JP5030067B2 - 新規アルカンポリオール脱水素酵素 - Google Patents
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Description
脱水素酵素を用いて、(R)−2,3−ブタンジオールを製造する方法が記載されている。
ンシスHansenula ofunaensis)由来のタンパク質が、アルカンポリオールに対し、優れた活性を有することを見出し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
(1)配列表の配列番号1に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質;
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換されているアミノ酸配列を有し、かつ、アルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質;
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列によって表され、かつ、アルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換されているアミノ酸配列を有し、かつ、アルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(c)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)配列表の配列番号2に記載される塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(e)配列表の配列番号2に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
本発明は、下記(1)〜(3)のいずれかに記載されるタンパク質を提供する:
(1)配列表の配列番号1に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質;
(2)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を有し、かつ、アルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質;
(3)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列によって表され、かつ、アルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質。
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、対応するアルコールを生成する。酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてアルコールを酸化し、対応するケトンを生成する。
酸化反応の補酵素として酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。還元反応の補酵素として還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。
ヒドロキシ-2-オクタノンを生成する。
100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)中に、種々の濃度の基質、0.2mMNADH、及び酵素を含む反応液を25℃で反応させ、NADHの減少に伴う340nmの吸光度(分子吸光係数6,220M-1・cm-1)の変化を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量と定義する。
100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)中に、種々の濃度の基質、2mMNAD+、及び酵素を含む反応液を25℃で反応させ、NADHの生成に伴う340nmの吸光度(分子吸光係数6,220M-1・cm-1)の変化を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量と定義する。
セトール、2,3-ペンタンジオン、2,3-ヘキサンジオン、3,4-ヘキサンジオンのようなケトンに対し、優れた還元活性を有し、特に炭素数5以上、更には6以上のケトンに対し、優れた活性を有する。
本発明のタンパク質の分子量は、常法に従って、測定することができ、例えば、SDS−PAGEや、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法で測定することができる。
上記のような性質を有するタンパク質としては、例えば、メタノール資化性酵母ピキア・オフナエンシス(Pichia ofunaensis、旧名ハンゼヌラ・オフナエンシスHansenula ofunaensis)由来のタンパク質を挙げることができる。
ア・オフナエンシスAKU4328などを挙げることができる。
コア配列の5’−及び3’−周辺領域の塩基配列を、染色体DNAを制限酵素により消化した後、解析する。すなわち、5’−及び3’−周辺領域の塩基配列を、5’−及び/または3’−周辺領域をPCR法によりクローニングする当業者に周知の方法、例えば、TAKARA LA PCR in vitro Cloning Kit (タカラバイオ製)の方法を用いて決定する。より詳しくは、染色体DNAを制限酵素により消化した断片に、その制限酵素切断末端を持つプライマーカセットを連結したものを鋳型とし、コア領域に含まれる塩基配列から作成したプライマーおよびプライマーカセット内の配列からなるプライマーを用いてPCRを行い、(必要によりさらに内側のプライマーセットにより再度PCRを行い)、得られた断片を解析することにより5’−及び/または3’−側の塩基配列を得る方法である。;
得られた配列をコア領域の配列とアッセンブルして、酵素の全塩基配列を決定する;
決定した塩基配列を基に、酵素のオープンリーディングフレーム(ORF)のみを特異的に増幅可能なプライマーを合成し、大腸菌における発現ベクターpSE420D (特開2000-189170号公報参照)に挿入し、発現プラスミドpSE-HOGを構築する;
