〔１２〕 還元酵素がクライベロマイセス アエスチュ
アリ（Kluyberomyces aestuarii）に由来するカルボニ
ル還元酵素である〔１１〕に記載のベクター。 〔１３〕 〔１０〕に記載のベクターを保持する形質転
換体。 〔１４〕 宿主細胞が微生物である〔１３〕に記載の形
質転換体。 〔１５〕 〔１３〕に記載の形質転換体を培養する工程
を含む、〔１〕または〔８〕に記載の蛋白質を製造する
方法。 〔１６〕 〔１１〕に記載のベクターを保持する形質転
換体を培養する工程を含む、〔１〕または〔８〕に記載
の蛋白質、および還元酵素を製造する方法。 〔１７〕 還元酵素が、クライベロマイセス アエスチ
ュアリ由来カルボニル還元酵素である〔１６〕に記載の
方法。 〔１８〕 下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかを酸化型
β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに接触させ
る工程を含む、酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドから還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドを製造する方法。 （ａ）〔１〕または〔８〕に記載の蛋白質、（ｂ）〔１
０〕に記載の形質転換体、および（ｃ）（ｂ）に記載の
形質転換体の処理物 〔１９〕 次の工程を含む酸化型基質から該基質の還元
型生成物を製造する方法。 （１）〔１８〕に記載の方法によって還元型β-ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドを製造する工程、およ
び（２）工程（１）の還元型β-ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、酸化型基質、および還元型β-ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で前記酸化
型基質から還元型生成物を生成し得る還元酵素とを接触
させ、生成する還元型生成物を回収する工程 〔２０〕 酸化型基質がケトンであり、該基質の還元型
生成物がアルコールである〔１９〕に記載の方法。 〔２１〕 ケトンが４−ハロアセト酢酸エステルであ
り、アルコールが（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪
酸エステルである〔２０〕に記載の方法。 〔２２〕 還元酵素がクライベロマイセス アエスチュ
アリ由来カルボニル還元酵素である〔１９〕に記載の方
法。 〔２３〕 還元酵素が、〔１６〕に記載の方法によって
製造されたものである〔１９〕に記載の方法。
〔１０〕に記載のベクター。 〔１２〕 還元酵素がクライベロマイセス アエスチュ
アリ（Kluyberomyces aestuarii）に由来するカルボニ
ル還元酵素である〔１１〕に記載のベクター。 〔１３〕 〔１０〕に記載のベクターを保持する形質転
換体。 〔１４〕 宿主細胞が微生物である〔１３〕に記載の形
質転換体。 〔１５〕 〔１３〕に記載の形質転換体を培養する工程
を含む、〔１〕または〔８〕に記載の蛋白質を製造する
方法。 〔１６〕 〔１１〕に記載のベクターを保持する形質転
換体を培養する工程を含む、〔１〕または〔８〕に記載
の蛋白質、および還元酵素を製造する方法。 〔１７〕 還元酵素が、クライベロマイセス アエスチ
ュアリ由来カルボニル還元酵素である〔１６〕に記載の
方法。 〔１８〕 下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかを酸化型
β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに接触させ
る工程を含む、酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドから還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドを製造する方法。 （ａ）〔１〕または〔８〕に記載の蛋白質、（ｂ）〔１
０〕に記載の形質転換体、および（ｃ）（ｂ）に記載の
形質転換体の処理物 〔１９〕 次の工程を含む酸化型基質から該基質の還元
型生成物を製造する方法。 （１）〔１８〕に記載の方法によって還元型β-ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドを製造する工程、およ
び（２）工程（１）の還元型β-ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、酸化型基質、および還元型β-ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で前記酸化
型基質から還元型生成物を生成し得る還元酵素とを接触
させ、生成する還元型生成物を回収する工程 〔２０〕 酸化型基質がケトンであり、該基質の還元型
生成物がアルコールである〔１９〕に記載の方法。 〔２１〕 ケトンが４−ハロアセト酢酸エステルであ
り、アルコールが（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪
酸エステルである〔２０〕に記載の方法。 〔２２〕 還元酵素がクライベロマイセス アエスチュ
アリ由来カルボニル還元酵素である〔１９〕に記載の方
法。 〔２３〕 還元酵素が、〔１６〕に記載の方法によって
製造されたものである〔１９〕に記載の方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明は、マイコバクテリウム
バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵
素の変異体を提供する。
バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵
素の変異体を提供する。
【００１６】本発明の該変異体の一つの好ましい態様
は、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vac
cae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）におい
て、少なくとも１４６位のシステイン残基がシステイン
以外のアミノ酸へ置換された変異を含む変異体（以下、
「１４６変異体」と称する）である。１４６位の置換ア
ミノ酸は、好ましくはセリンまたはバリンである。１４
６変異体は、１４６位のシステイン残基がシステイン以
外のアミノ酸へ置換されたものであれば、１４６位以外
のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置
換、欠失、付加および／または挿入などの変異を有して
いてもよい。このような変異は、人為的に導入すること
もできるし、自然界において生じることもある。本発明
の変異体には、これら双方の変異体が含まれる。１４６
変異体における変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ
酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さら
に好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以
内、3アミノ酸以内）である。
は、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vac
cae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）におい
て、少なくとも１４６位のシステイン残基がシステイン
以外のアミノ酸へ置換された変異を含む変異体（以下、
「１４６変異体」と称する）である。１４６位の置換ア
ミノ酸は、好ましくはセリンまたはバリンである。１４
６変異体は、１４６位のシステイン残基がシステイン以
外のアミノ酸へ置換されたものであれば、１４６位以外
のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置
換、欠失、付加および／または挿入などの変異を有して
いてもよい。このような変異は、人為的に導入すること
もできるし、自然界において生じることもある。本発明
の変異体には、これら双方の変異体が含まれる。１４６
変異体における変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ
酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さら
に好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以
内、3アミノ酸以内）である。
【００１７】本発明の蛋白質において、１４６位、ある
いは２５６以外の位置にアミノ酸の欠失、付加、あるい
は挿入などの変異を伴うときには、N末端からカウント
したシステイン残基の位置が変動する場合がある。この
ような場合には、変動後のアミノ酸配列における、配列
番号：２において、少なくとも１４６位および／または
２５６位に相同な位置にあるシステインを他のアミノ酸
配列に置換して、本発明による蛋白質とする。すなわち
本発明の蛋白質には、配列番号：２に記載のアミノ酸配
列において、１４６位および／または２５６位に相同な
位置のアミノ酸を、システイン以外のアミノ酸に置換し
た蛋白質であって、有機溶媒存在下で高いギ酸脱水素酵
素活性を有する蛋白質が含まれる。相同な位置は、シス
テインの周辺のアミノ酸配列を配列番号：２におけるシ
ステイン周辺のアミノ酸配列と整列させることによって
明らかにすることができる。このような操作は、アミノ
酸配列のアライメントと呼ばれる。アライメントのため
のアルゴリズムとして、たとえばBLASTを示すことがで
きる。当業者は、異なる長さのアミノ酸配列の間で、ア
ライメントにより相同なアミノ酸の位置を明らかにする
ことができる。
いは２５６以外の位置にアミノ酸の欠失、付加、あるい
は挿入などの変異を伴うときには、N末端からカウント
したシステイン残基の位置が変動する場合がある。この
ような場合には、変動後のアミノ酸配列における、配列
番号：２において、少なくとも１４６位および／または
２５６位に相同な位置にあるシステインを他のアミノ酸
配列に置換して、本発明による蛋白質とする。すなわち
本発明の蛋白質には、配列番号：２に記載のアミノ酸配
列において、１４６位および／または２５６位に相同な
位置のアミノ酸を、システイン以外のアミノ酸に置換し
た蛋白質であって、有機溶媒存在下で高いギ酸脱水素酵
素活性を有する蛋白質が含まれる。相同な位置は、シス
テインの周辺のアミノ酸配列を配列番号：２におけるシ
ステイン周辺のアミノ酸配列と整列させることによって
明らかにすることができる。このような操作は、アミノ
酸配列のアライメントと呼ばれる。アライメントのため
のアルゴリズムとして、たとえばBLASTを示すことがで
きる。当業者は、異なる長さのアミノ酸配列の間で、ア
ライメントにより相同なアミノ酸の位置を明らかにする
ことができる。
【００１８】１４６変異体は、好ましくは、マイコバク
テリウム バッカエ（Mycobacteriumvaccae）由来のギ酸
脱水素酵素（配列番号：２）と比較して、有機溶媒存在
下において高いギ酸脱水素酵素活性を示す変異体であ
る。本発明において、「ギ酸脱水素酵素活性が高い」と
は、有機溶媒存在下において、有機溶媒が存在しない場
合の酵素活性に比較して、少なくとも７０％以上、たと
えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましく
は９５％以上の酵素活性を有することを言う。天然のギ
酸脱水素酵素は、有機溶媒の存在下ではわずかな酵素活
性しか認めることができない。また本発明において有機
溶媒に対して耐性を有するとは、一定の期間にわたって
当該酵素が有機溶媒の存在下に置かれた後に、なお高い
酵素活性を維持していることを言う。たとえば本発明の
蛋白質は、２０μMの4-クロロアセト酢酸エチルの存在
下で２５℃２０分間保存後に、なお９０％以上の酵素活
性を維持している。天然のギ酸脱水素酵素は、このよう
な条件下では大部分の酵素活性を失ってしまう（８％以
下）。更に本発明に基づく好ましい変異体は、有機溶媒
の存在下で酵素活性が活性化される。本発明において酵
素の活性化とは、有機溶媒存在下における酵素活性が、
不存在下における活性の１００％以上、好ましくは１０
５％以上、例えば１００〜２５０％の活性を示すことを
言う。また有機溶媒の存在下とは、水性溶媒に対して有
機溶媒が１μM以上、たとえば５〜５００μM、具体的に
は５〜５０μM、より具体的には１０〜３０μMの有機溶
媒が存在することを言う。
テリウム バッカエ（Mycobacteriumvaccae）由来のギ酸
脱水素酵素（配列番号：２）と比較して、有機溶媒存在
下において高いギ酸脱水素酵素活性を示す変異体であ
る。本発明において、「ギ酸脱水素酵素活性が高い」と
は、有機溶媒存在下において、有機溶媒が存在しない場
合の酵素活性に比較して、少なくとも７０％以上、たと
えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましく
は９５％以上の酵素活性を有することを言う。天然のギ
酸脱水素酵素は、有機溶媒の存在下ではわずかな酵素活
性しか認めることができない。また本発明において有機
溶媒に対して耐性を有するとは、一定の期間にわたって
当該酵素が有機溶媒の存在下に置かれた後に、なお高い
酵素活性を維持していることを言う。たとえば本発明の
蛋白質は、２０μMの4-クロロアセト酢酸エチルの存在
下で２５℃２０分間保存後に、なお９０％以上の酵素活
性を維持している。天然のギ酸脱水素酵素は、このよう
な条件下では大部分の酵素活性を失ってしまう（８％以
下）。更に本発明に基づく好ましい変異体は、有機溶媒
の存在下で酵素活性が活性化される。本発明において酵
素の活性化とは、有機溶媒存在下における酵素活性が、
不存在下における活性の１００％以上、好ましくは１０
５％以上、例えば１００〜２５０％の活性を示すことを
言う。また有機溶媒の存在下とは、水性溶媒に対して有
機溶媒が１μM以上、たとえば５〜５００μM、具体的に
は５〜５０μM、より具体的には１０〜３０μMの有機溶
媒が存在することを言う。
【００１９】有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、
酢酸メチル、酢酸プロピル等の酢酸エステル類、アセト
酢酸エチル、アセト酢酸メチル等のアセト酢酸エステル
類、４−クロロアセト酢酸エチル、４−クロロアセト酢
酸メチル等の４−ハロ−３−オキソ酪酸エステル類等を
挙げることができるが、これらの有機溶媒に限定されな
い。
酢酸メチル、酢酸プロピル等の酢酸エステル類、アセト
酢酸エチル、アセト酢酸メチル等のアセト酢酸エステル
類、４−クロロアセト酢酸エチル、４−クロロアセト酢
酸メチル等の４−ハロ−３−オキソ酪酸エステル類等を
挙げることができるが、これらの有機溶媒に限定されな
い。
【００２０】１４６変異体は、少なくとも一つの有機溶
媒において高いギ酸脱水素酵素活性を示すものである。
ギ酸脱水素酵素活性は、当業者によって一般的に行われ
る方法によって測定することができる。例えば、以下の
方法を例示することができる。リン酸カリウム緩衝液
（pH 7.0、100mM）、NAD+ 2.5mM、ギ酸ナトリウム 100m
M および酵素を含む反応液中 25℃で反応させ、NADHの
増加にともなう 340nmの吸光度の増加を測定する。1U
は、1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量とす
る。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパ
ク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。基
質としてギ酸ナトリウムの代わりに、有機溶媒、特に４
−クロロアセト酢酸エチルを用いた場合には、この条件
では340nmにおける吸光度の変化は観察されない。
媒において高いギ酸脱水素酵素活性を示すものである。
ギ酸脱水素酵素活性は、当業者によって一般的に行われ
る方法によって測定することができる。例えば、以下の
方法を例示することができる。リン酸カリウム緩衝液
（pH 7.0、100mM）、NAD+ 2.5mM、ギ酸ナトリウム 100m
M および酵素を含む反応液中 25℃で反応させ、NADHの
増加にともなう 340nmの吸光度の増加を測定する。1U
は、1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量とす
る。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパ
ク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。基
質としてギ酸ナトリウムの代わりに、有機溶媒、特に４
−クロロアセト酢酸エチルを用いた場合には、この条件
では340nmにおける吸光度の変化は観察されない。
【００２１】本発明の変異体の他の好ましい態様は、マ
イコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）
由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）において、２５
６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸へ置
換された変異を少なくとも含む変異体（以下、「２５６
変異体」と称する）である。２５６位の置換アミノ酸
は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバリンであ
る。２５６変異体は、２５６位のシステイン残基がシス
テイン以外のアミノ酸へ置換されたものであれば、２５
６位以外のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミ
ノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などの変異
を有していてもよい。このような変異は、人為的に導入
することもできるが、自然界において生じることもあ
る。本発明の変異体には、これら双方の変異体が含まれ
る。２５６変異体における変異するアミノ酸数は、通
常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内
であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5
アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。２５６変異体
は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycob
acteriumvaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：
２）と比較して、有機溶媒に対し高い耐性を示す。有機
溶媒としては、例えば、４−クロロアセト酢酸エチルエ
ステル、４−ブロモアセト酢酸エチルエステル、４−ヨ
ード酢酸エチルエステル、４−クロロアセト酢酸メチ
ル、４−クロロアセト酢酸プロピル等の４−ハロ−３−
オキソ酪酸エステル類、クロロアセトフェノン、ブロモ
アセトフェノン等のハロアセトフェノン、また３−クロ
ロ−１−フェニル−２−プロパノン、３−ブロモ−１−
フェニル−２−プロパノン等の、３−ハロ−１−フェニ
ル−２−プロパノン誘導体等を挙げることができるが、
これらの有機溶媒に限定されない。２５６変異体は、少
なくとも一つの有機溶媒において高い耐性を示すもので
ある。ギ酸脱水素酵素の有機溶媒耐性、例えば４−クロ
ロアセト酢酸エチル耐性は、次のようにして測定するこ
とができる。
イコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）
由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）において、２５
６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸へ置
換された変異を少なくとも含む変異体（以下、「２５６
変異体」と称する）である。２５６位の置換アミノ酸
は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバリンであ
る。２５６変異体は、２５６位のシステイン残基がシス
テイン以外のアミノ酸へ置換されたものであれば、２５
６位以外のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミ
ノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などの変異
を有していてもよい。このような変異は、人為的に導入
することもできるが、自然界において生じることもあ
る。本発明の変異体には、これら双方の変異体が含まれ
る。２５６変異体における変異するアミノ酸数は、通
常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内
であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5
アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。２５６変異体
は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycob
acteriumvaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：
２）と比較して、有機溶媒に対し高い耐性を示す。有機
溶媒としては、例えば、４−クロロアセト酢酸エチルエ
ステル、４−ブロモアセト酢酸エチルエステル、４−ヨ
ード酢酸エチルエステル、４−クロロアセト酢酸メチ
ル、４−クロロアセト酢酸プロピル等の４−ハロ−３−
オキソ酪酸エステル類、クロロアセトフェノン、ブロモ
アセトフェノン等のハロアセトフェノン、また３−クロ
ロ−１−フェニル−２−プロパノン、３−ブロモ−１−
フェニル−２−プロパノン等の、３−ハロ−１−フェニ
ル−２−プロパノン誘導体等を挙げることができるが、
これらの有機溶媒に限定されない。２５６変異体は、少
なくとも一つの有機溶媒において高い耐性を示すもので
ある。ギ酸脱水素酵素の有機溶媒耐性、例えば４−クロ
ロアセト酢酸エチル耐性は、次のようにして測定するこ
とができる。
【００２２】リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0、100m
M）、４−クロロアセト酢酸エチル 20mM、ギ酸脱水素酵
素を含む反応液中 25℃、20分保持後、NAD+ を 2.5mM、
ギ酸ナトリウムを 100mMになるように加え、反応液中 2
5℃で反応させ、NADHの増加にともなう 340nmの吸光度
の増加を測定する。対照実験としては、リン酸カリウム
緩衝液（pH 7.0、100mM）、ギ酸脱水素酵素を含む反応
液中 25℃、20分保持後、NAD+を 2.5mM、ギ酸ナトリウ
ムを100mM、４−クロロアセト酢酸エチルを20mMになる
ように加え、反応液中 25℃で反応させ、NADHの増加に
ともなう340nmの吸光度の増加を測定する。
M）、４−クロロアセト酢酸エチル 20mM、ギ酸脱水素酵
素を含む反応液中 25℃、20分保持後、NAD+ を 2.5mM、
ギ酸ナトリウムを 100mMになるように加え、反応液中 2
5℃で反応させ、NADHの増加にともなう 340nmの吸光度
の増加を測定する。対照実験としては、リン酸カリウム
緩衝液（pH 7.0、100mM）、ギ酸脱水素酵素を含む反応
液中 25℃、20分保持後、NAD+を 2.5mM、ギ酸ナトリウ
ムを100mM、４−クロロアセト酢酸エチルを20mMになる
ように加え、反応液中 25℃で反応させ、NADHの増加に
ともなう340nmの吸光度の増加を測定する。
【００２３】本発明の変異体のさらなる好ましい態様
は、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vac
cae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）におい
て、上記１４６位および２５６位の両システイン残基が
共にシステイン以外のアミノ酸へ置換された変異を少な
くとも含むような変異体（以下、「１４６−２５６変異
体」と称する）である。１４６位の置換アミノ酸は、好
ましくは、セリンまたはバリンであり、２５６位の置換
アミノ酸は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバ
リンである。１４６位および２５６位の両システイン残
基が共にシステイン以外のアミノ酸へ置換されたもので
あれば、１４６位および２５６位以外のアミノ酸の変異
については特に制限されない。１４６−２５６変異体
は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycob
acterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：
２）と比較して、有機溶媒存在下において高いギ酸脱水
酵素活性を示し、かつ、有機溶媒に対して高い耐性を示
す。
は、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vac
cae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）におい
て、上記１４６位および２５６位の両システイン残基が
共にシステイン以外のアミノ酸へ置換された変異を少な
くとも含むような変異体（以下、「１４６−２５６変異
体」と称する）である。１４６位の置換アミノ酸は、好
ましくは、セリンまたはバリンであり、２５６位の置換
アミノ酸は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバ
リンである。１４６位および２５６位の両システイン残
基が共にシステイン以外のアミノ酸へ置換されたもので
あれば、１４６位および２５６位以外のアミノ酸の変異
については特に制限されない。１４６−２５６変異体
は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycob
acterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：
２）と比較して、有機溶媒存在下において高いギ酸脱水
酵素活性を示し、かつ、有機溶媒に対して高い耐性を示
す。
【００２４】本発明の変異体の他の態様は、上述のマイ
コバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の１４
６位および／または２５６位の変異に加えて、６位のシ
ステイン残基がシステイン以外のアミノ酸に置換した変
異を含むギ酸脱水酵素の変異体である。６位の置換アミ
ノ酸は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバリン
である。該変異体は、好ましくは、マイコバクテリウム
バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素
酵素（配列番号：２）と比較して、有機溶媒存在下にお
ける高いギ酸脱水酵素活性および／または有機溶媒に対
する高い耐性を示す。
コバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の１４
６位および／または２５６位の変異に加えて、６位のシ
ステイン残基がシステイン以外のアミノ酸に置換した変
異を含むギ酸脱水酵素の変異体である。６位の置換アミ
