CN103266126A - 一种酶法生产磷酸肌酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶法生产磷酸肌酸的方法。本发明公开了一种周质表达肌酸激酶的基因工程菌的制备方法、利用渗透休克法提取得到高纯度肌酸激酶的方法以及应用获得的酶液生产磷酸肌酸的方法。

Description

一种酶法生产磷酸肌酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域；更具体地，本发明涉及一种周质表达肌酸激酶的基因工程菌的制备方法、利用渗透休克法提取得到高纯度肌酸激酶的方法以及应用获得的酶液生产磷酸肌酸的方法。

背景技术

磷酸肌酸是人体自身存在的一种物质，主要存在于心肌，骨骼肌，脑等器官和组织。它的生理作用主要有：它对能量物质ATP起到缓冲作用，上述器官和组织在生命活动过程中所消耗的大量ATP由它来补充，以避免ATP供应的波动；它是能量物质ATP分子中高能磷酸基团传递的载体，线粒体所生成ATP分子的高能磷酸基团在细胞浆中向耗能部位传递就是以胞浆中的磷酸肌酸为载体，并通过胞浆中磷酸肌酸——肌酸激酶系统来实现的。现今，磷酸肌酸作为药物已在心脏手术和心肌梗塞等疾病的治疗方面得到广泛的应用。

现有技术中，磷酸肌酸的合成方法包括化学合成和酶法合成。化学合成具有反应条件苛刻、激烈、不易控制，生成产物复杂，污染环境等缺点。酶法则是以肌酸和ATP为底物，在肌酸激酶催化下，专一生成磷酸肌酸。反应方程式如下：

中国专利CN2129203.5采用了兔肌肌肉中提取的肌酸激酶，酶法生产磷酸肌酸。此方法大规模生产则具有以下缺点：大量兔肌的来源限制；动物来源的酶带有TSEs(Transmissible Spongiform Encephalopathies，传染性海绵状脑病)的风险。中国专利CN201210301825.8采用以克隆鼠肌来源肌酸激酶的基因工程菌为酶原，反应条件为肌酸浓度10g/L，ATP7.5g/L，酶用量450U/L(相当于15g菌体)，转化率92%。如果以三磷酸腺苷二钠三水盐分子量599和磷酸肌酸二钠盐四水合物分子量327.15来计算，不计纯化损失，每升反应液可得到产物4.1克。此方法的缺点是鼠肌来源的肌酸激酶，其表达量过低，从而反应需要的菌体用量大(每克产物需要3.75g菌体用量)；反应液中的杂蛋白比例高；反应液底物浓度低，因为底物ATP浓度一旦提高就会上升对杂酶的利用率，从而降低得率；反应后磷酸肌酸的纯化难度大等缺点。

因此，本领域迫切需要开发生产效率高、易于纯化的制备磷酸肌酸的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供生产磷酸肌酸的方法。

在本发明的第一方面，提供一种周质表达和纯化肌酸激酶的方法，所述方法包括：

(1)提供一重组表达载体，其包含一表达盒，所述表达盒包含：周质定位信号肽编码序列，肌酸激酶成熟肽编码序列；

(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌细胞；和

(3)培养(2)的重组大肠杆菌细胞，从而表达肌酸激酶；

(4)利用渗透休克法使菌体细胞周质中的肌酸激酶释放到溶液中，收获肌酸激酶。

在一个优选例中，所述的周质定位信号肽选自：E coli PhoA信号肽，E coliOmp T信号肽，E coli MBP信号肽，E coli DsbA信号肽，Morganella morganii phoC信号肽，Legionella pneumophila subsp.Apyrase信号肽，Erwinia carotovora pelB信号肽；较佳地，上述信号肽的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:8-14所示。

在另一优选例中，上述信号肽的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-7所示

在另一优选例中，所述的周质定位信号肽是Legionella pneumophila subsp.Apyrase信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示或如SEQ ID NO:15～22所示，其核苷酸序列编码SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；最佳地，选用SEQ IDNO：20。