当該発現プラスミドを大腸菌に導入し、得られる形質転換体を適当な培地で培養し、発現産物を回収することにより、本発明のタンパク質を得ることができる。
本発明は、以下の(a)〜(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列からなり、かつ、アルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(c)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)配列表の配列番号2に記載される塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(e)配列表の配列番号2に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつアルカンポリオール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
記載中の任意の少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、例えば40、60または100個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Biosciences社製)を用いて、マニュアルに記載の条件(例えば、wash:42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer)において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターを含む形質転換体を提供する。
・エシェリヒア(Escherichia)属
・バチルス(Bacillus)属
・シュードモナス(Pseudomonas)属
・セラチア(Serratia)属
・ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
・コリネバクテリウム(Corynebacterium)属
・ストレプトコッカス(Streptococcus)属
・ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
・ロドコッカス(Rhodococcus)属
・ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
・サッカロマイセス(Saccharomyces)属
・クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
・シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
・チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
・ヤロウイア(Yarrowia)属
・トリコスポロン(Trichosporon)属
・ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
・ピキア(Pichia)属
・キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
・ノイロスポラ(Neurospora)属
・アスペルギルス(Aspergillus)属
・セファロスポリウム(Cephalosporium)属
・トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
また、発現ベクターの種類は、宿主との組合せ等を考慮し、公知のものから適宜選択することができる。
が利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター及び/又はターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ遺伝子)、npr(中性プロテアーゼ遺伝子)、amy(α−アミラーゼ遺伝子)などが利用できる。
大腸菌で利用されているものが利用可能である。
、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド(EP 537456など)などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である(Mol. Cell. Biol., 6, 80 (1986))。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる(EMBO J., 6, 729 (1987))。
ウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3(Nucleic Acids Res., 13, 4267 (1985)
)などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素)のプロモーター(Agri. Biol. Chem., 54, 2521 (1990))などが利用可能である。
tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ(Agri. Biol. Chem., 51, 1587 (1987))、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている(特開平 08-173170)。
究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である(Trends in Biotechnology, 7, 283-287 (1989))。
本発明によれば、本発明のタンパク質を、ケトンに作用させて、アルコールを製造する方法が提供される。
通常0.01〜10 unit/ml、好ましくは0.1〜5 unit/ml程度である。
本発明によれば、本発明のタンパク質を、アルコールに作用させて、ケトンを製造する方法が提供される。
通常0.01〜10 unit/ml、好ましくは0.1〜5 unit/ml程度である。
本発明のタンパク質、換言するとアルカンポリオール脱水素酵素は、隣接する水酸基を有するアルコールに対して、特に高い酸化活性を示す。隣接する水酸基を有するアルコールには、光学活性アルコールに該当するものが多く含まれるが、本発明のタンパク質は特にR配置の水酸基に対し、優先的に反応する。