ノ酸は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバリン
である。該変異体は、好ましくは、マイコバクテリウム
バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素
酵素（配列番号：２）と比較して、有機溶媒存在下にお
ける高いギ酸脱水酵素活性および／または有機溶媒に対
する高い耐性を示す。
【００２５】本発明の好ましい変異体の具体例を以下に
示す。 （ａ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、
１４６位のシステイン残基がセリンに置換されているマ
イコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変
異体 （ｂ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、
２５６位のシステイン残基がセリンに置換されているマ
イコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変
異体 （ｃ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、
２５６位のシステイン残基がバリンに置換されているマ
イコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変
異体 （ｄ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１
４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステ
イン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｅ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１
４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステ
イン残基がアラニンに置換されているマイコバクテリウ
ム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｆ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１
４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステ
イン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｇ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がセリンに、１４６位のシステイン
残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がセリンに
置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ
酸脱水素酵素の変異体 （ｈ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイ
ン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｉ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がバリンに、２５６位のシステイン
残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム バ
ッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｊ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン
残基がアラニンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｋ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン
残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム バ
ッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｌ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイ
ン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリン
に置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来の
ギ酸脱水素酵素の変異体 （ｍ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイ
ン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｎ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイ
ン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がバリ
ンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来
のギ酸脱水素酵素の変異体
示す。 （ａ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、
１４６位のシステイン残基がセリンに置換されているマ
イコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変
異体 （ｂ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、
２５６位のシステイン残基がセリンに置換されているマ
イコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変
異体 （ｃ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、
２５６位のシステイン残基がバリンに置換されているマ
イコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変
異体 （ｄ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１
４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステ
イン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｅ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１
４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステ
イン残基がアラニンに置換されているマイコバクテリウ
ム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｆ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１
４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステ
イン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｇ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がセリンに、１４６位のシステイン
残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がセリンに
置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ
酸脱水素酵素の変異体 （ｈ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイ
ン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｉ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がバリンに、２５６位のシステイン
残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム バ
ッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｊ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン
残基がアラニンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｋ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン
残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム バ
ッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｌ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイ
ン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリン
に置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来の
ギ酸脱水素酵素の変異体 （ｍ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイ
ン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム
バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体 （ｎ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６
位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイ
ン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がバリ
ンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来
のギ酸脱水素酵素の変異体
【００２６】上記（ａ）から（ｎ）の変異体のうち、
（ａ）で示した変異体は、有機溶媒存在下において高い
ギ酸脱水酵素活性を示す。（ｂ）、（ｃ）、（ｈ）、
（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｍ）で示した変異体
は、有機溶媒に対して高い耐性を示す。（ｄ）、
（ｆ）、（ｇ）、（ｌ）および（ｎ）で示した変異体
は、有機溶媒存在下において高いギ酸脱水素酵素活性を
示し、かつ有機溶媒に対して高い耐性を示す。
（ａ）で示した変異体は、有機溶媒存在下において高い
ギ酸脱水酵素活性を示す。（ｂ）、（ｃ）、（ｈ）、
（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｍ）で示した変異体
は、有機溶媒に対して高い耐性を示す。（ｄ）、
（ｆ）、（ｇ）、（ｌ）および（ｎ）で示した変異体
は、有機溶媒存在下において高いギ酸脱水素酵素活性を
示し、かつ有機溶媒に対して高い耐性を示す。
【００２７】本発明の上記変異体は、例えば、マイコバ
クテリウム バッカエ由来のギ酸脱水酵素のアミノ酸配
列を改変することにより得ることができる。これらのタ
ンパク質は、当業者によって一般的に行われる方法、例
えば部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et a
l. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smit
h, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500）等を用
いて作製することができる。具体的には後述の実施例で
示される方法によって取得することができる。本願出願
人は図２に示すpSFR415を有する大腸菌(JM109(pSFR41
5))、およびpSFR426を有する大腸菌(JM109(pSFR426))を
寄託している。該プラスミドに挿入されたDNAは、本発
明の変異体の作製において好適に利用することができ
る。
クテリウム バッカエ由来のギ酸脱水酵素のアミノ酸配
列を改変することにより得ることができる。これらのタ
ンパク質は、当業者によって一般的に行われる方法、例
えば部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et a
l. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smit
h, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500）等を用
いて作製することができる。具体的には後述の実施例で
示される方法によって取得することができる。本願出願
人は図２に示すpSFR415を有する大腸菌(JM109(pSFR41
5))、およびpSFR426を有する大腸菌(JM109(pSFR426))を
寄託している。該プラスミドに挿入されたDNAは、本発
明の変異体の作製において好適に利用することができ
る。
【００２８】なお、マイコバクテリウム バッカエ由来
ギ酸脱水素酵素における２５６位システイン残基周辺
は、他のギ酸脱水素酵素においても保存された領域であ
り、２５６位システインは、例えばアスペルギルス ニ
デュランス（現エメリセラ ニデュランス）由来では２
２４位システインに、ハンセヌラ ポリモルファ（現ピ
キア アングスタ）由来（SWISS：P33677）では２２８位
システインに、ニューロスポラ クラッサ由来（SWISS：
NEUFDHA）では２２８位システインに、シュードモナスs
p. 101由来（SWISS：P33160）では２５５位システイン
に相当する。また、同じくマイコバクテリウム バッカ
エ由来ギ酸脱水素酵素における１４６位システイン残基
周辺は、他のギ酸脱水素酵素においても保存された領域
であり、例えばシュードモナス（Pseudomonas）sp. 101
由来（SWISS：P33160）では１４５位システインに相当
する。（Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483,
1995）。これら既知酵素においても部位特異的変異によ
る改変によって、有機溶媒耐性を向上させる、および／
または有機溶媒による活性化効果が期待できる。
ギ酸脱水素酵素における２５６位システイン残基周辺
は、他のギ酸脱水素酵素においても保存された領域であ
り、２５６位システインは、例えばアスペルギルス ニ
デュランス（現エメリセラ ニデュランス）由来では２
２４位システインに、ハンセヌラ ポリモルファ（現ピ
キア アングスタ）由来（SWISS：P33677）では２２８位
システインに、ニューロスポラ クラッサ由来（SWISS：
NEUFDHA）では２２８位システインに、シュードモナスs
p. 101由来（SWISS：P33160）では２５５位システイン
に相当する。また、同じくマイコバクテリウム バッカ
エ由来ギ酸脱水素酵素における１４６位システイン残基
周辺は、他のギ酸脱水素酵素においても保存された領域
であり、例えばシュードモナス（Pseudomonas）sp. 101
由来（SWISS：P33160）では１４５位システインに相当
する。（Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483,
1995）。これら既知酵素においても部位特異的変異によ
る改変によって、有機溶媒耐性を向上させる、および／
または有機溶媒による活性化効果が期待できる。
【００２９】また本発明は、ギ酸脱水素酵素の変異体を
コードするDNAに関する。本発明のギ酸脱水素酵素の変
異体をコードするDNAは、例えば配列番号：１に記載さ
れたマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素
をコードするDNAに、当業者によって一般的に行われる
部位特異的変異導入法を用いて塩基置換を導入すること
によって得ることができる。
コードするDNAに関する。本発明のギ酸脱水素酵素の変
異体をコードするDNAは、例えば配列番号：１に記載さ
れたマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素
をコードするDNAに、当業者によって一般的に行われる
部位特異的変異導入法を用いて塩基置換を導入すること
によって得ることができる。
【００３０】本発明は、このようにして得られた本発明
のギ酸脱水素酵素の変異体をコードするDNAを、公知の
発現ベクターに挿入することによって作製されるギ酸脱
水素酵素変異体発現ベクターを提供する。該発現ベクタ
ーで形質転換した形質転換体を培養することにより、本
発明のギ酸脱水素酵素の変異体を、組換え体タンパク質
として得ることができる。
のギ酸脱水素酵素の変異体をコードするDNAを、公知の
発現ベクターに挿入することによって作製されるギ酸脱
水素酵素変異体発現ベクターを提供する。該発現ベクタ
ーで形質転換した形質転換体を培養することにより、本
発明のギ酸脱水素酵素の変異体を、組換え体タンパク質
として得ることができる。
【００３１】さらに本発明は、本発明のギ酸脱水酵素の
変異体をコードするDNA、および還元酵素をコードするD
NAを、公知の発現ベクターに挿入することによって作製
されるギ酸脱水酵素変異体および還元酵素の発現ベクタ
ーを提供する。該発現ベクターで形質転換した形質転換
体を培養することにより、本発明のギ酸脱水酵素変異体
および還元酵素を、組換えタンパク質として得ることが
できる。該還元酵素としては、好ましくはカルボニル還
元酵素である。具体的には、例えば下記の微生物由来の
カルボニル還元酵素を挙げることができる。 ・コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp. ST-10
（Appl. Environ. Microbiol. 63, 3783-3788, 1997） ・キャンディダ パラプシロシス（Candida parapsilosi
s）IFO 1396（特開平 07-231785） ・アルカリゲネス ユートロファス（Alcaligenes eutro
phus）N9A（J. Bacteriol. 170, 5248-5256, 1988） ・コマモナス テリゲナ（Comamonas terrigena）（Bioc
him. Biophys. Acta 661, 74-86, 1981） ・ゲオトリカム キャンディダム（Geotrichum candidu
m）IFO 4597（特公平 01-27715） ・ハンセヌラ オフナエンシス（Hansenula ofunaensi
s）AKU 4328（J. Biosci.Bioeng. 88, 148-152 ,1999） ・ノカルディア エリスロポリス（Nocardia erythropol
is）ATCC 4277（Appl. Environ. Microbiol. 61, 3729-
3722, 1995） ・ノカルディア ファスカ（Nocardia fusca） ・ピキア（Pichia）sp. NRRL-Y-11328（J. Appl. Bioch
em. 3, 218-232 , 1981） ・シュードモナス（Pseudomonas）sp. PED (ATCC 4979
4)（US 5385833） ・ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythro
polis）DSM 743（J. Biotechnol. 33, 283-292, 1994） ・ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythro
polis）（Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 115,239-243, 1
996） ・ロドシュードモナス スフェロイデス（Rhodopseudomo
nas sphaeroides）（Tetrahedron Asym. 4, 1259-1269,
1993） ・スルフォロバス ソルファタリカス（Sulfolobus solf
ataricus）MT-4（Biotechnol. Lett. 13, 31-34, 199
1） ・ピキア フィンランディカ （Pichia finlandica） DS
M 70280 (WO 01/61014)
変異体をコードするDNA、および還元酵素をコードするD
NAを、公知の発現ベクターに挿入することによって作製
されるギ酸脱水酵素変異体および還元酵素の発現ベクタ
ーを提供する。該発現ベクターで形質転換した形質転換
体を培養することにより、本発明のギ酸脱水酵素変異体
および還元酵素を、組換えタンパク質として得ることが
できる。該還元酵素としては、好ましくはカルボニル還
元酵素である。具体的には、例えば下記の微生物由来の
カルボニル還元酵素を挙げることができる。 ・コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp. ST-10
（Appl. Environ. Microbiol. 63, 3783-3788, 1997） ・キャンディダ パラプシロシス（Candida parapsilosi
s）IFO 1396（特開平 07-231785） ・アルカリゲネス ユートロファス（Alcaligenes eutro
phus）N9A（J. Bacteriol. 170, 5248-5256, 1988） ・コマモナス テリゲナ（Comamonas terrigena）（Bioc
him. Biophys. Acta 661, 74-86, 1981） ・ゲオトリカム キャンディダム（Geotrichum candidu
m）IFO 4597（特公平 01-27715） ・ハンセヌラ オフナエンシス（Hansenula ofunaensi
s）AKU 4328（J. Biosci.Bioeng. 88, 148-152 ,1999） ・ノカルディア エリスロポリス（Nocardia erythropol
is）ATCC 4277（Appl. Environ. Microbiol. 61, 3729-
3722, 1995） ・ノカルディア ファスカ（Nocardia fusca） ・ピキア（Pichia）sp. NRRL-Y-11328（J. Appl. Bioch
em. 3, 218-232 , 1981） ・シュードモナス（Pseudomonas）sp. PED (ATCC 4979
4)（US 5385833） ・ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythro
polis）DSM 743（J. Biotechnol. 33, 283-292, 1994） ・ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythro
polis）（Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 115,239-243, 1
996） ・ロドシュードモナス スフェロイデス（Rhodopseudomo
nas sphaeroides）（Tetrahedron Asym. 4, 1259-1269,
1993） ・スルフォロバス ソルファタリカス（Sulfolobus solf
ataricus）MT-4（Biotechnol. Lett. 13, 31-34, 199
1） ・ピキア フィンランディカ （Pichia finlandica） DS
M 70280 (WO 01/61014)
【００３２】本発明においてギ酸脱水素酵素の変異体、
および／または還元酵素を発現させるために、形質転換
の対象となる微生物は、ギ酸脱水素酵素の変異体をコー
ドするDNA、および／または還元酵素をコードするDNAを
含む組み換えベクターにより形質転換され、ギ酸脱水素
酵素の変異体、および／または還元酵素を発現すること
ができる生物であれば特に制限されない。このような形
質転換体および該形質転換体を培養する工程を含む本発
明のギ酸脱水酵素変異体、および／または還元酵素を製
造する方法も本発明に包含される。形質転換体の宿主生
物として利用可能な微生物は、例えば以下のような微生
物を示すことができる。
および／または還元酵素を発現させるために、形質転換
の対象となる微生物は、ギ酸脱水素酵素の変異体をコー
ドするDNA、および／または還元酵素をコードするDNAを
含む組み換えベクターにより形質転換され、ギ酸脱水素
酵素の変異体、および／または還元酵素を発現すること
ができる生物であれば特に制限されない。このような形
質転換体および該形質転換体を培養する工程を含む本発
明のギ酸脱水酵素変異体、および／または還元酵素を製
造する方法も本発明に包含される。形質転換体の宿主生
物として利用可能な微生物は、例えば以下のような微生
物を示すことができる。
【００３３】・エシェリヒア(Escherichia)属、バチル
ス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セ
ラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacter
ium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、
ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチル
ス(Lactobacillus)属等の宿主ベクター系の開発されて
いる細菌 ・ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス
(Streptomyces)属等の宿主ベクター系の開発されている
放線菌 ・サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマ
イセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schi
zosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosacch
aromyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロ
ン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidiu
m)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等
の宿主ベクター系の開発されている酵母 ・ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Asper
gillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、
トリコデルマ(Trichoderma)属等の宿主ベクター系の開
発されているカビ
ス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セ
ラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacter
ium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、
ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチル
ス(Lactobacillus)属等の宿主ベクター系の開発されて
いる細菌 ・ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス
(Streptomyces)属等の宿主ベクター系の開発されている
放線菌 ・サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマ
イセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schi
zosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosacch
aromyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロ
ン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidiu
m)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等
の宿主ベクター系の開発されている酵母 ・ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Asper
gillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、
トリコデルマ(Trichoderma)属等の宿主ベクター系の開
発されているカビ
【００３４】形質転換体の作製のための手順および宿主
に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生
物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術
に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレ
キュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laborat
ories）。微生物菌体内などにおいて、本発明のギ酸脱
水素酵素の変異体遺伝子、および／または還元酵素遺伝
子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在す
るプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明
のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そ
のためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプ
ロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好まし
くはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込め
ばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、
宿主として利用する微生物中において機能することが知
られているプロモーター、ターミネーターを用いる。こ
れら各種微生物において利用可能なベクター、プロモー
ター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学
基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関して
は、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8,
423-488 (1992)、等に詳細に記載されている。
に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生
物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術
に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレ
キュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laborat
ories）。微生物菌体内などにおいて、本発明のギ酸脱
水素酵素の変異体遺伝子、および／または還元酵素遺伝
子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在す
るプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明
のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そ
のためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプ
ロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好まし
くはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込め
ばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、
宿主として利用する微生物中において機能することが知
られているプロモーター、ターミネーターを用いる。こ
れら各種微生物において利用可能なベクター、プロモー
ター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学
基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関して
は、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8,
423-488 (1992)、等に詳細に記載されている。
【００３５】エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア
・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベク
ターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、
lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペ
ロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、
PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、
ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rr
nBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いるこ
とができる。
・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベク
ターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、
lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペ
ロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、
PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、
ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rr
nBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いるこ
とができる。
【００３６】バチルス属においては、ベクターとしてpU
B110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能で
あり、染色体にインテグレートさせることも可能であ
る。また、プロモーターまたはターミネーターとしてap
r(アルカリプロテアーゼ)、 npr(中性プロテアーゼ)、
またはamy(α−アミラーゼ)等が利用できる。
B110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能で
あり、染色体にインテグレートさせることも可能であ
る。また、プロモーターまたはターミネーターとしてap
r(アルカリプロテアーゼ)、 npr(中性プロテアーゼ)、
またはamy(α−アミラーゼ)等が利用できる。
【００３７】シュードモナス属においては、シュードモ
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia)等の宿主ベクター系が
開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラ
スミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RS
F1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pK
T240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネ
ーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等
が利用できる。
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia)等の宿主ベクター系が
開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラ
スミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RS
F1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pK
T240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネ
ーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等
が利用できる。
【００３８】ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))等
のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター
またはターミネーターとしては、大腸菌で使用されてい
るプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能で
ある。
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))等
のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター
またはターミネーターとしては、大腸菌で使用されてい
るプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能で
ある。
【００３９】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen.
Genet. 196, 175 (1984)等のプラスミドベクターが利
用可能である。
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen.
Genet. 196, 175 (1984)等のプラスミドベクターが利
用可能である。
【００４０】ストレプトコッカス(Streptococcus)属に
おいては、pHV1301(FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (19
85)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (198
5)）等がプラスミドベクターとして利用可能である。
おいては、pHV1301(FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (19
85)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (198
5)）等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００４１】ラクトバチルス(Lactobacillus)属におい
ては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J.
Bacteriol. 137, 614 (1979)）等が利用可能であり、
プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用
可能である。
ては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J.
Bacteriol. 137, 614 (1979)）等が利用可能であり、
プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用
可能である。
【００４２】ロドコッカス(Rhodococcus)属において
は、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodoch
rous)から単離されたプラスミドベクター等が利用可能
である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
は、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodoch
rous)から単離されたプラスミドベクター等が利用可能
である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００４３】ストレプトマイセス(Streptomyces)属にお
いては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Strepto
myces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Labo
ratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを
構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486
(Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gen
e 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1
995) )等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バ
ージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様の
プラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 1
1, 46-53 (1997) ）。
いては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Strepto
myces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Labo
ratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを
構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486
(Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gen
e 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1
995) )等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バ
ージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様の
プラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 1
1, 46-53 (1997) ）。
【００４４】サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プ
ラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在
するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテ
グレーションベクター（EP 537456など）は、多コピー
で遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるた
め極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵
素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシ
ダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノ
ラーゼ)等のプロモーターおよびターミネーターが利用
可能である。
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プ
ラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在
するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテ
グレーションベクター（EP 537456など）は、多コピー
で遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるた
め極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵
素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシ
ダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノ
ラーゼ)等のプロモーターおよびターミネーターが利用
可能である。
【００４５】クライベロマイセス属、特にクライベロマ
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラス
ミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390
(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミ
ド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS
系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えによ
り染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド
（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、
PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用
可能である。
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラス
ミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390
(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミ
ド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS
系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えによ
り染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド
（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、
PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用
可能である。
【００４６】シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyc
es)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
のARS (自律複製に関与する遺伝子)、およびサッカロマ
イセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択
マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である
（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッ
カロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利
用できる（EMBO J. 6,729 (1987)）。特に、pAUR224
は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
es)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
のARS (自律複製に関与する遺伝子)、およびサッカロマ
イセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択
マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である
（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッ
カロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利
用できる（EMBO J. 6,729 (1987)）。特に、pAUR224
は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４７】チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyc
es)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zyg
osaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids R
es.13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクタ
ー等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジア
エ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセ
ス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リ
ン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 5
4, 2521 (1990)）等が利用可能である。
es)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zyg
osaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids R
es.13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクタ
ー等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジア
エ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセ
ス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リ
ン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 5
4, 2521 (1990)）等が利用可能である。
【００４８】ピキア(Pichia)属においては、ピキア・ア
ンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモ
ルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター
系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アン
ガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）
も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体
への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast
7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導さ
れるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素
酵素)のプロモーター等が利用可能である。また、ピキ
ア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自
律複製に関与する遺伝子 (PARS1、PARS2)等を利用した
宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol.
5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能
なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Aci
ds Res. 15, 3859 (1987)）。
ンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモ
ルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター
系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アン
ガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）
も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体
への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast
7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導さ
れるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素
酵素)のプロモーター等が利用可能である。また、ピキ
ア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自
律複製に関与する遺伝子 (PARS1、PARS2)等を利用した
宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol.
