CN116904410A - 热稳定性提升的fdh突变体及其参与的辅酶再生系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提升的FDH突变体及其参与的辅酶再生系统，本发明利用力文所开发的基于深度学习算法的蛋白质设计平台‑Lésign对野生型甲酸脱氢酶的序列进行改进，并进行生物实验验证，AI计算结果和生物实验结果表明，得到的突变体的热稳定性优于野生型。特别是本发明进一步限定的组合突变得到的突变体的人稳定性表现得较为优异，在60℃孵育90min后的剩余酶活基本上能达到野生型的250％。上述突变体参与的NAD+‑NADH反应体系可以在较高温度下反应，该反应体系的催化效率可以明显提高，适于工业推广。

Description

热稳定性提升的FDH突变体及其参与的辅酶再生系统
技术领域
本发明涉及生物工程领域，更具体的是涉及一种热稳定性提升的FDH突变体及其参与的辅酶再生系统。
背景技术
甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH，EC1.2.1.2)广泛存在于微生物和高等植物中，且分布在所有的甲基营养型微生物中，其中甲基营养型Pseudomonas sp.101是迄今为止稳定性最高的野生型甲酸脱氢酶。该酶在生物法转化氨基酸生产中常用于还原型辅酶NADH的循环再生，能够以甲酸盐和氧化型辅酶NAD+为底物转移氢的同时生成反应所需的还原力，并且副产物CO2容易被排出，对转化体系的pH影响小，因此被认为是合成光学活性化合物中NADH再生的最佳酶之一，广泛用于食品、制药和化学工业。
但是，野生型甲酸脱氢酶普遍存在酶活性低、催化效率差、在微生物中表达的蛋白可溶性较差的问题，且甲酸脱氢酶蛋白结构的较高柔性决定了野生型甲酸脱氢酶在生产所需的温度条件下容易变性失活，导致产品转化率低，影响产品的工业生产。一般而言，反应温度每提高10℃，反应速率会变为原水平的两倍；酶的热稳定性越强，则越是能够在较长的时间内维持高反应速率，从而提高相应的时空产率或者减少反应过程中所需的酶量，最终降低生产成本。因此，如何提高甲酸脱氢酶的热稳定性是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种热稳定性均优于野生型的甲酸脱氢酶突变体。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：热稳定性提升的FDH突变体，其野生型序列如SEQ ID NO.1所示。该野生型甲酸脱氢酶来源于基因文库Uniport：P33160。对上述野生型甲酸脱氢酶选自以下至少一个氨基酸位点进行取代突变：D29E、Q49E、Y63F、N67R、D81N、V89P、D92E、L119I、Y246V、H264N、I266V、L271I、K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N、A373Q，得到甲酸脱氢酶突变体。
作为优选，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列至少选自以下突变集进行取代突变：
D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
作为优选，在没有A211K、T240S、V294I突变，S228A、A239Q、R241W不同时存在时，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：
D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N/A373Q，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
作为优选，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个突变集进行取代突变：
D29E/H29R/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、
D29E/H29R/L36T/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、
D29E/H29R/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/S131A/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
本发明的目的之二在于提供一种能够表达上述甲酸脱氢酶突变体的DNA或RNA。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种甲酸脱氢酶重组基因，能够表达上述甲酸脱氢酶突变体的DNA或RNA。
本发明的目的之三在于提供一种包括上述能够表达热稳定性更优的甲酸脱氢酶突变体的DNA的重组质粒。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种甲酸脱氢酶重组质粒，包括上述甲酸脱氢酶重组基因。
本发明的目的之四在于提供一种能够表达热稳定性更优的甲酸脱氢酶突变体的重组细胞。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种甲酸脱氢酶重组细胞，包括如上述甲酸脱氢酶重组质粒。