在另一优选例中，所述的肌酸激酶编码序列如SEQ ID NO:23所示。

在另一优选例中，所述的表达盒还包括：启动子和终止子。较佳地，所述的启动子是T7启动子。

在另一优选例中，所述表达盒中，肌酸激酶成熟肽编码序列的3’端，包括：翻译终止子序列。

在另一优选例中，步骤(3)中，表达条件为：37±1℃，220±30rpm培养；当OD₆₀₀达到0.6±0.1时加入IPTG诱导，并降温到20±2℃，诱导培养16±3小时，离心收集菌体。

在另一优选例中，步骤(4)中，利用渗透休克法使菌体细胞周质中的肌酸激酶释放到溶液中的方法是：加入高盐溶液，室温缓慢搅拌(较佳地搅拌20±10min；更佳地搅拌20±5min)，离心(较佳地，8000±1000rpm离心10±5min)，取沉淀；沉淀加入预冷的低盐溶液，缓慢搅拌(较佳地搅拌20±10min；更佳地搅拌20±5min)，离心(较佳地，8000±1000rpm离心10±5min)，收集上清溶液，其中含有肌酸激酶；

其中，所述的高盐溶液包括：30±5mM Tris-HCl PH8.0，按照质量比20±4%葡萄糖，1±0.2mM EDTA；低盐溶液包括：5mM±1mM Tris-HCl(较佳地PH8.0)，5mM±1mM MgSO₄。

在本发明的另一方面，提供一种应用权利要求1重组表达和纯化的肌酸激酶生产磷酸肌酸的方法，所述方法包括：以三磷酸腺苷和肌酸为底物，利用权利要求1重组表达和纯化的肌酸激酶为催化剂进行反应，反应初期调节pH9±0.2，1±0.2小时后调节pH10±0.2，再过1±0.2小时后调节pH10.5±0.2，反应总时间3±1小时。

在一个优选例中，底物三磷酸腺苷含量为10-100mM，肌酸含量为20-300mM，肌酸激酶的加入量为500-10000U/L，反应温度25℃-45℃。

在另一优选例中，底物三磷酸腺苷含量为20-80mM(更佳地为40-60mM，最佳地为50mM)，肌酸含量为50-250mM(较佳地为100-240mM；更佳地为150-240mM；最佳地为200mM)，肌酸激酶的加入量1000-9000U/L(更佳地为3000-8000U/L；最佳地为7000U/L)，反应温度30℃-40℃(更佳地37±1℃)。

在另一优选例中，反应体系中还包括：

镁离子，浓度为20-250mM；和/或

甘氨酸，浓度为3-30mM。

在另一优选例中，所述的镁离子浓度为30-200mM；更佳地为40-100mM；最佳地为60mM；和/或

所述的甘氨酸浓度为5-20mM；更佳地为8-15mM；最佳地为10mM。

本发明通过筛选了7条信号肽用于肌酸激酶周质表达；发现嗜肺军团菌Apyrase的信号肽蛋白表达的肌酸激酶的可溶比例和信号肽剪切比例最高。虽然其表达量低，但通过密码子优化后，肌酸的表达量也大幅提高到19mg/g菌体，肌酸激酶酶活达6000U/g菌体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、实施例3中带有信号肽的表达质粒图谱。

图2、实施例3中带有信号肽表达质粒内的转录翻译区的DNA编码。

具体实施方式

在生物技术领域中，尽管以大肠杆菌为宿主的相关克隆、表达技术已非常成熟。但是，异源蛋白的重组表达是一个重要研究课题。为了提高重组蛋白的可溶性和表达量，需大量时间和大量的实验室工作，经多次试验、再试验的努力才能达到最后的成功。

目前，工业化制备肌酸激酶需要克服，如何方便的得到大量肌酸激酶的问题；以及如何简单有效得到高纯度肌酸激酶的问题。直接原核表达，可溶蛋白比例不高，约表达蛋白的10%，酶活也很低。

为了方便地表达和纯化肌酸激酶，本发明人经过了广泛而深入的研究，试验了多种方法，最终发现采用细胞周质表达技术来表达和纯化肌酸激酶，过程便捷，可高效获得高纯度的肌酸激酶。肌酸激酶在细胞质表达，会形成较多的包涵体，可溶的表达量仅10%。但在肌酸激酶基因片段前添加能在大肠杆菌周质定位的信号肽序列，并克隆到不含细胞周质定位信号肽序列的质粒中，即得到表达载体，再将此表达载体转入大肠杆菌，即得到周质表达肌酸激酶的基因工程菌，其可高效地表达肌酸激酶。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为肌酸激酶或其活性片段)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括一下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，所述的“操作性相连”，“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的蛋白(本发明中为肌酸激酶)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码蛋白的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件时操作性相连的。