5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能
なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Aci
ds Res. 15, 3859 (1987)）。
【００４９】キャンディダ(Candida)属においては、キ
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・
ウチルス (Candida utilis) 等において宿主ベクター系
が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいて
はキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングさ
れ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これ
を利用したベクターが開発されている。また、キャンデ
ィダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイ
プのベクターの強力なプロモーターが開発されている
（特開平08-173170）。
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・
ウチルス (Candida utilis) 等において宿主ベクター系
が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいて
はキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングさ
れ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これ
を利用したベクターが開発されている。また、キャンデ
ィダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイ
プのベクターの強力なプロモーターが開発されている
（特開平08-173170）。
【００５０】アスペルギルス(Aspergillus)属において
は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、
アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) 等が
カビの中で最もよく研究されており、プラスミド、およ
び染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、
菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが
利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287
(1989)）。
は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、
アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) 等が
カビの中で最もよく研究されており、プラスミド、およ
び染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、
菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが
利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287
(1989)）。
【００５１】トリコデルマ(Trichoderma)属において
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーター等が利用できる（Biotechnolog
y 7, 596-603 (1989)）。
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーター等が利用できる（Biotechnolog
y 7, 596-603 (1989)）。
【００５２】また、微生物以外でも、植物、動物におい
て様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を
用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）、菜種、ト
ウモロコシ、またはジャガイモ等の植物中に大量に異種
タンパク質を発現させる系が開発されており好適に利用
できる。
て様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を
用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）、菜種、ト
ウモロコシ、またはジャガイモ等の植物中に大量に異種
タンパク質を発現させる系が開発されており好適に利用
できる。
【００５３】本発明において使用するギ酸脱水素酵素変
異体の生産能を有する微生物は、ギ酸脱水素酵素の変異
体生産能を有するマイコバクテリウム バッカエの突然
変異株、変種、および遺伝子操作技術の利用により作成
された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換体を含
む。
異体の生産能を有する微生物は、ギ酸脱水素酵素の変異
体生産能を有するマイコバクテリウム バッカエの突然
変異株、変種、および遺伝子操作技術の利用により作成
された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換体を含
む。
【００５４】また本発明は、本発明のギ酸脱水素酵素の
変異体、本発明の形質転換体、または該形質転換体の処
理物を用いた補酵素NAD+（酸化型β-ニコチンアミドジ
ヌクレオチド）からNADH（還元型β-ニコチンアミドジ
ヌクレオチド）を生産する方法を提供する。補酵素NADH
は、各種カルボニル還元酵素、アルコール脱水素酵素、
アルデヒド脱水素酵素、ヒドロキシ酸脱水素酵素、アミ
ノ酸脱水素酵素の還元型の補酵素として有用であり、こ
れらの酵素がその還元能を発揮するためには必須の補酵
素である。
変異体、本発明の形質転換体、または該形質転換体の処
理物を用いた補酵素NAD+（酸化型β-ニコチンアミドジ
ヌクレオチド）からNADH（還元型β-ニコチンアミドジ
ヌクレオチド）を生産する方法を提供する。補酵素NADH
は、各種カルボニル還元酵素、アルコール脱水素酵素、
アルデヒド脱水素酵素、ヒドロキシ酸脱水素酵素、アミ
ノ酸脱水素酵素の還元型の補酵素として有用であり、こ
れらの酵素がその還元能を発揮するためには必須の補酵
素である。
【００５５】さらに本発明は、NADH依存性の還元酵素に
よって酸化型基質から該基質の還元型生成物の製造を行
う際に生じるNAD+を、本発明のギ酸脱水素酵素の変異体
を用いてギ酸から炭酸への変換反応によりNADHへと再生
させ、効率的に該還元型生成物を製造する方法を提供す
る。このNADH依存性還元酵素とは、NADHを補酵素として
還元反応を行う酵素を指し、例えばアルコール脱水素酵
素のように、還元反応、酸化反応ともに触媒しうる酵素
であってもよい。また、上記方法において本発明のギ酸
脱水酵素変異体の替わりに、本発明の形質転換体または
該形質転換体の処理物を利用することも可能である。
よって酸化型基質から該基質の還元型生成物の製造を行
う際に生じるNAD+を、本発明のギ酸脱水素酵素の変異体
を用いてギ酸から炭酸への変換反応によりNADHへと再生
させ、効率的に該還元型生成物を製造する方法を提供す
る。このNADH依存性還元酵素とは、NADHを補酵素として
還元反応を行う酵素を指し、例えばアルコール脱水素酵
素のように、還元反応、酸化反応ともに触媒しうる酵素
であってもよい。また、上記方法において本発明のギ酸
脱水酵素変異体の替わりに、本発明の形質転換体または
該形質転換体の処理物を利用することも可能である。
【００５６】上記NADH依存性還元酵素、その酸化型基
質、該基質の還元型生成物としては、例えば、以下の組
み合わせを挙げることができるが、これらに制限されな
い。 ・カルボニル基を基質としてアルコールを生成する酵素
（E.C. 1.1.1.−）によるケトンからアルコールの生産 ・カルボン酸を基質としてアルデヒドを生成する酵素
（E.C. 1.2.1.−）によるカルボン酸からのアルデヒド
の生産 ・炭素炭素二重結合を還元し炭素炭素一重結合を生成す
る酵素（E.C. 1.3.1.−）による炭素炭素二重結合体か
ら炭素炭素一重結合体の生産 ・カルボニル基を基質として還元的アミノ化によりアミ
ノ基を生成する酵素（E.C. 1.4.1.−）によるケト酸か
らアミノ酸の生産 ・炭素炭素二重結合に酸素を付加することによりジオー
ルを生成する酵素（E.C.1.14.12.−）によるアルケンか
らジオールの生産
質、該基質の還元型生成物としては、例えば、以下の組
み合わせを挙げることができるが、これらに制限されな
い。 ・カルボニル基を基質としてアルコールを生成する酵素
（E.C. 1.1.1.−）によるケトンからアルコールの生産 ・カルボン酸を基質としてアルデヒドを生成する酵素
（E.C. 1.2.1.−）によるカルボン酸からのアルデヒド
の生産 ・炭素炭素二重結合を還元し炭素炭素一重結合を生成す
る酵素（E.C. 1.3.1.−）による炭素炭素二重結合体か
ら炭素炭素一重結合体の生産 ・カルボニル基を基質として還元的アミノ化によりアミ
ノ基を生成する酵素（E.C. 1.4.1.−）によるケト酸か
らアミノ酸の生産 ・炭素炭素二重結合に酸素を付加することによりジオー
ルを生成する酵素（E.C.1.14.12.−）によるアルケンか
らジオールの生産
【００５７】ここで、E.C. 1.1.1.- に分類される酵素
としては、例えばアルコール脱水素酵素、D-ヒドロキシ
イソカプロン酸脱水素酵素、L-ヒドロキシイソカプロン
酸脱水素酵素、D-マンデル酸脱水素酵素、L-マンデル酸
脱水素酵素、D-乳酸脱水素酵素、およびL-乳酸脱水素酵
素等が挙げられる。E.C.1.2.1.- に分類される酵素とし
ては、例えばアルデヒド脱水素酵素等が挙げられる。E.
C.1.3.1.- に分類される酵素としては、例えばエノイル
-CoA 還元酵素およびフマル酸還元酵素等が挙げられ
る。E.C.1.4.1.- に分類される酵素としては、例えばフ
ェニルアラニン脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、
ロイシン脱水素酵素、およびアラニン脱水素酵素等が挙
げられる。E.C.1.14.2.- に分類される酵素としては、
例えばベンゼンジオキシゲナーゼ等が挙げられる。
としては、例えばアルコール脱水素酵素、D-ヒドロキシ
イソカプロン酸脱水素酵素、L-ヒドロキシイソカプロン
酸脱水素酵素、D-マンデル酸脱水素酵素、L-マンデル酸
脱水素酵素、D-乳酸脱水素酵素、およびL-乳酸脱水素酵
素等が挙げられる。E.C.1.2.1.- に分類される酵素とし
ては、例えばアルデヒド脱水素酵素等が挙げられる。E.
C.1.3.1.- に分類される酵素としては、例えばエノイル
-CoA 還元酵素およびフマル酸還元酵素等が挙げられ
る。E.C.1.4.1.- に分類される酵素としては、例えばフ
ェニルアラニン脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、
ロイシン脱水素酵素、およびアラニン脱水素酵素等が挙
げられる。E.C.1.14.2.- に分類される酵素としては、
例えばベンゼンジオキシゲナーゼ等が挙げられる。
【００５８】これら酵素を作用させる場合の基質として
は、その酵素が作用しうる化合物であれば特に制限はな
く、基質分子内に、ハロゲン、硫黄、および／またはリ
ン等を有しているもの、水酸基、アミノ基等を有してい
るもの、炭素鎖が分枝状であるもの、炭素鎖が不飽和で
あるもの、複素環を含む芳香環を有しているものを例示
することができる。
は、その酵素が作用しうる化合物であれば特に制限はな
く、基質分子内に、ハロゲン、硫黄、および／またはリ
ン等を有しているもの、水酸基、アミノ基等を有してい
るもの、炭素鎖が分枝状であるもの、炭素鎖が不飽和で
あるもの、複素環を含む芳香環を有しているものを例示
することができる。
【００５９】本発明のギ酸脱水素酵素の変異体は、有機
溶媒に耐性を持つ、および／または有機溶媒により活性
化されるため、例えばケトンおよびアルコールの存在下
であっても活性を長く、および／または高く保持するこ
とができ、工業的なアルコール製造において有利であ
る。また、カルボニル還元酵素はNADHを補酵素とし、ケ
トンからアルコールを生成するものであれば、特に限定
されない。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養
物、または酵素を生成する微生物等の形質転換体を反応
溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行
わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態
はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液
は、基質および酵素反応に必要な補酵素のNADHを、酵素
活性の発現に適した溶媒に溶解させたものである。本発
明におけるギ酸脱水素酵素の変異体を含む微生物の処理
物、またはカルボニル還元酵素を含む微生物の処理物に
は、具体的には界面活性剤やトルエン等の有機溶媒処理
によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、ガラスビ
ーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液、
および該抽出液を部分精製したもの等が含まれる。
溶媒に耐性を持つ、および／または有機溶媒により活性
化されるため、例えばケトンおよびアルコールの存在下
であっても活性を長く、および／または高く保持するこ
とができ、工業的なアルコール製造において有利であ
る。また、カルボニル還元酵素はNADHを補酵素とし、ケ
トンからアルコールを生成するものであれば、特に限定
されない。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養
物、または酵素を生成する微生物等の形質転換体を反応
溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行
わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態
はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液
は、基質および酵素反応に必要な補酵素のNADHを、酵素
活性の発現に適した溶媒に溶解させたものである。本発
明におけるギ酸脱水素酵素の変異体を含む微生物の処理
物、またはカルボニル還元酵素を含む微生物の処理物に
は、具体的には界面活性剤やトルエン等の有機溶媒処理
によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、ガラスビ
ーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液、
および該抽出液を部分精製したもの等が含まれる。
【００６０】本発明によるアルコールの製造の原料とな
るケトンとしては、使用されるカルボニル還元酵素が還
元しうるケトンであれば特に制限はない。カルボニル還
元酵素として、クライベロマイセス アエスチュアリの
カルボニル還元酵素を用いた場合には、4-ハロアセト酢
酸エステルが好適に用いられる。この4-ハロアセト酢酸
エステルの還元反応により、 (S)-4-ハロ-3-ヒドロキシ
酪酸エステルが生成される。4-ハロアセト酢酸エステル
のハロゲンとしては、例えば臭素、塩素、ヨウ素等が挙
げられ、特に塩素が好適に用いられる。エステルとして
は、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピ
ルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、
オクチルエステル、ベンジルエステル等の直鎖、分岐
鎖、芳香族置換を含むアルコールのエステルが挙げられ
るが、エチルエステルが最も好適に用いられる。4-ハロ
アセト酢酸エステルの誘導体としては、例えば、２位の
直鎖もしくは分岐鎖を含むアルキル鎖、塩素、臭素、ヨ
ウ素等のハロゲンを含む誘導体を挙げることができる。
るケトンとしては、使用されるカルボニル還元酵素が還
元しうるケトンであれば特に制限はない。カルボニル還
元酵素として、クライベロマイセス アエスチュアリの
カルボニル還元酵素を用いた場合には、4-ハロアセト酢
酸エステルが好適に用いられる。この4-ハロアセト酢酸
エステルの還元反応により、 (S)-4-ハロ-3-ヒドロキシ
酪酸エステルが生成される。4-ハロアセト酢酸エステル
のハロゲンとしては、例えば臭素、塩素、ヨウ素等が挙
げられ、特に塩素が好適に用いられる。エステルとして
は、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピ
ルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、
オクチルエステル、ベンジルエステル等の直鎖、分岐
鎖、芳香族置換を含むアルコールのエステルが挙げられ
るが、エチルエステルが最も好適に用いられる。4-ハロ
アセト酢酸エステルの誘導体としては、例えば、２位の
直鎖もしくは分岐鎖を含むアルキル鎖、塩素、臭素、ヨ
ウ素等のハロゲンを含む誘導体を挙げることができる。
【００６１】本発明の酵素を用いた反応は、水中もしく
は水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢
酸ブチル、トルエン、クロロホルム、シクロヘキサン、
1-オクタノール、n-ヘキサン、n-オクタン等の有機溶媒
中、もしくは水性媒体との2相系により行うことができ
る。また、緩衝液等の水系にメタノール、エタノール、
イソプロパノール、アセトニトリル、アセトンなどの水
溶性溶媒を加えた混合溶媒系においても行うことが可能
である。また、逆ミセル系での反応も行うことができ、
界面活性剤としては、例えばエーロゾルOT（Aerosol O
T）を用いたイソオクタン／水逆ミセル系等を挙げるこ
とができる。
は水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢
酸ブチル、トルエン、クロロホルム、シクロヘキサン、
1-オクタノール、n-ヘキサン、n-オクタン等の有機溶媒
中、もしくは水性媒体との2相系により行うことができ
る。また、緩衝液等の水系にメタノール、エタノール、
イソプロパノール、アセトニトリル、アセトンなどの水
溶性溶媒を加えた混合溶媒系においても行うことが可能
である。また、逆ミセル系での反応も行うことができ、
界面活性剤としては、例えばエーロゾルOT（Aerosol O
T）を用いたイソオクタン／水逆ミセル系等を挙げるこ
とができる。
【００６２】本発明の反応は、例えば、固定化酵素、膜
リアクター等を利用して行うことも可能である。本発明
の酵素、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは
酵素を生成する微生物等の形質転換体を固定化する場合
には、含硫多糖、例えばκ-カラギーナンやアルギン酸
カルシウム、寒天ゲル法、ポリアクリルアミドゲル法等
の公知の方法により固定化することができる。
リアクター等を利用して行うことも可能である。本発明
の酵素、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは
酵素を生成する微生物等の形質転換体を固定化する場合
には、含硫多糖、例えばκ-カラギーナンやアルギン酸
カルシウム、寒天ゲル法、ポリアクリルアミドゲル法等
の公知の方法により固定化することができる。
【００６３】また、本発明の反応は、本発明の酵素が反
応できる条件であれば良く、反応温度 4−60℃、好まし
くは10−37℃、pH3−11、好ましくはpH5−8、基質濃度
0.01−90％、好ましくは0.1−30％で行うことができ
る。菌体またはその処理物を反応に利用する場合には、
反応系に必要に応じて補酵素NAD+もしくはNADHを0.001m
M−100mM、好ましくは、0.01−10mM添加することができ
る。また、基質は反応開始時に一括して添加することも
可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなり過ぎない
ように連続的、もしくは間欠的に添加することが望まし
い。
応できる条件であれば良く、反応温度 4−60℃、好まし
くは10−37℃、pH3−11、好ましくはpH5−8、基質濃度
0.01−90％、好ましくは0.1−30％で行うことができ
る。菌体またはその処理物を反応に利用する場合には、
反応系に必要に応じて補酵素NAD+もしくはNADHを0.001m
M−100mM、好ましくは、0.01−10mM添加することができ
る。また、基質は反応開始時に一括して添加することも
可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなり過ぎない
ように連続的、もしくは間欠的に添加することが望まし
い。
【００６４】本発明のケトンの還元により生成するアル
コールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理
等による分離、溶媒抽出、蒸留、晶析等を適当に組み合
わせることにより行うことができる。例えば、4-ハロ-3
-ヒドロキシ酪酸エステルでは、微生物菌体を含む反応
液を遠心分離し、微生物菌体を除いた後、限外ろ過によ
りタンパク質を除去し、そのろ液に酢酸エチル、トルエ
ン等の溶媒を添加して4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステ
ルを溶媒層に抽出する。これを相分離後、減圧濃縮する
ことにより純度の高い4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステ
ルを精製することができる。
コールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理
等による分離、溶媒抽出、蒸留、晶析等を適当に組み合
わせることにより行うことができる。例えば、4-ハロ-3
-ヒドロキシ酪酸エステルでは、微生物菌体を含む反応
液を遠心分離し、微生物菌体を除いた後、限外ろ過によ
りタンパク質を除去し、そのろ液に酢酸エチル、トルエ
ン等の溶媒を添加して4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステ
ルを溶媒層に抽出する。これを相分離後、減圧濃縮する
ことにより純度の高い4-ハロ-3-ヒドロキシ酪酸エステ
ルを精製することができる。
【００６５】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］ マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸
脱水素酵素のサブクローニング 文献（Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483（19
95））記載のプラスミド pMcFDH（E-P）よりギ酸脱水素
酵素のサブクローニングを行った。文献記載の構造遺伝
子5'-末、3'-末配列をもとに、ギ酸脱水素酵素のオープ
ンリーディングフレーム部分のみをクローニングするた
めに、プライマー MCF-ATG2 (5'- CTTTCTAGAGGAATTCAAC
CATGGCAAAAGTTCTGTGTGTTC -3'／配列番号：３）、MCF-T
AA3 (5'-CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG -3'／配
列番号：４）を合成した。プラスミド（pMcFDH（E-
P））を鋳型として、PCR（95℃, 45秒、50℃, 1分、75
℃, 7分）を30サイクル行い、特異的な増幅DNAを得た。
得られたDNA断片をNcoIとXbaIの2種類の制限酵素で二重
消化した。プラスミドベクター pSE420D（特開2000-189
170）をNcoIとXbaIで二重消化し、該酵素で二重消化し
た PCR 増幅 DNA 断片をT4 DNA リガーゼで連結し、pSE
-MCF15 を得た。プラスミドマップを 図１（図：pSE-MC
F15）に示す。挿入 DNA 断片の塩基配列の解析を行った
結果、そのコードするタンパク質は文献記載のDNA配列
と一致した。得られたギ酸脱水素酵素の塩基配列をMcFD
H-ORF（配列番号：１） に、該遺伝子がコードするタン
パク質のアミノ酸配列をMcFDH-ORF-p（配列番号：２）
に示す。
が、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］ マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸
脱水素酵素のサブクローニング 文献（Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483（19
95））記載のプラスミド pMcFDH（E-P）よりギ酸脱水素
酵素のサブクローニングを行った。文献記載の構造遺伝
子5'-末、3'-末配列をもとに、ギ酸脱水素酵素のオープ
ンリーディングフレーム部分のみをクローニングするた
めに、プライマー MCF-ATG2 (5'- CTTTCTAGAGGAATTCAAC
CATGGCAAAAGTTCTGTGTGTTC -3'／配列番号：３）、MCF-T
AA3 (5'-CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG -3'／配