作为优选，底盘细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、芽孢杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、梭菌、链霉菌、葡萄球菌、奈瑟菌、志贺氏菌中的一种。
本发明的目的之五在于提供一种热稳定性更优的甲酸脱氢酶突变体参与的NAD+-NADH反应，为主酶反应体系提供NADH或仅用于生产NADH产品。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种辅酶再生系统，包括上述甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体参与NAD+-NADH反应。
作为优选，甲酸脱氢酶重组细胞，所述甲酸脱氢酶重组细胞参与NAD+-NADH反应。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明对野生型甲酸脱氢酶的序列进行改进，并进行生物实验验证，AI计算结果和生物实验结果表明，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下至少一个突变进行取代突变：D29E、Q49E、Y63F、N67R、D81N、V89P、D92E、L119I、Y246V、H264N、I266V、L271I、K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N、A373Q，得到的突变体的热稳定性优于野生型。特别是，在没有A211K、T240S、V294I突变，S228A、A239Q、R241W不同时存在时，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：
D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N/A373Q，得到的突变体的热稳定性较为优异，在60℃孵育90min后的剩余酶活基本上能达到野生型的250％。上述突变体参与的NAD+-NADH反应体系可以在较高温度下反应，该反应体系的催化效率可以明显提高，适于工业推广。
附图说明
图1为NADH溶液浓度-A340的吸光度的标准曲线图；
具体实施方式
DNA构建体，是指能表达出本发明的甲酸脱氢酶及甲酸脱氢酶突变体的序列。通常，DNA构建体通过PCR或本领域已知的其他合适技术在体外合成。在某些实施方案中，DNA构建体还包括其他附件元件，如控制元件(如启动子等)。DNA构建体还可以包括标记物质(如荧光等)。DNA构建体还可以包括不影响目的基因表达的其他序列。
术语“表达”是指DNA转录成信使RNA(mRNA)，然后翻译成蛋白质的过程。
“表达载体”具有在宿主细胞中掺入和表达异源多核酸片段的能力。许多原核和真核表达载体是市售的。选择合适的表达载体在技术人员的知识范围内。
术语“宿主细胞”是指用于表达包含本发明DNA的合适宿主载体。宿主可以包含任何能够包含和表达本文所公开的核酸或基因的生物体，但不限于此。宿主可以是原核生物或真核生物，单细胞或多细胞，包括哺乳动物细胞、植物细胞、真菌等。单细胞宿主的例子包括埃希氏菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、梭菌、链霉菌、葡萄球菌、奈瑟菌、乳酸杆菌、志贺氏菌和支原体的细胞。合适的大肠杆菌菌株(包括许多其他菌株)包括BL21(DE3)，C600，DH5αF′，1113101，JM83，JM101，JM103，JM105，JM107，JM109，JM110，MC1061，MC4100，MM294，NM522，NM554，TGI，χ1776，XL1-Blue和Y1089+，所有这些都是市售的。
术语“同一性”，意味着两个序列中的残基在比对最大对应时是相同的，如使用诸如本文描述的那些序列比较或分析算法测量的那样。例如，如果在正确对齐时，两个序列的相应片段在10个位置中的5个位置具有相同的残基，则说这两个序列具有50％的同一性。大多数生物信息学程序报告了比对序列区域的百分比同一性，这些区域通常不是整个分子。如果对齐足够长并且包含足够多的相同残基，则可以计算期望值，这表明对齐中的同一级别不太可能随机发生。
下面结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
蛋白质是生命的物质基础，是组成人体细胞、组织的重要成分。人体中所有重要的组成部分都需要蛋白质的参与，它在细胞和生物体的生命活动过程中起着十分重要的作用。可以说，没有蛋白质就没有生命。人体中的蛋白质种类非常多，功能也各不相同，有的构成人体组织、有的能提供能量、有的可以参与物质代谢和转运、有的促进生长发育、调节免疫功能。不同的蛋白质承担起了不同的职责和作用，其功能是由蛋白质的结构所决定的。而蛋白质的3D结构又是由蛋白质氨基酸序列决定。因此，蛋白质的设计依赖于结构和序列的对应关系，需要设计特定功能的蛋白质，就需要设计符合该功能结构的序列。了解和设计蛋白质对推动生物和医药的创新进步具有重要的意义。