信号肽和信号肽的筛选

如本文所用，所述的“信号肽”指用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列，其长度一般为15～30个氨基酸残基。本发明中，N端带有信号肽的蛋白被分泌到细胞周质后，其信号肽会被切除。如表达蛋白的分子量大于预期的分子量，那最可能的情况是表达蛋白没有分泌到周质，其信号肽未被剪切，通常会形成包涵体，即使可溶但因未正常折叠而无生物活性。

蛋白信号肽通常具有带正电荷的短小的N端、带有疏水区域的中间段、蛋白酶切位点的带极性的C端。信号肽通常会随着其相应的分泌蛋白一起进化，所以跨物种使用信号肽表达不同的蛋白，其效果具有不确定性。一个合适的信号肽可以使目的蛋白的表达效率成倍提高。

在本发明的研究之初，为了实现蛋白的高效表达，本发明人尝试过诸多的表达方法，包括：

(1)大肠杆菌的碱性磷酸酶的表达：应用T7表达系统，试验结果发现，无信号肽情况下，100%形成包涵体。应用碱性磷酸酶自身原有的信号肽PhoA，形成50%包涵体。

(2)摩氏摩根菌的酸性磷酸酶(EC2.7.1.77)的表达：应用T7表达系统，无信号肽情况下，100%包涵体。原蛋白自带信号肽情况下，90%可溶。

(3)嗜肺军团菌的三磷酸腺苷双磷酸酶apyrase EC3.6.1.5)的表达：应用T7表达系统，无信号肽情况下，>90%包涵体。应用T7表达系统，原蛋白自带信号肽情况下，无法得到带有表达质粒的BL21DE3菌体。pET28质粒中克隆原蛋白自带信号肽基因和原蛋白基因，再转化表达菌体BL21DE3，平板上长不出克隆。但是转化T7Express lysY/Iq Competent E.coli(一种针对有毒基因表达的菌种)，可以挑出克隆。但是菌体生长缓慢，而且诱导后几乎不见表达条带。

(4)牛痘病毒的2’-O-Methyltransferase(EC2.1.1.57)(真核来源)的表达：应用T7表达系统，无信号肽情况下>80%包涵体。应用T7表达系统，pelB信号肽，无法得到带有表达质粒的BL21DE3菌体。但是转化T7Express lysY/IqCompetent E.coli(一种针对有毒基因表达的菌种)，可以挑出克隆。虽然菌体长速正常，但诱导后几乎不见表达条带。

因此，针对肌酸激酶这一特定的蛋白，需要进行信号肽的筛选，来实现肌酸激酶的高效表达。

商业化的带有信号肽序列的质粒如质粒pET12带有大肠杆菌ompT信号肽SEQ ID NO:2或质粒pET22带有胡萝卜软腐欧文氏菌pelB信号肽SEQ ID NO:7，等等；商业化中融合表达系统如质粒pET39中N端融合表达的DsbA蛋白自身带有信号肽序列SEQ ID NO:4或质粒pMAL-p5x中N端融合表达的MBP蛋白自身带有信号肽序列SEQ ID NO:10。

在本发明的具体实施例中，本发明人在肌酸激酶基因序列前分别添加了7条天然的信号肽编码序列，包括上述4条和另外3条：大肠杆菌碱性磷酸酶PhoA信号肽SEQ ID NO:1；摩氏摩根菌Morganella morganii酸性磷酸酶phoC信号肽SEQ ID NO:5；嗜肺军团菌Legionella pneumophila subsp.三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase信号肽SEQ ID NO:6。通过周质分泌表达，比较肌酸激酶表达量、可溶蛋白的比例、及信号肽的剪切率。结果发现，Apyrase信号肽应用于引导肌酸激酶表达，其获得较高比例的可溶性蛋白，且能够高效地被剪切。