列番号：４）を合成した。プラスミド（pMcFDH（E-
P））を鋳型として、PCR（95℃, 45秒、50℃, 1分、75
℃, 7分）を30サイクル行い、特異的な増幅DNAを得た。
得られたDNA断片をNcoIとXbaIの2種類の制限酵素で二重
消化した。プラスミドベクター pSE420D（特開2000-189
170）をNcoIとXbaIで二重消化し、該酵素で二重消化し
た PCR 増幅 DNA 断片をT4 DNA リガーゼで連結し、pSE
-MCF15 を得た。プラスミドマップを 図１（図：pSE-MC
F15）に示す。挿入 DNA 断片の塩基配列の解析を行った
結果、そのコードするタンパク質は文献記載のDNA配列
と一致した。得られたギ酸脱水素酵素の塩基配列をMcFD
H-ORF（配列番号：１） に、該遺伝子がコードするタン
パク質のアミノ酸配列をMcFDH-ORF-p（配列番号：２）
に示す。
【００６６】［実施例２］ マイコバクテリウム バッ
カエ由来ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエス
チュアリ由来のカルボニル還元酵素との共発現ベクター
pSFR415の構築 クライベロマイセス アエスチュアリ由来のカルボニル
還元酵素のオープンリーディングフレームのみをPCRク
ローニングするために、プライマーKAR-BSG5-3(5'- TAA
TCTAGAGGAATTCAATAATGGATCCAACAATGACGTTTC -3'／配列
番号：５)、KAR-BSG3 (5'- TAGAAGCTTAAGCTATTAAACGCAA
GTGTACCCAC -3'／配列番号：６)を合成した。pSE-KAR1
（特開2000-236883）を鋳型として、PCR（95℃, 30秒、
50℃, 1分、75℃, 5分）を30サイクル行い、特異的な増
幅DNAを得た。得られたDNA断片をXbaI、HindIIIの2つの
制限酵素で二重消化した。実施例１で構築したマイコバ
クテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素を含むプラス
ミド pSE-MCF15 をXbaI、HindIIIの2つの制限酵素で消
化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をT4 DNA リガーゼ
で連結し、ギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時
に発現可能なプラスミドpSFR415 を得た。プラスミド p
SFR415のマップを図２に示す。本プラスミドを有する大
腸菌(JM109(pSFR415))は、平成１２年１１月１０日付け
で次のように寄託した。
カエ由来ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエス
チュアリ由来のカルボニル還元酵素との共発現ベクター
pSFR415の構築 クライベロマイセス アエスチュアリ由来のカルボニル
還元酵素のオープンリーディングフレームのみをPCRク
ローニングするために、プライマーKAR-BSG5-3(5'- TAA
TCTAGAGGAATTCAATAATGGATCCAACAATGACGTTTC -3'／配列
番号：５)、KAR-BSG3 (5'- TAGAAGCTTAAGCTATTAAACGCAA
GTGTACCCAC -3'／配列番号：６)を合成した。pSE-KAR1
（特開2000-236883）を鋳型として、PCR（95℃, 30秒、
50℃, 1分、75℃, 5分）を30サイクル行い、特異的な増
幅DNAを得た。得られたDNA断片をXbaI、HindIIIの2つの
制限酵素で二重消化した。実施例１で構築したマイコバ
クテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素を含むプラス
ミド pSE-MCF15 をXbaI、HindIIIの2つの制限酵素で消
化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をT4 DNA リガーゼ
で連結し、ギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時
に発現可能なプラスミドpSFR415 を得た。プラスミド p
SFR415のマップを図２に示す。本プラスミドを有する大
腸菌(JM109(pSFR415))は、平成１２年１１月１０日付け
で次のように寄託した。
【００６７】寄託機関の名称・あて名 名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託
センター（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所） あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第
６ （郵便番号305-8566） 寄託日 平成１２年１１月１０日 受託番号 生命研菌寄第１８１１６号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１８１１６）
センター（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所） あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第
６ （郵便番号305-8566） 寄託日 平成１２年１１月１０日 受託番号 生命研菌寄第１８１１６号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１８１１６）
【００６８】［実施例３］ マイコバクテリウム バッ
カエ由来ギ酸脱水素酵素へのPCRによる変異導入 実施例２で構築したマイコバクテリウム バッカエ由来
ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエスチュアリ
由来のカルボニル還元酵素の共発現ベクターpSFR415を
もとにして、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱
水素酵素の6位のCysをSerへ変えるためのプライマーと
してMCF-ATG3 (5'- CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTT
CTGTCTGTTC -3'／配列番号：７）を、256位のCysをSer
へ変えるためのプライマーとして McFDH-7mut01 (5'- G
TATCCGGTTTGCGACGTCGTGACGCTGAACTCCCCGCTGCACCCCGAA -
3'／配列番号：８）、McFDH-7mut02 (5'- TTCGGGGTGCAG
CGGGGAGTTCAGCGTCACGACGTCGCAAACCGGATAC -3'／配列番
号：９）を合成した。以後、6位のCysをSerに置き換え
ることをC6Sと表記する。これに従えば、256位のCysをS
erに変えた場合は、C256Sと表記される。
カエ由来ギ酸脱水素酵素へのPCRによる変異導入 実施例２で構築したマイコバクテリウム バッカエ由来
ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエスチュアリ
由来のカルボニル還元酵素の共発現ベクターpSFR415を
もとにして、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱
水素酵素の6位のCysをSerへ変えるためのプライマーと
してMCF-ATG3 (5'- CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTT
CTGTCTGTTC -3'／配列番号：７）を、256位のCysをSer
へ変えるためのプライマーとして McFDH-7mut01 (5'- G
TATCCGGTTTGCGACGTCGTGACGCTGAACTCCCCGCTGCACCCCGAA -
3'／配列番号：８）、McFDH-7mut02 (5'- TTCGGGGTGCAG
CGGGGAGTTCAGCGTCACGACGTCGCAAACCGGATAC -3'／配列番
号：９）を合成した。以後、6位のCysをSerに置き換え
ることをC6Sと表記する。これに従えば、256位のCysをS
erに変えた場合は、C256Sと表記される。
【００６９】プラスミドpSFR415 を鋳型として、プライ
マー MCF-ATG3、McFDH-7mut02 のセットおよびプライマ
ー MCFDH-7mut01、MCF-TAA3のセットにより1st PCR（94
℃,30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行
った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断片を希
釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列番号：７）、M
CF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PCR（94℃, 30
秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行った。
得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2つの制限酵素で
二重消化した。pSFR415を NcoI、XbaI の2つの制限酵素
で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をT4 DNA
リガーゼで連結し、C6S、C256Sの変異の導入されたギ酸
脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプ
ラスミドpSFR411 を得た。得られたプラスミドの塩基配
列の解析を行い、変異が導入されていることを確認し
た。
マー MCF-ATG3、McFDH-7mut02 のセットおよびプライマ
ー MCFDH-7mut01、MCF-TAA3のセットにより1st PCR（94
℃,30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行
った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断片を希
釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列番号：７）、M
CF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PCR（94℃, 30
秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行った。
得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2つの制限酵素で
二重消化した。pSFR415を NcoI、XbaI の2つの制限酵素
で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をT4 DNA
リガーゼで連結し、C6S、C256Sの変異の導入されたギ酸
脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプ
ラスミドpSFR411 を得た。得られたプラスミドの塩基配
列の解析を行い、変異が導入されていることを確認し
た。
【００７０】［実施例４］ C6S、C146SおよびC256S変
異マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の
構築 実施例３で得られたプラスミド pSFR411をもとにして、
マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の146
位のCysをSerへ変えるためのプライマーとして、McFDH-
12F (5'- CGGAAGTCACCTACTCAAACTCGATCAGCGTCG -3'／配
列番号：１０）、McFDH-12R (5'- CGACGCTGATCGAGTTTGA
GTAGGTGACTTCCG -3'／配列番号：１１）を合成した。
異マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の
構築 実施例３で得られたプラスミド pSFR411をもとにして、
マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の146
位のCysをSerへ変えるためのプライマーとして、McFDH-
12F (5'- CGGAAGTCACCTACTCAAACTCGATCAGCGTCG -3'／配
列番号：１０）、McFDH-12R (5'- CGACGCTGATCGAGTTTGA
GTAGGTGACTTCCG -3'／配列番号：１１）を合成した。
【００７１】プラスミドpSFR411を鋳型として、プライ
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、McFDH-12R（配列番
号：１１）のセットおよびプライマーMcFDH-12F（配列
番号：１０）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットによ
り1st PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25
サイクル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅され
たDNA断片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列
番号：７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PC
R（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2
つの制限酵素で二重消化した。pSFR411を NcoI、XbaI
の2つの制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増
幅断片をT4 DNA リガーゼで連結し、C6S、C146S、C256S
の変異の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵
素を同時に発現可能なプラスミドpSFR412を得た。得ら
れたプラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入さ
れていることを確認した。
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、McFDH-12R（配列番
号：１１）のセットおよびプライマーMcFDH-12F（配列
番号：１０）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットによ
り1st PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25
サイクル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅され
たDNA断片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列
番号：７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PC
R（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2
つの制限酵素で二重消化した。pSFR411を NcoI、XbaI
の2つの制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増
幅断片をT4 DNA リガーゼで連結し、C6S、C146S、C256S
の変異の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵
素を同時に発現可能なプラスミドpSFR412を得た。得ら
れたプラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入さ
れていることを確認した。
【００７２】［実施例５］ C6S、C249SおよびC256S変
異マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の
構築 実施例３で得られたプラスミド pSFR411をもとにして、
マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の249
位のCysをSerへ変えるためのプライマーとして、McFDH-
13F (5'- GACATGTATCCGGTTTCTGACGTCGTGACGCTG -3'／配
列番号：１２）、McFDH-13R (5'- CAGCGTCACGACGTCAGAA
ACCGGATACATGTC -3'／配列番号：１３）を合成した。
異マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の
構築 実施例３で得られたプラスミド pSFR411をもとにして、
マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の249
位のCysをSerへ変えるためのプライマーとして、McFDH-
13F (5'- GACATGTATCCGGTTTCTGACGTCGTGACGCTG -3'／配
列番号：１２）、McFDH-13R (5'- CAGCGTCACGACGTCAGAA
ACCGGATACATGTC -3'／配列番号：１３）を合成した。
【００７３】プラスミドpSFR411を鋳型として、プライ
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、McFDH-13R（配列番
号：１３）のセットおよびプライマーMcFDH-13F（配列
番号：１２）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットによ
り1st PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25
サイクル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅され
たDNA断片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列
番号：７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PC
R（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2
つの制限酵素で二重消化した。pSFR411をNcoI、XbaI の
2つの制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅
断片をT4 DNAリガーゼで連結し、C6S、C249S、C256Sの
変異の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素
を同時に発現可能なプラスミドpSFR413 を得た。得られ
たプラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入され
ていることを確認した。
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、McFDH-13R（配列番
号：１３）のセットおよびプライマーMcFDH-13F（配列
番号：１２）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットによ
り1st PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25
サイクル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅され
たDNA断片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列
番号：７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PC
R（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2
つの制限酵素で二重消化した。pSFR411をNcoI、XbaI の
2つの制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅
断片をT4 DNAリガーゼで連結し、C6S、C249S、C256Sの
変異の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素
を同時に発現可能なプラスミドpSFR413 を得た。得られ
たプラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入され
ていることを確認した。
【００７４】［実施例６］ C6S、C256SおよびC355S変
異マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の
構築 得られたプラスミド pSFR411をもとにして、マイコバク
テリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の355位のCysをS
erへ変えるためのプライマーとして、McFDH-14F (5'- C
GAGATCCTGGAGTCATTCTTCGAAGGCCGTCCGA -3'／配列番号：
１４）、McFDH-14R (5'- TCGGACGGCCTTCGAAGAATGACTCCA
GGATCTCG -3'／配列番号：１５）を合成した。
異マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の
構築 得られたプラスミド pSFR411をもとにして、マイコバク
テリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の355位のCysをS
erへ変えるためのプライマーとして、McFDH-14F (5'- C
GAGATCCTGGAGTCATTCTTCGAAGGCCGTCCGA -3'／配列番号：
１４）、McFDH-14R (5'- TCGGACGGCCTTCGAAGAATGACTCCA
GGATCTCG -3'／配列番号：１５）を合成した。
【００７５】プラスミドpSFR411を鋳型として、プライ
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、McFDH-14R（配列番
号：１５）のセットおよびプライマーMcFDH-14F（配列
番号：１４）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットによ
り1st PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25
サイクル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅され
たDNA断片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列
番号：７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PC
R（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2
つの制限酵素で二重消化した。pSFR411を NcoI、XbaI
の2つの制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増
幅断片をT4 DNA リガーゼで連結し、C6S、C256S、C355S
の変異の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵
素を同時に発現可能なプラスミドpSFR414を得た。得ら
れたプラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入さ
れていることを確認した。
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、McFDH-14R（配列番
号：１５）のセットおよびプライマーMcFDH-14F（配列
番号：１４）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットによ
り1st PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25
サイクル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅され
たDNA断片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列
番号：７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PC
R（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2
つの制限酵素で二重消化した。pSFR411を NcoI、XbaI
の2つの制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増
幅断片をT4 DNA リガーゼで連結し、C6S、C256S、C355S
の変異の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵
素を同時に発現可能なプラスミドpSFR414を得た。得ら
れたプラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入さ
れていることを確認した。
【００７６】［実施例７］ C6AおよびC256S変異マイコ
バクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例３で得られたプラスミドpSFR411をもとにして、
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の6位
をAlaへ変えるためのプライマーとして、MCF-416F (5'-
ATGGCAAAAGTTTTAGCTGTTCTTTACGAT -3'／配列番号：１
６）、MCF-416R (5'- ATCGTAAAGAACAGCTAAAACTTTTGCCAT
-3'／配列番号：１７）を、対プライマーとして、170F
5'- GGCAAATATTCTGAAATGAGC -3'／配列番号：１８）、
MCF-777R (5'- TCACGACGTCGCAAACCGGA -3'／配列番号：
１９）を合成した。
バクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例３で得られたプラスミドpSFR411をもとにして、
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の6位
をAlaへ変えるためのプライマーとして、MCF-416F (5'-
ATGGCAAAAGTTTTAGCTGTTCTTTACGAT -3'／配列番号：１
６）、MCF-416R (5'- ATCGTAAAGAACAGCTAAAACTTTTGCCAT
-3'／配列番号：１７）を、対プライマーとして、170F
5'- GGCAAATATTCTGAAATGAGC -3'／配列番号：１８）、
MCF-777R (5'- TCACGACGTCGCAAACCGGA -3'／配列番号：
１９）を合成した。
【００７７】プラスミドpSFR411を鋳型として、プライ
マー170F（配列番号：１８）、MCF-416R（配列番号：１
７）のセットおよびプライマーMCF-416F（配列番号：１
６）、MCF-777R（配列番号：１９）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー 170F（配列番号：１
８）、MCF-777R（配列番号：１９）を加え、2nd PCR（9
4℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を
行った。得られたPCR増幅断片をNheI、BglIIの2つの制
限酵素で二重消化した。pSFR411をNheI、BglIIの2つの
制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片
をT4 DNA リガーゼで連結し、C6A、C256Sの変異の導入
されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発
現可能なプラスミドpSFR416を得た。得られたプラスミ
ドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されていること
を確認した。
マー170F（配列番号：１８）、MCF-416R（配列番号：１
７）のセットおよびプライマーMCF-416F（配列番号：１
６）、MCF-777R（配列番号：１９）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー 170F（配列番号：１
８）、MCF-777R（配列番号：１９）を加え、2nd PCR（9
4℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を
行った。得られたPCR増幅断片をNheI、BglIIの2つの制
限酵素で二重消化した。pSFR411をNheI、BglIIの2つの
制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片
をT4 DNA リガーゼで連結し、C6A、C256Sの変異の導入
されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発
現可能なプラスミドpSFR416を得た。得られたプラスミ
ドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されていること
を確認した。
【００７８】［実施例８] C6VおよびC256S変異マイコ
バクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例３で得られたプラスミドpSFR411をもとにして、
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の6位
をValへ変えるためのプライマーとして、MCF-417F (5'-
ATGGCAAAAGTTTTAGTAGTTCTTTACGAT -3'／配列番号：２
０）、MCF-417R (5'- ATCGTAAAGAACTACTAAAACTTTTGCCAT
-3'／配列番号：２１)を合成した。
バクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例３で得られたプラスミドpSFR411をもとにして、
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の6位
をValへ変えるためのプライマーとして、MCF-417F (5'-
ATGGCAAAAGTTTTAGTAGTTCTTTACGAT -3'／配列番号：２
０）、MCF-417R (5'- ATCGTAAAGAACTACTAAAACTTTTGCCAT
-3'／配列番号：２１)を合成した。
【００７９】プラスミドpSFR411を鋳型として、プライ
マー170F（配列番号：１８）、MCF-417R（配列番号：２
１）のセットおよびプライマーMCF-417F（配列番号：２
０）、MCF-777R（配列番号：１９）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー 170F（配列番号：１
８）、MCF-777R（配列番号：１９）を加え、2nd PCR（9
4℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を
行った。得られたPCR増幅断片をNheI、BglIIの2つの制
限酵素で二重消化した。pSFR411をNheI、BglIIの2つの
制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片
をT4 DNA リガーゼで連結し、C6V、C256Sの変異の導入
されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発
現可能なプラスミドpSFR417を得た。得られたプラスミ
ドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されていること
を確認した。
マー170F（配列番号：１８）、MCF-417R（配列番号：２
１）のセットおよびプライマーMCF-417F（配列番号：２
０）、MCF-777R（配列番号：１９）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー 170F（配列番号：１
８）、MCF-777R（配列番号：１９）を加え、2nd PCR（9
4℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を
行った。得られたPCR増幅断片をNheI、BglIIの2つの制
限酵素で二重消化した。pSFR411をNheI、BglIIの2つの
制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片
をT4 DNA リガーゼで連結し、C6V、C256Sの変異の導入
されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発
現可能なプラスミドpSFR417を得た。得られたプラスミ
ドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されていること
を確認した。
【００８０】［実施例９］ C6SおよびC256A変異マイコ
バクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例３で得られたプラスミドpSFR411をもとにして、
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の256
位をAlaへ変えるためのプライマーとして、MCF-418F
(5'- GTGACGCTGAACGCTCCGCTGCACCCC -3'／配列番号：２
２）、MCF-418R (5'- GGGGTGCAGCGGAGCGTTCAGCGTCAC -
3'／配列番号：２３）を合成した。
バクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例３で得られたプラスミドpSFR411をもとにして、
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の256
位をAlaへ変えるためのプライマーとして、MCF-418F
(5'- GTGACGCTGAACGCTCCGCTGCACCCC -3'／配列番号：２
２）、MCF-418R (5'- GGGGTGCAGCGGAGCGTTCAGCGTCAC -
3'／配列番号：２３）を合成した。
【００８１】プラスミドpSFR411を鋳型として、プライ
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、MCF-418R（配列番号：
２３）のセットおよびプライマーMCF-418F（配列番号：
２２）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列番号：
７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PCR（94
℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行
った。得られたPCR増幅断片をBglII、XbaI の2つの制限
酵素で二重消化した。pSFR411をBglII、XbaIの2つの制
限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をT
4 DNAリガーゼで連結し、C6S、C256Aの変異の導入され
たギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可
能なプラスミドpSFR418を得た。得られたプラスミドの
塩基配列の解析を行い、変異が導入されていることを確
認した。
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、MCF-418R（配列番号：
２３）のセットおよびプライマーMCF-418F（配列番号：
２２）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列番号：
７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PCR（94
℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行
った。得られたPCR増幅断片をBglII、XbaI の2つの制限
酵素で二重消化した。pSFR411をBglII、XbaIの2つの制
限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をT
4 DNAリガーゼで連結し、C6S、C256Aの変異の導入され
たギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可
能なプラスミドpSFR418を得た。得られたプラスミドの
塩基配列の解析を行い、変異が導入されていることを確
認した。
【００８２】［実施例１０］ C6SおよびC256V変異マイ
コバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例３で得られたプラスミドpSFR411をもとにして、
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の256
位をValへ変えるためのプライマーとして、MCF-419F
(5'- GTGACGCTGAACGTTCCGCTGCACCCC -3'／配列番号：２
４）、MCF-419R (5'- GGGGTGCAGCGGAACGTTCAGCGTCAC -
3'／配列番号：２５)を合成した。
コバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例３で得られたプラスミドpSFR411をもとにして、
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の256
位をValへ変えるためのプライマーとして、MCF-419F
(5'- GTGACGCTGAACGTTCCGCTGCACCCC -3'／配列番号：２
４）、MCF-419R (5'- GGGGTGCAGCGGAACGTTCAGCGTCAC -
3'／配列番号：２５)を合成した。
【００８３】プラスミドpSFR411を鋳型として、プライ
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、MCF-418R（配列番号：
２３）のセットおよびプライマーMCF-418F（配列番号：
２２）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列番号：
７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PCR（94
℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行
った。得られたPCR増幅断片をBglII、XbaIの2つの制限
酵素で二重消化した。pSFR411をBglII、XbaIの2つの制
限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をT
4 DNA リガーゼで連結し、C6S、C256Vの変異の導入され
たギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可
能なプラスミドpSFR419 を得た。得られたプラスミドの
塩基配列の解析を行い、変異が導入されていることを確
認した。
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、MCF-418R（配列番号：
２３）のセットおよびプライマーMCF-418F（配列番号：
２２）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列番号：
７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PCR（94
℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行
った。得られたPCR増幅断片をBglII、XbaIの2つの制限
酵素で二重消化した。pSFR411をBglII、XbaIの2つの制
限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をT
4 DNA リガーゼで連結し、C6S、C256Vの変異の導入され
たギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可
能なプラスミドpSFR419 を得た。得られたプラスミドの
塩基配列の解析を行い、変異が導入されていることを確
認した。
【００８４】［実施例１１］ C146S変異マイコバクテ
リウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築したpSFR415をBglII、BsrBRIの2つの制
限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳
動を行い、約6kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。実施例４で構築した pSFR412をBglII、BsrBR
Iの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロ
ース電気泳動を行い、約0.4kbp のバンドを切り出し、S
ephaglasBandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4
DNAリガーゼで連結し、C146S変異の導入されたギ酸脱
水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプラ
スミドpSFR420 を得た。得られたプラスミドの塩基配列
の解析を行い、変異が導入されていることを確認した。
リウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築したpSFR415をBglII、BsrBRIの2つの制
限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳
動を行い、約6kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。実施例４で構築した pSFR412をBglII、BsrBR
Iの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロ
ース電気泳動を行い、約0.4kbp のバンドを切り出し、S
ephaglasBandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4
DNAリガーゼで連結し、C146S変異の導入されたギ酸脱
水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプラ
スミドpSFR420 を得た。得られたプラスミドの塩基配列
の解析を行い、変異が導入されていることを確認した。
【００８５】［実施例１２］ C256S変異マイコバクテ
リウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築したpSFR415をMluI、BsrBRIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.5kbpのバンドを切り出し、Sephaglas Band
Prep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、回
収した。実施例４で構築した pSFR412をMluI、BsrBRIの
2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロー
ス電気泳動を行い、約4.8kbp のバンドを切り出し、Sep
haglas BandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4
DNAリガーゼで連結し、C256S変異の導入されたギ酸脱
水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプラ
スミドpSFR421を得た。得られたプラスミドの塩基配列
の解析を行い、変異が導入されていることを確認した。
リウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築したpSFR415をMluI、BsrBRIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.5kbpのバンドを切り出し、Sephaglas Band
Prep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、回
収した。実施例４で構築した pSFR412をMluI、BsrBRIの
2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロー
ス電気泳動を行い、約4.8kbp のバンドを切り出し、Sep
haglas BandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4
DNAリガーゼで連結し、C256S変異の導入されたギ酸脱
水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプラ
スミドpSFR421を得た。得られたプラスミドの塩基配列
の解析を行い、変異が導入されていることを確認した。
【００８６】［実施例１３］ C146SおよびC256S変異マ
イコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築した pSFR415をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbpのバンドを切り出し、Sephaglas Band
Prep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、回
収した。実施例４で構築したpSFR412をMluI、BglIIの2
つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース
電気泳動を行い、約5.1kbpのバンドを切り出し、Sephag
las BandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により
精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4 DNA
リガーゼで連結し、C146S、C256S変異の導入されたギ酸
脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプ
ラスミドpSFR422を得た。得られたプラスミドの塩基配
列の解析を行い、変異が導入されていることを確認し
た。
イコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築した pSFR415をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbpのバンドを切り出し、Sephaglas Band
Prep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、回
収した。実施例４で構築したpSFR412をMluI、BglIIの2
つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース
電気泳動を行い、約5.1kbpのバンドを切り出し、Sephag
las BandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により
精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4 DNA
リガーゼで連結し、C146S、C256S変異の導入されたギ酸
脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプ
ラスミドpSFR422を得た。得られたプラスミドの塩基配
列の解析を行い、変異が導入されていることを確認し
た。
【００８７】［実施例１４］ C256V変異マイコバクテ
リウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築したpSFR415をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。実施例１０で構築した pSFR419をMluI、BglI
Iの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロ
ース電気泳動を行い、約5.1kbp のバンドを切り出し、S
ephaglasBandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4
DNA リガーゼで連結し、C256V変異の導入されたギ酸脱
水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプラ
スミドpSFR423を得た。得られたプラスミドの塩基配列
の解析を行い、変異が導入されていることを確認した。
リウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築したpSFR415をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。実施例１０で構築した pSFR419をMluI、BglI
Iの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロ
ース電気泳動を行い、約5.1kbp のバンドを切り出し、S
ephaglasBandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4
DNA リガーゼで連結し、C256V変異の導入されたギ酸脱
水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能なプラ
スミドpSFR423を得た。得られたプラスミドの塩基配列
の解析を行い、変異が導入されていることを確認した。
【００８８】［実施例１５］ C146SおよびC256V変異マ
イコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築したpSFR415をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。実施例４で構築したpSFR412をBglII、BsrBRI
の2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロ
ース電気泳動を行い、約0.4kbp のバンドを切り出し、S
ephaglasBandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。実施例１０で構築した pSFR419を
MluI、BsrBRIの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈
殿後、アガロース電気泳動を行い、約4.7kbp のバンド
を切り出し、Sephaglas BandPrep（Amersham Pharmacia
Biotech製）により精製、回収した。両DNA断片を等mol
ずつ混合し、T4 DNAリガーゼで連結し、C146S、C256V変
異の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を
同時に発現可能なプラスミドpSFR424 を得た。得られた
プラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されて
いることを確認した。
イコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例２で構築したpSFR415をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。実施例４で構築したpSFR412をBglII、BsrBRI
の2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロ
ース電気泳動を行い、約0.4kbp のバンドを切り出し、S
ephaglasBandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。実施例１０で構築した pSFR419を
MluI、BsrBRIの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈
殿後、アガロース電気泳動を行い、約4.7kbp のバンド
を切り出し、Sephaglas BandPrep（Amersham Pharmacia
Biotech製）により精製、回収した。両DNA断片を等mol
ずつ混合し、T4 DNAリガーゼで連結し、C146S、C256V変
異の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を
同時に発現可能なプラスミドpSFR424 を得た。得られた
プラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されて
いることを確認した。
【００８９】［実施例１６］ C6AおよびC256V変異マイ
コバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例７で構築したpSFR416をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。実施例１０で構築したpSFR419をMluI、BglII
の2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロ
ース電気泳動を行い、約5.1kbp のバンドを切り出し、S
ephaglasBandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4
DNAリガーゼで連結し、C6A、C256V変異の導入されたギ
酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能な
プラスミドpSFR425 を得た。得られたプラスミドの塩基
配列の解析を行い、変異が導入されていることを確認し
た。
コバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構築 実施例７で構築したpSFR416をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。実施例１０で構築したpSFR419をMluI、BglII
の2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロ
ース電気泳動を行い、約5.1kbp のバンドを切り出し、S
ephaglasBandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）に
より精製、回収した。両DNA断片を等molずつ混合し、T4
DNAリガーゼで連結し、C6A、C256V変異の導入されたギ
酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同時に発現可能な
プラスミドpSFR425 を得た。得られたプラスミドの塩基
配列の解析を行い、変異が導入されていることを確認し
た。
【００９０】［実施例１７］ C6A、C146SおよびC256V
変異マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素
の構築 実施例７で構築した pSFR416をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。次いで、実施例４で構築したpSFR412をBglI
I、BsrBRIの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿
後、アガロース電気泳動を行い、約0.4kbpのバンドを切
り出し、Sephaglas BandPrep（Amersham Pharmacia Bio
tech製）により精製、回収した。さらに実施例１０で構
築した pSFR419をMluI、BsrBRIの2つの制限酵素で消化
し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、約
4.7kbpのバンドを切り出し、Sephaglas BandPrep（Amer
sham Pharmacia Biotech製）により精製、回収した。両
DNA断片を等molずつ混合し、T4 DNAリガーゼで連結し、
C6A、C146S、C256V変異の導入されたギ酸脱水素酵素と
カルボニル還元酵素を同時に発現可能なプラスミドpSFR
426を得た。得られたプラスミドの塩基配列の解析を行
い、変異が導入されていることを確認した。本プラスミ
ドを有する大腸菌(JM109(pSFR426))は、平成１２年１１
月１０日付けで次のように寄託した。
変異マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素
の構築 実施例７で構築した pSFR416をMluI、BglIIの2つの制限
酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動
を行い、約1.3kbp のバンドを切り出し、Sephaglas Ban
dPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、
回収した。次いで、実施例４で構築したpSFR412をBglI
I、BsrBRIの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿
後、アガロース電気泳動を行い、約0.4kbpのバンドを切
り出し、Sephaglas BandPrep（Amersham Pharmacia Bio
tech製）により精製、回収した。さらに実施例１０で構
築した pSFR419をMluI、BsrBRIの2つの制限酵素で消化
し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、約
4.7kbpのバンドを切り出し、Sephaglas BandPrep（Amer
sham Pharmacia Biotech製）により精製、回収した。両
DNA断片を等molずつ混合し、T4 DNAリガーゼで連結し、
C6A、C146S、C256V変異の導入されたギ酸脱水素酵素と
カルボニル還元酵素を同時に発現可能なプラスミドpSFR
426を得た。得られたプラスミドの塩基配列の解析を行
い、変異が導入されていることを確認した。本プラスミ
ドを有する大腸菌(JM109(pSFR426))は、平成１２年１１
月１０日付けで次のように寄託した。
【００９１】寄託機関の名称・あて名 名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託
センター（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所） あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第
６ （郵便番号305-8566） 寄託日 平成１２年１１月１０日 受託番号 生命研菌寄第１８１１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１８１１７）
センター（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所） あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第
６ （郵便番号305-8566） 寄託日 平成１２年１１月１０日 受託番号 生命研菌寄第１８１１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１８１１７）
【００９２】［実施例１８］ C6A、C146A、C256V変異
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構
築 実施例１５で得られたプラスミド pSFR426をもとにし
て、マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の
146位をAlaへ変えるためのプライマーとして、MCF-427F
（配列番号：２６）、MCF-427R（配列番号：２７）を合
成した。
マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の構
築 実施例１５で得られたプラスミド pSFR426をもとにし
て、マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の
146位をAlaへ変えるためのプライマーとして、MCF-427F
（配列番号：２６）、MCF-427R（配列番号：２７）を合
成した。
【００９３】MCF-427F（配列番号：２６） GAAGTCACCTACGCTAACTCGATCAGC MCF-427R（配列番号：２７） GCTGATCGAGTTAGCGTAGGTGACTTC
【００９４】プラスミドpSFR426を鋳型として、プライ
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、MCF-427R（配列番号：
２７）のセットおよびプライマーMCF-427F（配列番号：
２６）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 60秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列番号：
７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PCR（94
℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 60秒、25サイクル）を行
った。得られたPCR増幅断片をBglII、XbaI の2つの制限
酵素で二重消化した。pSFR426を BglII、XbaI の2つの
制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片
をT4 DNA リガーゼで連結し、C6A、C146A、C256Vの変異
の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同
時に発現可能なプラスミドpSFR427 を得た。得られたプ
ラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されてい
ることを確認した。
マーMCF-ATG3（配列番号：７）、MCF-427R（配列番号：
２７）のセットおよびプライマーMCF-427F（配列番号：
２６）、MCF-TAA3（配列番号：４）のセットにより1st
PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 60秒、25サイク
ル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断
片を希釈、混合し、プライマー MCF-ATG3（配列番号：
７）、MCF-TAA3（配列番号：４）を加え、2nd PCR（94
℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 60秒、25サイクル）を行
った。得られたPCR増幅断片をBglII、XbaI の2つの制限
酵素で二重消化した。pSFR426を BglII、XbaI の2つの
制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片
をT4 DNA リガーゼで連結し、C6A、C146A、C256Vの変異
の導入されたギ酸脱水素酵素とカルボニル還元酵素を同
時に発現可能なプラスミドpSFR427 を得た。得られたプ
ラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されてい
ることを確認した。
【００９５】［実施例１９］ マイコバクテリウム バ
ッカエ由来ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエ
スチュアリ由来のカルボニル還元酵素の大腸菌における
同時発現 実施例２から１８で構築したマイコバクテリウム バッ
カエ由来ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエス
チュアリ由来のカルボニル還元酵素を共発現するプラス
ミドにより、大腸菌W3110株を形質転換した。それぞれ
の組換え大腸菌を液体培地（1% バクトトリプトン、0.5
% バクト-酵母エキス、1.0% 塩化ナトリウム、以下LB培
地）に植菌し、30℃で終夜培養した後、イソプロピルチ
オ-β-ガラクトピラノシド（以下、IPTG）を添加し、さ
らに培養した。菌体を遠心分離により集菌後、0.02% 2-
メルカプトエタノール、10mM エチレンジアミンテトラ
四酢酸二ナトリウムを含む 100mM リン酸カリウム緩衝
液（pH 7.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200T
M（コスモバイオ製）を用いて3分間処理することで、菌
体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌
体抽出液として回収、ギ酸脱水素酵素活性、４−クロロ
アセト酢酸エチル還元活性を測定した。タンパク質量の
測定は、Bio-Rad Protein Assay Kit（Bio-Rad 製）を
用いて測定した。標準タンパク質としては、Bovine Pla
sma Albuminを用いた。各組換え大腸菌から得た粗酵素
液の酵素活性を表１に示した。
ッカエ由来ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエ
スチュアリ由来のカルボニル還元酵素の大腸菌における
同時発現 実施例２から１８で構築したマイコバクテリウム バッ
カエ由来ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエス
チュアリ由来のカルボニル還元酵素を共発現するプラス
ミドにより、大腸菌W3110株を形質転換した。それぞれ
の組換え大腸菌を液体培地（1% バクトトリプトン、0.5
% バクト-酵母エキス、1.0% 塩化ナトリウム、以下LB培
地）に植菌し、30℃で終夜培養した後、イソプロピルチ
オ-β-ガラクトピラノシド（以下、IPTG）を添加し、さ
らに培養した。菌体を遠心分離により集菌後、0.02% 2-
メルカプトエタノール、10mM エチレンジアミンテトラ
四酢酸二ナトリウムを含む 100mM リン酸カリウム緩衝
液（pH 7.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200T
M（コスモバイオ製）を用いて3分間処理することで、菌
体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌
体抽出液として回収、ギ酸脱水素酵素活性、４−クロロ
アセト酢酸エチル還元活性を測定した。タンパク質量の
測定は、Bio-Rad Protein Assay Kit（Bio-Rad 製）を
用いて測定した。標準タンパク質としては、Bovine Pla
sma Albuminを用いた。各組換え大腸菌から得た粗酵素
液の酵素活性を表１に示した。
【００９６】
【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ U/mg-protein ──────── プラスミド 6-Cys 146-Cys 256-Cys FDH ECAA-R ─────────────────────────── pSFR415 Cys Cys [Cys] 1.46 1.99 pSFR412 *Ser* *Ser* *Ser* 0.127 2.15 pSFR416 #Ala# Cys *Ser* 0.751 1.85 pSFR417 =Val= Cys *Ser* 0.659 1.56 pSFR418 *Ser* Cys #Ala# 0.193 1.35 pSFR419 *Ser* Cys =Val= 0.258 1.18 pSFR420 Cys *Ser* [Cys] 1.22 2.68 pSFR421 Cys Cys *Ser* 1.40 2.61 pSFR422 Cys *Ser* *Ser* 0.960 4.35 pSFR423 Cys Cys =Val= 1.47 2.08 pSFR424 Cys *Ser* =Val= 0.967 2.13 pSFR425 #Ala# Cys =Val= 1.16 2.05 pSFR426 #Ala# *Ser* =Val= 0.716 1.66 pSFR427 #Ala# #Ala# =Val= 0.311 1.51 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００９７】クライベロマイセス アエスチュアリ由来
カルボニル還元酵素の活性を ECAA-Rとして、ギ酸脱水
素酵素活性をFDHとして、表記してある。
カルボニル還元酵素の活性を ECAA-Rとして、ギ酸脱水
素酵素活性をFDHとして、表記してある。
【００９８】［実施例２０］ マイコバクテリウム バ
ッカエ由来ギ酸脱水素酵素の４−クロロアセト酢酸エチ
ル耐性の測定 ギ酸脱水素酵素の４−クロロアセト酢酸エチル耐性の測
定を、実施例１９で得られた各組換え菌のギ酸脱水素酵
素10mU、20μmol ４−クロロアセト酢酸エチル、100mM
リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）およびタンパク質量が
100μgになるようにBovine albumin（Fraction V、Sigm
a製）を含む溶液中で25℃、20分保持後、2.5μmol NAD
+、100μmol ギ酸ナトリウムを加え、340nmの吸光度の
変化量を測定することで行った。対照実験としては、4-
クロロアセト酢酸エチルを含まない条件で、25℃、20分
保持後、20μmol 4-クロロアセト酢酸エチル、2.5μmol
NAD+、100μmolギ酸ナトリウムを加え、340nmの吸光度
の変化量を測定することで行った。
ッカエ由来ギ酸脱水素酵素の４−クロロアセト酢酸エチ
ル耐性の測定 ギ酸脱水素酵素の４−クロロアセト酢酸エチル耐性の測
定を、実施例１９で得られた各組換え菌のギ酸脱水素酵
素10mU、20μmol ４−クロロアセト酢酸エチル、100mM
リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）およびタンパク質量が
100μgになるようにBovine albumin（Fraction V、Sigm
a製）を含む溶液中で25℃、20分保持後、2.5μmol NAD
+、100μmol ギ酸ナトリウムを加え、340nmの吸光度の
変化量を測定することで行った。対照実験としては、4-
クロロアセト酢酸エチルを含まない条件で、25℃、20分
保持後、20μmol 4-クロロアセト酢酸エチル、2.5μmol
NAD+、100μmolギ酸ナトリウムを加え、340nmの吸光度
の変化量を測定することで行った。
【００９９】各組換え大腸菌から得た酵素液のギ酸脱水
素酵素活性を表２に示した。20分処理後の残存活性をra
tioに示してある。256位のCysをSer、Ala、Valに変える
ことによって、４−クロロアセト酢酸エチル耐性が付与
された。
素酵素活性を表２に示した。20分処理後の残存活性をra
tioに示してある。256位のCysをSer、Ala、Valに変える
ことによって、４−クロロアセト酢酸エチル耐性が付与
された。
【０１００】
【表２】
【０１０１】［実施例２１］ マイコバクテリウム バ
ッカエ由来ギ酸脱水素酵素の酢酸エチルによる活性化の
測定 ギ酸脱水素酵素の酢酸エチルによる活性化の測定を酢酸
エチルを5%含む条件で、実施例１９で得られたギ酸脱水
素酵素の活性を測定した。各組換え大腸菌から得た酵素
液の酢酸エチル存在下での酵素活性を表３に示した。14
6位のCysをSer、Alaに変えることによって、酢酸エチル
による活性化効果が付与された。
ッカエ由来ギ酸脱水素酵素の酢酸エチルによる活性化の
測定 ギ酸脱水素酵素の酢酸エチルによる活性化の測定を酢酸
エチルを5%含む条件で、実施例１９で得られたギ酸脱水
素酵素の活性を測定した。各組換え大腸菌から得た酵素
液の酢酸エチル存在下での酵素活性を表３に示した。14
6位のCysをSer、Alaに変えることによって、酢酸エチル
による活性化効果が付与された。
【０１０２】
【表３】
【０１０３】［実施例２２］ 組換え大腸菌による
（S）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成 実施例２から１８で構築したマイコバクテリウム バッ
カエ由来ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエス
チュアリ由来のカルボニル還元酵素を共発現するプラス
ミドにより形質転換された大腸菌W3110株を液体LB培地
に植菌し、30℃で終夜培養した後、培地（2% バクトト
リプトン、1% バクト-酵母エキス、1.0%塩化ナトリウ
ム、pH 7.2）に植菌し、30℃で終夜培養後、IPTGを添加
し、さらに培養した。得られた大腸菌を集菌し、これを
用いて４−クロロアセト酢酸エチル還元反応を行った。
（S）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成 実施例２から１８で構築したマイコバクテリウム バッ
カエ由来ギ酸脱水素酵素とクライベロマイセス アエス
チュアリ由来のカルボニル還元酵素を共発現するプラス
ミドにより形質転換された大腸菌W3110株を液体LB培地
に植菌し、30℃で終夜培養した後、培地（2% バクトト
リプトン、1% バクト-酵母エキス、1.0%塩化ナトリウ
ム、pH 7.2）に植菌し、30℃で終夜培養後、IPTGを添加
し、さらに培養した。得られた大腸菌を集菌し、これを
用いて４−クロロアセト酢酸エチル還元反応を行った。
【０１０４】培養液20mLより調製した各大腸菌、500mM
リン酸カリウム緩衝液（pH 6.3）、3% 4-クロロアセト
酢酸エチル、365mMギ酸ナトリウムを含む20mLの反応液
を、攪拌下20℃で終夜反応させた。生成した4-クロロ-3
-ヒドロキシ酪酸エチルは、液相 サーモン3000 5%、担
体 クロモソルブ W（60-80mesh）AW-DMCS（Thermon 300
0 5% chromosorb W60-80（AW-DMCS）、信和加工株式会
社）を3.2mm x 2.1mガラスカラムに充填し、カラム温度
150℃で、水素炎イオン化検出器（FID）を利用したガス
クロマトグラフィーにより定量した。各組換え大腸菌に
よる（S）-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルの生成量
を表４に示した。6位のCysをSer、Ala、Val、146位のCy
sをSer、Ala、256位のCysをSer、Ala、Valに変えること
で、変換効率が高くなった。
リン酸カリウム緩衝液（pH 6.3）、3% 4-クロロアセト
酢酸エチル、365mMギ酸ナトリウムを含む20mLの反応液
を、攪拌下20℃で終夜反応させた。生成した4-クロロ-3
-ヒドロキシ酪酸エチルは、液相 サーモン3000 5%、担
体 クロモソルブ W（60-80mesh）AW-DMCS（Thermon 300
0 5% chromosorb W60-80（AW-DMCS）、信和加工株式会
社）を3.2mm x 2.1mガラスカラムに充填し、カラム温度
150℃で、水素炎イオン化検出器（FID）を利用したガス
クロマトグラフィーにより定量した。各組換え大腸菌に
よる（S）-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルの生成量