针对某个特定功能来设计蛋白质序列是一项十分困难的工作，设计的序列最后呈现什么结构、什么功能是难以预料的。而且固定长度的蛋白质序列的样本空间也十分庞大。为了完成上述工作，力文所开发了一个基于深度学习算法的蛋白质设计平台---Lésign。该平台融合了目前最先进的蛋白质设计方法，实现了蛋白质结构预测、序列设计以及结果评价等功能。各个功能模块之间通过接口进行协作，形成了预测、设计、评价为一体的计算管线。结构预测模块以序列、共进化信息MSA以及数据库搜索的模板结构作为输入，预测该序列的蛋白质结构，并输出结构可信度，这类模型的代表有AlphaFold2和RosettaFold。序列设计模块有多种方式，一种是以某个结构作为输入，然后预测序列，该模型也可以用于结构的评价，如ESM-if1和ProteinMPNN；另一种方式是通过初始化序列，用结构预测模型去预测结构，与真实结构对比计算误差，通过误差梯度反传优化初始序列直到结构误差收敛，如AFDesign。也有应用蛋白质语言模型，用masked的序列采样生成完整序列。将这些模块进行组合，可以衍生出从序列到结构、从结构到序列、从序列到序列、从结构到结构的多种蛋白质设计和评价方法。
利用Lésign平台，对野生型甲酸脱氢酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行序列设计，最终得到了计算层面上最优的酶变体。
DNA构建体的构建：
目的基因的核苷酸序列均由北京擎科生物科技有限公司合成，并将这些核苷酸序列插入到表达载体中。具体地，插入到质粒pET28a(+)中从而获得相对应的质粒。随后将合成的质粒转入宿主细胞(E.coli BL21(DE3))中,由此构建了含有不同质粒的大肠杆菌菌株。
甲酸脱氢酶的表达与纯化：
取3μL重组菌在LB固体培养基上划线，置于37℃培养箱过夜培养。挑取过夜培养的单菌落接种于新鲜LB培养基中，在37℃，200rpm摇床震荡至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在16℃，200rpm条件下诱导表达16h。
其中，LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2％。
离心收集细胞，用裂解缓冲液重悬菌体。超声破碎，分离上清和沉淀。用0.45μm滤器进行过滤，取滤液置于冰上。使用NTA-20,NTA-80，NTA-100依次洗脱杂蛋白，然后用NTA-200洗脱目的蛋白。之后，将NTA-200洗脱下来的目的蛋白加入到干净的超滤管中，3000g离心10min，每次用1mL抢轻吹混匀。重复2-3次，待NTA-200洗脱液剩余1-1.5mL时，加入预冷的0.1MPB15mL，4℃3000g离心10min。液体剩余1-2mL时，用A280粗测蛋白浓度，之后用BCA试剂盒测定蛋白浓度并分装保存于-80℃冰箱。
酶活测定方法：将100μL浓度为25μg/ml的甲酸脱氢酶溶液加入到100μL底物溶液(4mMNAD+、200mMCHOONa)中，30℃下孵育10min后，立即用酶标仪测A340的吸光度。其中，酶活单位U记为：在30℃，pH7.0的条件下，每分钟生成1μM NADH所需的酶量为一个酶活单位U。比酶活U/mg：每mg酶蛋白所含的酶活单位。
最适温度测定：分别取四份150μL浓度为25μg/ml的甲酸脱氢酶溶液，分别加入到四份150μL底物溶液(4mMNAD+、200mMCHOONa)中，将四份反应液分别在45℃、50℃、55℃和60℃下反应10min后，立即用酶标仪测A340的吸光度。
热稳定性测定：按照上述酶活测定方法测得初始酶活。然后将该甲酸脱氢酶溶液在60℃孵育90min后，迅速取出，在冰上放置5min后，再按照上述酶活测定方法测定剩余酶活。
标准曲线：配置不同浓度的NADH溶液，并分别测定其在A340的吸光度，制作对应的标准曲线，得到的标准曲线图如图1所示。
具体地，本发明按照上述最适温度测定方法测定野生型甲酸脱氢酶(WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的最适温度。
以野生型甲酸脱氢酶(WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)作为母体，进行以下点突变。并按照上述热稳定性测定方法测定野生型和突变体的初始酶活和剩余酶活，具体数值如表1和表2所示。
表1
表2
由表1和表2可知，本发明突变后的甲酸脱氢酶突变体PP1 PP16的热稳定性均有较大提高，在60℃孵育90min后的剩余酶活基本上达到了野生型的200％。特别是，PP2在60℃孵育90min后的剩余酶活达30.25U，是野生型的243.0％；PP7在60℃孵育90min后的剩余酶活达30.57U，是野生型的245.5％。
将上述突变体进行组合，构建多个组合突变体，对多个组合突变体进行诱导表达并测定组合突变体在30℃的酶活以及在60℃孵育90min后剩余酶活。实验证明在没有A211K、T240S、V294I突变的情况下，S228A、A239Q、R241W不能同时存在。具体正向突变的组合突变体的初始酶活和剩余酶活如表3所示，反向突变的组合突变体的初始酶活和剩余酶活如表4所示。
表3
表4