本発明によれば、本発明のタンパク質をプロキラルなケトンに作用させる工程を有する光学活性アルコールの製造方法が提供される。
ン、アセトール、2,3-ペンタンジオン、2,3-ヘキサンジオン、3,4-ヘキサンジオンなどを挙げることができる。
R1―C(=O)−R2
ケトン体は、低級アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、アルコキシ基で置換されても良い。尚、本明細書では、ケトンをケトン体とも称する。
通常0.01〜10 unit/ml、好ましくは0.1〜5 unit/ml程度である。
本発明によれば、本発明のタンパク質を、ラセミ体アルコールに作用させて、立体的酸化により、光学活性アルコールを製造する方法が提供される。
通常0.01〜10 unit/ml、好ましくは0.1〜5 unit/ml程度である。
上記(6−1)又は(6−2)に記載の方法には、光学活性アルコールの精製工程を適宜含めることができる。
ここで、光学純度とは、下記の方法により求めた数値を意味する。
光学純度=(R−S/R+S)または(S−R/R+S)×100(%)
(R、Sはそれぞれ試料中にしめる右形および左形鏡像体の割合を示す。)
7.グリセロールからの有用物質の製造方法
本発明のタンパク質、換言するとアルカンポリオール脱水素酵素は、グリセロールの脱水素酵素としても優れている。
通常0.01〜10 unit/ml、好ましくは0.1〜5 unit/ml程度である。
ンゴ酸、更にはアスパラギン酸などが含まれる。
1−1:ピキア・オフナエンシスの培養
ピキア・オフナエンシスAKU4328(京都大学から分譲)を、1%グルコースを含む基本培地A−5mL10本に植菌し、30℃で対数中期まで培養した。得られた菌を1%グリセロールを含む基本培地A−500mL10本に植菌し、30℃で対数中期まで培養した。培養液を遠心分離し、酵素精製用菌体として利用した。
精製工程は断りの無い限り、すべて4℃で行った。上記1−1により調製した菌体(湿菌体重量として20g)を、緩衝液A(100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)及び1mMジチオスレイトール(以下、DTTと略す))に懸濁し、100mlのガラスビーズ
と混合し、Bead-Beater(Biospec社製、Bartlesville, USA)により破砕した。
精製されたタンパク質(以下、「アルカンポリオール脱水素酵素」とも称する)のサブユニットの分子量を12.5%ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で求めた結果、約39,000であった。
2−1.N末端及び内部アミノ酸配列の解析
実施例1で得られた精製酵素のN末端及びV8プロテアーゼによる消化を受けたペプチド断片について、プロテインシーケンサー(ABI Prism 310 genetic analyzer、アプライド・バイオシステムズ社製)と反応液キット(Dye-teminator cycle sequencing kit)を用いてアミノ酸配列を決定した。
MKGLLYYKTGDIRYSEDVEE(配列番号3)
と決定された。
ILSSHDVKIR(配列番号4)、
ATTHLSDA(配列番号5)、及び
LKALLPENGGFDA(配列番号6)
と決定され、このことにより、精製酵素の3つの内部アミノ酸配列が決定された。
ピキア・オフナエンシスAKU4328を1%メタノールを含む基本培地Aで培養した。染
色体DNAの精製は、Meth. Cell Biol,. 29, 39-44 (1975) に記載の方法により行った。
5'-TAYTAYAARACNGGNGAYAT-3'(配列番号7)
プライマー2
5'-GCRTCRAANCCNCCRTTYTC-3'(配列番号8)
プライマー1は、N末端配列MKGLLYYKTGDIRYSEDVEEにおいて6番目のYから12番目のIに対応する。
遺伝子コア領域の5'-隣接領域のクローニングは、TAKARA LA PCR in vitro Cloning Kit (タカラバイオ製)を用いて行った。
PCRは以下の条件で行った。
プライマーS1
5’-ATCACCAGGTTTCACCCTAGTGAC-3’(配列番号9)。
コア領域の3’-隣接領域のクローニングは、5’−隣接領域と同様に、TAKARA LA PCR in vitro Cloning Kit (タカラバイオ製)を用いて行った。
プライマーS2 5'-GGAATGCGCGAAGTTTAAACCAGG -3'(配列番号10)。
上記2−4及び2−5で得られた塩基配列と上記2−3で得られたコア領域の塩基配列をアッセンブルした結果、アルカンポリオール脱水素酵素の全オープンリーディングフレーム(ORF)が明らかになった。
3−1:発現プラスミドpSE-HOGの構築
PCRプライマーとして、HOG-ATG1及びHOG-TAG1を合成し、下記の条件でPCRを行った。
HOG-ATG1の配列を以下に示す。
5´-GGAATTCTATAATGAAAGGATTGCTCTATT-3´(配列番号11)
また、HOG-TAG1の配列を以下に示す。
5´-GGACTAGTCTACACTTCATCAGGAGTAACA-3´(配列番号12)
染色体DNA50ng、各プライマー25pmol、dNTP各20nmol、EXTaq(タカラバイオ製)1.25U、ExTaq用緩衝液を含む50μLの反応液を用い、94℃10分の熱処理後、94℃1分、58℃1分、72℃1分を30サイクル行った。
pSE-HOGを含有する大腸菌HB101株を、アンピシリンを含むLB培地で培養し600nmにおける吸光度が0.5の時、0.1 mM IPTGを添加し6時間後、遠心分離により集菌した。
4−1:活性測定試験
実施例1で得られたアルカンポリオール脱水素酵素を用いて、以下の方法で酵素活性を測定した。
100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)中に、表2に記載の濃度の基質、2mMNAD+、及び酵素を含む反応液を25℃で反応させ、NADHの生成に伴う340nmの吸光度(分子吸光係数6,220M-1・cm-1)の変化を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量と定義する。