を表４に示した。6位のCysをSer、Ala、Val、146位のCy
sをSer、Ala、256位のCysをSer、Ala、Valに変えること
で、変換効率が高くなった。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
【発明の効果】本発明により、有機溶媒に耐性のある、
および／または有機溶媒によって活性化されるギ酸脱水
素酵素の変異体が提供された。本発明の酵素を利用する
ことにより、効率的に酸化型β-ニコチンアミドジヌク
レオチドから還元型β-ニコチンアミドジヌクレオチド
を製造することが可能となった。さらに、カルボニル還
元酵素によるケトンからアルコールの生産において、本
発明の酵素を用いて効果的に補酵素β-ニコチンアミド
ジヌクレオチドを酸化型から還元型に再生することによ
って、収率よくアルコールを生産することが可能となっ
た。
および／または有機溶媒によって活性化されるギ酸脱水
素酵素の変異体が提供された。本発明の酵素を利用する
ことにより、効率的に酸化型β-ニコチンアミドジヌク
レオチドから還元型β-ニコチンアミドジヌクレオチド
を製造することが可能となった。さらに、カルボニル還
元酵素によるケトンからアルコールの生産において、本
発明の酵素を用いて効果的に補酵素β-ニコチンアミド
ジヌクレオチドを酸化型から還元型に再生することによ
って、収率よくアルコールを生産することが可能となっ
た。
【０１０７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Mutant of formate dehydrogenase derived from Mycobacterium vaccae, and use thereof. <130> D1-A0011Y1 <140> <141> <150> JP 2000-363894 <151> 2000-11-29 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1206 <212> DNA <213> Mycobacterium vaccae <400> 1 atggcaaaag ttctgtgtgt tctttacgat gatccggtcg acggctaccc gaagacctat 60 gcccgcgacg atcttccgaa gatcgaccac tatccgggcg gccagatctt gccgacgccg 120 aaggccatcg acttcacgcc cgggcagttg ctcggctccg tctccggcga gctcggcctg 180 cgaccatatc tcgagtccaa cggccacacc ctggtcgtga cctccgacaa ggacggcccc 240 gactcggtgt tcgagcgcga gctggtcgat gcggatgtcg tcatctccca gcccttctgg 300 ccggcctatc tgacgcccga gcgcatcgcc aaggccaaga acctgaagct cgcgctcacc 360 gccggcatcg gttccgacca cgtcgatctt cagtcggcta tcgaccgcaa cgtcaccgtg 420 gcggaagtca cctactgcaa ctcgatcagc gtcgccgagc atgtggtgat gatgatcctg 480 tcgctggtgc gcaactatct gccctcgcac gaatgggcgc ggaagggcgg ctggaacatc 540 gccgactgcg tctcccacgc ctacgacctc gaggcgatgc atgtcggcac cgtggccgcc 600 ggccgcatcg gtctcgcggt gctgcgccgt ctggcgccgt tcgacgtgca cctgcactac 660 accgaccgtc accgcctgcc ggaatcggtc gagaaggagc tcaacctcac ctggcacgcg 720 acccgcgagg acatgtatcc ggtttgcgac gtggtgacgc tgaactgccc gctgcacccc 780 gaaaccgagc acatgatcaa tgacgagacg ctgaagctgt tcaagcgtgg cgcctacatc 840 gtcaacaccg cccgcggcaa gctgtgcgac cgcgatgccg tggcacgtgc gctcgaatcc 900 ggccggctgg ccggctatgc cggcgacgtg tggttcccgc agccggcgcc gaaggaccac 960 ccctggcgga cgatgcccta taacggcatg accccgcaca tctccggcac cacgctgacc 1020 gcgcaggcgc gttatgcggc gggcacccgc gagatcctgg agtgcttctt cgagggccgt 1080 ccgatccgcg acgaatacct catcgtgcag ggcggcgctc ttgccggcac cggcgcgcat 1140 tcctactcga agggcaatgc caccggcggt tcggaagagg ccgccaaatt caaaaaagcg 1200 gtctaa 1206 <210> 2 <211> 401 <212> PRT <213> Mycobacterium vaccae <400> 2 Met Ala Lys Val Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr 1 5 10 15 Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro 20 25 30 Gly Gly Gln Ile Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly 35 40 45 Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Pro Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Asn Gly His Thr Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Phe Glu Arg Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser 85 90 95 Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala 100 105 110 Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val 115 120 125 Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Asn Val Thr Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu 145 150 155 160 Ser Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Glu Trp Ala Arg Lys Gly 165 170 175 Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser His Ala Tyr Asp Leu Glu Ala 180 185 190 Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu 195 200 205 Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val His Leu His Tyr Thr Asp Arg His 210 215 220 Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr Trp His Ala 225 230 235 240 Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys 245 250 255 Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys 260 265 270 Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu 275 280 285 Cys Asp Arg Asp Ala Val Ala Arg Ala Leu Glu Ser Gly Arg Leu Ala 290 295 300 Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His 305 310 315 320 Pro Trp Arg Thr Met Pro Tyr Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly 325 330 335 Thr Thr Leu Thr Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile 340 345 350 Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile 355 360 365 Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys 370 375 380 Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala 385 390 395 400 Val <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 3 ctttctagag gaattcaacc atggcaaaag ttctgtgtgt tc 42 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 4 cagtctagat tagaccgctt ttttgaattt ggcg 34 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 5 taatctagag gaattcaata atggatccaa caatgacgtt tc 42 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 6 tagaagctta agctattaaa cgcaagtgta cccac 35 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 7 ctttctagag gaattcaacc atggcaaaag ttctgtctgt tc 42 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 8 gtatccggtt tgcgacgtcg tgacgctgaa ctccccgctg caccccgaa 49 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 9 ttcggggtgc agcggggagt tcagcgtcac gacgtcgcaa accggatac 49 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 10 cggaagtcac ctactcaaac tcgatcagcg tcg 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 11 cgacgctgat cgagtttgag taggtgactt ccg 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 12 gacatgtatc cggtttctga cgtcgtgacg ctg 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 13 cagcgtcacg acgtcagaaa ccggatacat gtc 33 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 14 cgagatcctg gagtcattct tcgaaggccg tccga 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 15 tcggacggcc ttcgaagaat gactccagga tctcg 35 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 16 atggcaaaag ttttagctgt tctttacgat 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 17 atcgtaaaga acagctaaaa cttttgccat 30 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 18 ggcaaatatt ctgaaatgag c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 19 tcacgacgtc gcaaaccgga 20 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 20 atggcaaaag ttttagtagt tctttacgat 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 21 atcgtaaaga actactaaaa cttttgccat 30 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 22 gtgacgctga acgctccgct gcacccc 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 23 ggggtgcagc ggagcgttca gcgtcac 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 24 gtgacgctga acgttccgct gcacccc 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 25 ggggtgcagc ggaacgttca gcgtcac 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 26 gaagtcacct acgctaactc gatcagc 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 27 gctgatcgag ttagcgtagg tgacttc 27
【図１】プラスミドpSE-MCF15の構造を示す図である。
【図２】プラスミドpSFR415の構造を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成１３年１２月３日
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所
工業技術研究所
【旧受託番号】 生命研菌寄第１８１１６号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１１ ６）、生命研菌寄第１８１１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１８
１１７）
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１１ ６）、生命研菌寄第１８１１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１８
１１７）
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所
学工業技術研究所
【新寄託番号】 生命研条寄第７３９１号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７３９１ ）、生命研条寄第７３９２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３９
２）
ＥＲＭ ＢＰ−７３９１ ）、生命研条寄第７３９２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３９
２）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｐ 7/62 9/04 19/36 Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 19/36 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 BA80 CA03 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 4B050 CC04 CC10 DD02 LL05 4B064 AD64 AF23 4B065 AA01X AA36Y AA57X AA72Y AB01 AC14 CA12 CA23 CA60
Claims (23)
- 【請求項１】 配列番号：２に記載のアミノ酸配列にお
いて、少なくとも１４６位および／または２５６位のシ
ステイン残基が、システイン以外のアミノ酸へ置換され
た変異を含む蛋白質であって、有機溶媒存在下で高いギ
酸脱水素酵素活性を有する蛋白質。 - 【請求項２】 １４６位の置換アミノ酸がセリンまたは
バリンである請求項１に記載の蛋白質。 - 【請求項３】 ２５６位の置換アミノ酸が、セリン、ア
ラニン、またはバリンのいずれかのアミノ酸である請求
項１に記載の蛋白質。 - 【請求項４】 配列番号：２に記載のアミノ酸配列にお
いて、少なくとも１４６位および２５６位のシステイン
残基が、システイン以外のアミノ酸へ置換された変異を
含む請求項１に記載の蛋白質。 - 【請求項５】 １４６位の置換アミノ酸がセリンまたは
バリンであり、２５６位の置換アミノ酸がセリン、アラ
ニン、またはバリンのいずれかのアミノ酸である請求項
４に記載の蛋白質。 - 【請求項６】 配列番号：２に記載のアミノ酸配列にお
いて、更に６位のシステイン残基がシステイン以外のア
ミノ酸へ置換された変異を含む、請求項１に記載の蛋白
質。 - 【請求項７】 ６位の置換アミノ酸が、セリン、アラニ
ン、またはバリンのいずれかのアミノ酸である、請求項
６に記載の蛋白質。 - 【請求項８】配列番号：２に記載のアミノ酸配列におい
て、下記（１）〜（１３）からなる群から選択されたい
ずれかの変異を有するアミノ酸配列からなる蛋白質。 （１）６位、１４６位、および２５６位のシステイン残
基が共にセリンに置換されたアミノ酸配列、 （２）６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位の
システイン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸
配列、 （３）６位のシステイン残基がバリンに、２５６位のシ
ステイン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配
列、 （４）６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシ
ステイン残基がアラニンにそれぞれ置換されたアミノ酸
配列、 （５）６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシ
ステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配
列、 （６）１４６位のシステイン残基がセリンに置換された
アミノ酸配列、 （７）２５６位のシステイン残基がセリンに置換された
アミノ酸配列、 （８）１４６位および２５６位のシステイン残基が共に
セリンに置換されたアミノ酸配列、 （９）２５６位のシステイン残基がバリンに置換された
アミノ酸配列、 （１０）１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６
位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミ
ノ酸配列、 （１１）６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位
のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ
酸配列、 （１２）６位のシステイン残基がアラニンに、１４６位
のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残
基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、 （１３）６位および１４６位のシステイン残基がアラニ
ンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置
換されたアミノ酸配列、 - 【請求項９】 請求項１または請求項８に記載の蛋白質
をコードするDNA。 - 【請求項１０】 請求項９に記載のDNAが挿入されたベ
クター。 - 【請求項１１】 更に還元酵素をコードするDNAが挿入
された請求項１０に記載のベクター。 - 【請求項１２】 還元酵素がクライベロマイセス アエ
スチュアリ（Kluyberomyces aestuarii）に由来するカ
ルボニル還元酵素である請求項１１に記載のベクター。 - 【請求項１３】 請求項１０に記載のベクターを保持す
る形質転換体。 - 【請求項１４】 宿主細胞が微生物である請求項１３に
記載の形質転換体。 - 【請求項１５】 請求項１３に記載の形質転換体を培養
する工程を含む、請求項１または請求項８に記載の蛋白
質を製造する方法。 - 【請求項１６】 請求項１１に記載のベクターを保持す
る形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または請
求項８に記載の蛋白質、および還元酵素を製造する方
法。 - 【請求項１７】 還元酵素が、クライベロマイセス ア
エスチュアリ由来カルボニル還元酵素である請求項１６
に記載の方法。 - 【請求項１８】 下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかを
酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに接
触させる工程を含む、酸化型β-ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドから還元型β-ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドを製造する方法。 （ａ）請求項１または請求項８に記載の蛋白質、（ｂ）
請求項１０に記載の形質転換体、および（ｃ）（ｂ）に
記載の形質転換体の処理物 - 【請求項１９】 次の工程を含む酸化型基質から該基質
の還元型生成物を製造する方法。 （１）請求項１８に記載の方法によって還元型β-ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドを製造する工程、お
よび（２）工程（１）の還元型β-ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド、酸化型基質、および還元型β-ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で前記酸
化型基質から還元型生成物を生成し得る還元酵素とを接
触させ、生成する還元型生成物を回収する工程 - 【請求項２０】 酸化型基質がケトンであり、該基質の
還元型生成物がアルコールである請求項１９に記載の方
法。 - 【請求項２１】 ケトンが４−ハロアセト酢酸エステル
であり、アルコールが（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキ
シ酪酸エステルである請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 還元酵素がクライベロマイセス アエ
スチュアリ由来カルボニル還元酵素である請求項１９に
記載の方法。 - 【請求項２３】 還元酵素が、請求項１６に記載の方法
によって製造されたものである請求項１９に記載の方
法。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (1)
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7432095B2 (en) | 2001-10-09 | 2008-10-07 | Kaneka Corporation | Formate dehydrogenase tolerant to halogen compounds and process for producing the same |
| WO2012169341A1 (ja) * | 2011-06-08 | 2012-12-13 | 株式会社ダイセル | ギ酸脱水素酵素の変異体、およびその用途 |
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| JPWO2013176157A1 (ja) * | 2012-05-22 | 2016-01-14 | 株式会社ダイセル | ギ酸脱水素酵素変異体、およびその用途 |
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