由表3可知，本发明突变后的甲酸脱氢酶PCP1、PCP2和PCP4的热稳定性在此前突变的基础上又有了明显的提升。具体地，PCP1在60℃孵育90min后的剩余酶活达34.52U，是野生型的277.3％；PCP2在60℃孵育90min后的剩余酶活达35.67U，是野生型的286.5％；PCP4在60℃孵育90min后的剩余酶活达32.93U，是野生型的264.5％。
由表4可知，在没有A211K、T240S、V294I突变的情况下，S228A、A239Q、R241W同时存在时，甲酸脱氢酶突变体的热稳定性甚至会劣于此前的突变。特别是，PCP11在60℃孵育90min后的剩余酶活仅剩14.51U，是野生型的116.5％；PCP13在60℃孵育90min后的剩余酶活仅剩14.31U，是野生型的114.9％；PCP14在60℃孵育90min后的剩余酶活仅剩13.76U，是野生型的110.5％。
综上所述，在没有A211K、T240S、V294I突变的情况下，S228A、A239Q、R241W不同时存在时，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N/A373Q，得到的突变体的热稳定性较为优异，在60℃孵育90min后的剩余酶活基本上能达到野生型的250％。上述突变体参与的NAD+-NADH反应体系可以在较高温度下反应，该反应体系的催化效率可以明显提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通研究人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.热稳定性提升的FDH突变体，其特征在于所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下至少一个氨基酸位点进行取代突变：D29E、Q49E、Y63F、N67R、D81N、V89P、D92E、L119I、Y246V、H264N、I266V、L271I、K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N、A373Q，所述氨基酸位点参照如SEQ IDNO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的热稳定性提升的FDH突变体，其特征在于：所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列至少选自以下突变集进行取代突变：
D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的热稳定性提升的FDH突变体，其特征在于：在没有A211K、T240S、V294I突变，S228A、A239Q、R241W不同时存在时，甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个或多个突变集进行取代突变：
D29E/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、H29R、L36T、T38S、S131A、V137I、A211K、S228A、A239Q、T240S、R241W、D243S、I280L、V294I、R302Q、D364N/A373Q，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的热稳定性提升的FDH突变体，其特征在于：所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自以下一个突变集进行取代突变：
D29E/H29R/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、
D29E/H29R/L36T/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S、
D29E/H29R/Q49E/Y63F/N67R/D81N/V89P/D92E/S131A/L119I/A211K/Y246V/H264N/I266V/L271I/K272S，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型甲酸脱氢酶的氨基酸序列。
5.一种甲酸脱氢酶重组基因，其特征在于能够表达如权利要求1～4任意一项所述的热稳定性提升的FDH突变体的DNA或RNA。
6.一种甲酸脱氢酶重组质粒，其特征在于包括如权利要求5所述的甲酸脱氢酶重组基因。
7.一种甲酸脱氢酶重组细胞，其特征在于包括如权利要求6所述的甲酸脱氢酶重组质粒。
8.根据权利要求7所述的一种甲酸脱氢酶重组细胞，其特征在于底盘细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、芽孢杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、梭菌、链霉菌、葡萄球菌、奈瑟菌、志贺氏菌中的一种。
9.一种辅酶再生系统，其特征在于包括权利要求1～4所述的热稳定性提升的FDH突变体，所述甲酸脱氢酶突变体参与NAD+-NADH反应。
10.根据权利要求9所述的一种辅酶再生系统，其特征在于包括权利要求7所述的甲酸脱氢酶重组细胞，所述甲酸脱氢酶重组细胞参与NAD+-NADH反应。
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