密码子优化

本发明人经过深入的研究，针对一些信号肽进行了密码子优化，嗜肺性军团菌的编码Apyrase的信号肽DNA序列SEQ ID NO:6中含有密码子CTA3个，CGA1个，ACG1个，这5个密码子造成肌酸激酶表达效率低，但表达肌酸激酶的可溶性最高，且信号肽的剪切率最高。通过把嗜肺性军团菌的编码Apyrase的信号肽DNA序列进行部分或全部密码子优化(DNA序列中的CTA替换为CTG，CGA替换为CGT，ACG替换为ACT)，用其优化后序列为SEQ ID NO:15～22，作为信号肽序列表达肌酸激酶，筛选具有高表达、高可溶性、高剪切率的信号肽。实验后发现5个密码子全部替换的信号肽SEQ ID NO:15的表达量虽然最大达22mg/g菌体，但可溶性和剪切率不是最佳的。反而是保留4个原有密码子的SEQ ID NO:20的效果最佳，蛋白的表达量为19mg/g菌体，肌酸激酶酶活达6125U/g菌体。

周质表达肌酸激酶的基因工程菌的制备方法

所述的周质表达肌酸激酶的基因工程菌的制备方法如下：

(1)根据Genbank公布的兔肌肌酸激酶基因序列设计引物，通过PCR的方式得到目的基因片段；或通过全基因合成的方式得到目的基因片段；或通过酶切含有这些目的基因片段的序列的方式得到目的基因片段；

(2)把含有兔肌肌酸激酶的基因序列克隆到含有周质定位信号肽序列的表达质粒中；或通过PCR、连接酶连接等手段在兔肌肌酸激酶的基因序列前添加含有周质定位信号肽序列，然后共同克隆到不含有周质定位信号肽序列的表达质粒中。

(3)把得到含有兔肌肌酸激酶的质粒转化到大肠杆菌中，即得到所述的表达兔肌肌酸激酶的基因工程大肠杆菌。

本发明的方法中，对于培养大肠杆菌的培养基没有特别的限制，可以采用本领域常规使用的培养基。较佳地，表达条件为：37±1℃，220±30rpm培养；当OD₆₀₀达到0.6±0.1时加入IPTG诱导，并降温到20±2℃，诱导培养16±3小时，离心收集菌体。

获得的转化体细胞通过优化可达到高密度发酵，菌体湿重可达60g/L以上；通过诱导表达，可得到肌酸激酶的蛋白占菌体总蛋白的20%以上；通过优化表达，可使大于90%的肌酸激酶定位到大肠杆菌细胞周质，表达的肌酸激酶活力可达6125U/g菌体。

肌酸激酶的纯化

大肠杆菌存在于周质的蛋白质种类仅占细胞中蛋白质的4%，所以周质中表达的外源蛋白能有效地被纯化。

作为本发明的优选方式，通过渗透休克法提取的肌酸激酶的纯度可满足磷酸肌酸的生产。其方法是：加入高盐溶液，室温缓慢搅拌20min，8000rpm离心10min，取沉淀；沉淀加入预冷的低盐溶液，缓慢搅拌20min，8000rpm离心10min，收集含有肌酸激酶的上清溶液。

其中，所述的高盐溶液包括：30±5mM Tris-HCl PH8.0，按照质量比20±4%葡萄糖，1±0.2mM EDTA；低盐溶液包括：5mM±1mM Tris-HCl PH8.0,5mM±1mM MgSO₄。

生产磷酸肌酸

酶法生产磷酸肌酸关键之一是得到高纯度高酶活力的肌酸激酶制剂。本发明得到的发酵菌体酶活力达6125U/g，为专利CN201210301825.8表达的鼠源肌酸激酶菌种的200倍，可直接或破膜裂解后用于生产磷酸肌酸。由于菌体中杂酶的干扰，反应液中三磷酸腺苷的浓度一旦超过30mM，副反应使得反应最终磷酸肌酸的得率下降。利用渗透休克法(osmotic shock)释放菌体细胞周质中的肌酸激酶到溶液中，再通过离心，或超滤的方法去除菌体，得到高纯度的肌酸激酶酶液，肌酸激酶活力为500U/ml。肌酸激酶蛋白纯度占总蛋白的70%以上，纯度达90%最佳。用本发明的方法纯化后的酶液生产磷酸肌酸，三磷酸腺苷的底物浓度无法提高的问题就得以解决。