100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)中に、表3に記載の濃度の基質、0.2mMNADH、及び酵素を含む反応液を25℃で反応させ、NADHの減少に伴う340nmの吸光度(分子吸光係数6,220M-1・cm-1)の変化を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量と定義する。
(酸化活性)
表2に示されるように、精製酵素は、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノール、1-ペンタノール、n-ヘキサノール、ベンジルアルコール等の一級アルコールに対して、酸化活性は示さなかった。
表3に示されるように、精製酵素は、ジヒドロキシアセトン、3-ヒドロキシ-2-ブタノ
ン、アセトール、2,3-ペンタンジオン、2,3-ヘキサンジオン、3,4-ヘキサンジオンに対し、高い還元活性を有することがわかった。
実施例1で得られた精製酵素及び実施例3で得られた形質転換体(E. coli HB101 (pSE-HOG))を用いて、本発明のタンパク質の基質特異性を調べた。比較のため、本酵素遺伝子を挿入していないプラスミド(pSE420D)を用いる以外は、E. coli HB101 (pSE-HOG)と同様に作成した形質転換体(E. coli HB101 (pSE420D))を用いた試験も行った。
実施例1で得られた精製酵素について、更に以下の性質を確認した。
精製タンパク質1mg当たり60U 以上程度の(R)-1,2-オクタンジオール脱水素酵素活性を有していた。
グリセロール酸化反応における至適pHは約9、ジヒドロキシアセトン還元反応の至適pHは約6であった。
ジヒドロキシアセトン還元反応における至適温度は40℃程度であった。
実施例3と同様な方法でpSE-HOGを含む大腸菌HB101株を得た。
像選択的酸化が起こり、(R)-1,2-オクタンジオールが1-ヒドロキシ-2-オクタノンに酸化されたことが確認された。
ピキア・オフナエンシスAKU4328を塩化アンモニウム4g/L、リン酸2水素1カリウム1g/L、リン酸1水素2カリウム1g/L、硫酸マグネシウム・7水和物0.5g/L、酵母エキス1g/Lに1%グルコースを添加した培地で前培養を行い、基本培地に1%グリセロールを含む誘導培地で本培養を開始後10時間で集菌した。グリセロールに対する比活性が3.6U/mg(蛋白)であったことから、上記実施例1で得られた精製酵素と同じタンパク質を7%発現していることが確認できた。
(7−1)精製酵素によるジヒドロキシアセトンの製造
5 ml の100 mMリン酸カリウムバッファー(pH8.0)中にNAD+を1 μmol、グリセロール50 μmol、実施例1で得られた精製酵素2 units、ピルビン酸ナトリウム50 μmol、ブタ心臓乳酸脱水素酵素(東洋紡)4 unitsを加え、35℃で30 ml容三角フラスコにおいて150 rpmの回転振とうにより12時間反応を行った。
ピキア・オフナエンシスAKU4328を塩化アンモニウム4g/L、リン酸2水素1カリウム1g/L、リン酸1水素2カリウム1g/L、硫酸マグネシウム・7水和物0.5g/L、酵母エキス1g/Lに1%グルコースを添加した培地で前培養を行い、基本培地に1%グリセロールを含む誘導培地で本培養を開始後10時間で集菌した。
グリセロールに対する比活性は3.6U/mg(蛋白)であり、菌体湿重量1kg当たり、グリセロール脱水素活性にして130万Uを得ることができた。
mMグリセロール、2.0mMNAD+、酵素溶液を含む反応液で25℃で反応させ、NADHの生成に伴う340nmの吸光度(分子吸光係数6,220M-1・cm-1)の変化を測定した。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量と定義する。
Claims (13)
- 配列表の配列番号1に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 下記(a)又は(d)に記載されるポリヌクレオチド:
(a)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)配列表の配列番号2に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド。 - 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項3に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項1に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項1に記載のタンパク質を、1,2−ペンタンジオール、1,2−ヘキサンジオール、1,2−ヘプタンジオール又は1,2−オクタンジオールであって、R配置の水酸基を有するアルコールに作用させる工程を有するケトンの製造方法。
- 請求項1に記載のタンパク質を(R)−1,2−オクタンジオールに作用させる工程を有する1−ヒドロキシ−2−オクタノンの製造方法。
- 請求項1に記載のタンパク質を1,2−ペンタンジオール、1,2−ヘキサンジオール、1,2−ヘプタンジオール又は1,2−オクタンジオールのラセミ体に作用させる工程、及び、R体のアルコールが脱水素されて生成するケトンを分離する工程を有する光学活性アルコールの製造方法。
- 請求項1に記載のタンパク質を1,2−オクタンジオールのラセミ体に作用させる工程、及び、生成する1−ヒドロキシ−2−オクタノンを分離する工程を有する光学活性アルコールの製造方法。
- グリセロールに、請求項1に記載のタンパク質を作用させる工程を有するジヒドロキシアセトン又はその誘導体の製造方法。
- 1,2−ペンタンジオール、1,2−ヘキサンジオール、1,2−ヘプタンジオール又は1,2−オクタンジオールであって、R配置の水酸基を有するアルコールを酸化してケトンを製造するための請求項1に記載のタンパク質の使用。
- (R)−1,2−オクタンジオールを酸化して1−ヒドロキシ−2−オクタノンを製造するための請求項1に記載のタンパク質の使用。
- 1,2−オクタンジオールのラセミ体における(R)−1,2−オクタンジオールを酸化して光学活性アルコールを製造するための請求項1に記載のタンパク質の使用。
- グリセロールを酸化してジヒドロキシアセトンを製造するための請求項1に記載のタンパク質の使用。
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