本发明人还对应用所述肌酸激酶酶液生产磷酸肌酸的反应条件进行了优化。所述方法包括：以三磷酸腺苷和肌酸为底物，利用肌酸激酶为催化剂进行反应，反应初期调节pH9±0.2，1±0.2小时后调节pH10±0.2，再过1±0.2小时后调节pH10.5±0.2，反应总时间3±1小时。

反应控制中pH调控是关键。肌酸激酶所催化的反应是一个可逆反应；在pH8.8-9.0，生成磷酸肌酸的正反应速度最快；在6.9-7.0，生成肌酸的逆反应速度最快。所以反应pH应为碱性。想要反应速度快，pH应设定在9.0，但这不是磷酸肌酸得率最高的pH。因为即使溶液pH9.0，逆反应仍然存在，虽然仅为最大逆反应速度的十分之一，但仍会降低反应平衡时磷酸肌酸得率。随着pH从9.0上升到10，正反应速度降低一半，逆反应速度会再降低80%，反应液中磷酸肌酸得率会上升。但反应液pH也不是越高越好，随着pH上升，不但反应速度急剧下降，酶的稳定性也会降低。可能反应还没有到达平衡，酶已经失活了。本发明认为反应pH关系到反应速度和最终的反应得率。所以最优反应pH控制因该是反应初期pH9.0；约第1小时结束时把pH调为10；再过约1小时后调为10.5。

反应过程中三磷酸腺苷是和镁离子相结合的状态被酶利用的，所以镁离子摩尔浓度不应低于三磷酸腺苷的摩尔浓度，确保最大初始反应速度。

酶用量和反应的底物用量，反应时间，反应最终的磷酸肌酸产率相关。较佳地，底物三磷酸腺苷含量为10mM-100mM，肌酸含量为20mM-300mM，镁离子浓度为20mM-250mM，每升反应液中肌酸激酶的加入量为500U-10000U，反应pH控制在8-11之间，反应温度25℃-45℃，反应时间1-6小时。因为肌酸的价格远小于三磷酸腺苷的价格，所以从节约成本考虑，反应中肌酸的摩尔用量应为三磷酸腺苷2-5倍。

优选反应条件如下：底物三磷酸腺苷含量50mM；肌酸含量为200mM；镁离子浓度60mM；酶的添加量7000U/L；反应温度37℃；反应pH控制是反应初期pH9.0，1小时后调为pH10，再过1小时后调为10.5；最佳反应时间为3小时。

采用本发明的构建的表达系统和方法，在简单合成培养基中可实现高密度培养，操作简单、能由大规模发酵设备进行表达，生产成本低廉。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

实施例1、获取兔肌肌酸激酶CK-MM的基因及重组质粒构建

(1)设计引物

根据Genbank中公布的序列设计并合成引物，引物序列如下：

EcoRI

5’-CCGGAATTCATGCCGTTCGGCAACACCC-3’(SEQ ID NO:3)；

5’-CCGCTCGAGCTACTTCTGGGCGGGGATCAT-3’(SEQ ID NO:4)；

XhoI

扩增产物含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

(2)兔肌总RNA抽提

获取兔肌肌肉，用Ambion RNA queous small scale phenol-free total RNAisolation Kit进行抽提，获得兔肌总RNA为模板。

(3)RT-PCR

以兔肌总RNA为模板，TOYOBO公司的ReverTra Ace为反转录酶，合成cDNA。

反应体系：

反应条件：42℃保温1小时。

(4)PCR

以cDNA为模板，PCR反应体系及条件如下：

反应条件：

(5)PCR反应扩增产物的纯化回收

用《天根PCR产物回收试剂盒》回收。

(6)质粒的构建

pET-21a(+)质粒(Novagen)，PCR反应扩增的胶回收产物分别用XhoI和EcoRI双酶切。酶切产物在1.0%琼脂糖电泳后纯化，用胶回收试剂盒纯化(天根)。然后采用T4DNA连接酶在4℃进行间接反应16hr；连接后的反应产物转化宿主菌DH5α(购自天根公司)感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行测序验证，得到含有肌酸激酶CK-MM基因的质粒pET-21-CKMM。

实施例2、构建大肠杆菌胞质表达肌酸激酶基因工程菌

质粒pET-21-CKMM转化宿主菌Jm109DE3(购自Promega)感受态细胞，挑选阳性克隆，并保种。菌种命名为E-ckmm。

实施例3、构建含有信号肽的质粒

全基因合成信号肽DNA序列SEQ ID NO:1～7，并分别亚克隆到pET21a的NdeI和EcoRI之间。质粒图和信号肽的亚克隆区域见图1和图2。

新质粒分别命名为pET21-phoA，pET21-OmpT，pET21-MBP，pET21-DsbA，pET21-phoC，pET21-Apyrase，pET21-pelB。

实施例4、肌酸磷酸周质表达的质粒构建和周质表达肌酸激酶基因工程菌制备

用XhoI和EcoRI双酶切质粒pET-21-CKMM，酶切产物插入到pET21-phoA的相应位点中，在1.0%琼脂糖电泳后纯化，用胶回收试剂盒纯化(天根)。然后采用T4DNA连接酶在4℃进行间接反应16hr；连接后的反应产物转化宿主菌Dh5α(购自天根公司)感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行测序验证，得到含有肌酸激酶CK-MM基因的质粒pET21-phoA-CKMM。

质粒pET21-phoA-CKMM转化宿主菌Jm109DE3(购自Promega)感受态细胞，挑选阳性克隆，并保种。菌种命名为E-phoA-ckmm。

含有其它类型信号肽的菌种制备方式相同，依次命名为E-OmpT-ckmm，E-MBP-ckmm，E-DsbA-ckmm，E-phoC-ckmm，E-Apyrase-ckmm，E-pelB-ckmm。

实施例5、摇瓶表达和SDS-Page分析

培养条件：挑取单克隆菌株接种到含氨苄青霉素(100微克/毫升)的100ml2*YT液体培养基，37℃，220rpm培养。当OD600达到0.6时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导，并降温到20℃，诱导培养16小时，离心收集菌体。

0.3g菌体用3ml的10mM Tris PH8.0溶液悬浮，超声破膜。8000rmp离心分离上清和沉淀。沉淀也用3ml溶液10mM Tris PH8.0悬浮。20ul的蛋白样品(菌体破膜液，可溶上清液和沉淀悬浮液)分别加入25ul4×SDS-loadingbuffer(Fermentas)、5ul20×DTT(Fermentas)、50ul超纯水，最终体积100ul，然后95度加热10分钟。取10ul上12%丙烯酰胺胶，电泳。用Totallab Quant software分析电泳条带，同一块胶上三个浓度不同且已知的BSA条带为对照，对表达的蛋白定量分析，分析不溶、可溶信号肽已剪切、可溶信号肽未剪切蛋白的量。

实施例6、从周质中提取肌酸激酶

取0.6g表达菌体(实施例5中菌体)，加入12ml溶液A(溶液A配方：30mMTris-HCl PH8.0，20%葡萄糖，1mM EDTA)；室温缓慢搅拌20min；8000rpm离心10min，取沉淀；沉淀加入6ml预冷的溶液B(5mM Tris-HCl PH8.0，5mMMgSO₄)缓慢搅拌20min；8000rpm离心10min；取上清即得肌酸激酶酶液。

实施例7、肌酸激酶测活(pH-比色法)

酶活定义：1单位肌酸激酶即在25℃单位分钟内催化1μM的肌酸反应生成相应磷酸肌酸所需的酶量。

测活流程：

1)溶液配制

反应缓冲液

酶液稀释缓冲液

10mM Tris PH8.0，50μg/ml BSA。

2)测活步骤

分光光度计调波长A=597nm；反应温度25℃；

在比色皿中加入以下25℃保温的溶液：

反应缓冲液     700μl

去离子水       300μl

稀释的酶液     5μl

混匀后立即监测597nm处光吸收的变化，每60秒读一次吸光度值(A_597nm)，共读取5～6个数据点，求出每min吸光度值的变化。

3)计算

酶活计算如下：

U=(1.3×1.005×ΔA_597max×df)/0.005；

注：1.3为吸光度的变化换算成H+的系数；1.005为反应体积；df为酶液的稀释倍数；0.005为反应时加入的酶量；酶活的单位是U/ml。

4)酶活等测定结果

在肌酸激酶基因序列前分别添加了7条天然的信号肽编码序列，包括：大肠杆菌碱性磷酸酶PhoA信号肽SEQ ID NO:1；摩氏摩根菌Morganella morganii酸性磷酸酶phoC信号肽SEQ ID NO:5；嗜肺军团菌Legionella pneumophilasubsp.三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase信号肽SEQ ID NO:6；大肠杆菌ompT信号肽SEQ ID NO:2，胡萝卜软腐欧文氏菌pelB信号肽SEQ ID NO:7；DsbA蛋白自身带有信号肽序列SEQ ID NO:4，MBP蛋白自身带有信号肽序列SEQ IDNO:10，比较肌酸激酶表达量、可溶蛋白的比例、及信号肽的剪切率。结果如表1。

表1

实施例8、密码子优化后的信号肽序列应用于肌酸激酶的表达

利用与前述相似的构建和表达方法，将Apyrase信号肽SEQ ID NO:6经密码子优化后获得SEQ ID NO:15～22序列，将之应用于蛋白表达，比较肌酸激酶表达量、可溶蛋白的比例及信号肽的剪切率。结果如表2。

表2

实施例9、用肌酸激酶酶液生产磷酸肌酸

采用SEQ ID NO:20的序列为信号肽序列表达的菌体，用实施例6的方法纯化得到肌酸激酶酶液，其酶活力为600U/ml。

400ml溶液含有甘氨酸10mM，三磷酸腺苷50mM；肌酸200mM；镁离子60mM；肌酸激酶酶液4.6ml；反应温度37℃；反应pH控制是反应初期pH9.0，1小时后调为pH10，再过1小时后调为10.5；反应时间为3小时。

反应结束后，HPLC定量(磷酸肌酸二钠盐四水合物为标准品)得磷酸肌酸5.8g，相对于ATP的摩尔得率为88.6%。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种周质表达和纯化肌酸激酶的方法，其特征在于，所述方法包括： 

(1)提供一重组表达载体，其包含一表达盒，所述表达盒包含：周质定位信号肽编码序列，肌酸激酶成熟肽编码序列； 

(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌细胞；和 

(3)培养(2)的重组大肠杆菌细胞，从而表达肌酸激酶； 

(4)利用渗透休克法使菌体细胞周质中的肌酸激酶释放到溶液中，收获肌酸激酶。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的周质定位信号肽选自：E coli PhoA信号肽，E coli Omp T信号肽，E coli MBP信号肽，E coli DsbA信号肽，Morganella morganii phoC信号肽，Legionella pneumophila subsp.Apyrase信号肽，Erwinia carotovora pelB信号肽；较佳地，上述信号肽的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:8-14所示；更佳地，上述信号肽的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-7所示。 

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的周质定位信号肽是Legionella pneumophila subsp.Apyrase信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示或如SEQ ID NO:15～22所示；最佳地，选用SEQ ID NO：20。 

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肌酸激酶编码序列如SEQ ID NO:23所示。 

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，表达条件为：37±1℃，220±30rpm培养；当OD₆₀₀达到0.6±0.1时加入IPTG诱导，并降温到20±2℃，诱导培养16±3小时，离心收集菌体。 

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，利用渗透休克法使菌体细胞周质中的肌酸激酶释放到溶液中的方法是：加入高盐溶液，室温缓慢搅拌，离心，取沉淀；沉淀加入预冷的低盐溶液，缓慢搅拌，离心，收集上清 溶液，其中含有肌酸激酶； 

其中，所述的高盐溶液包括：30±5mM Tris-HCl PH8.0，按照质量比20±4%葡萄糖，1±0.2mM EDTA；低盐溶液包括：5mM±1mM Tris-HCl PH8.0，5mM±1mM MgSO₄。 

7.一种应用权利要求1重组表达和纯化的肌酸激酶生产磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述方法包括： 

以三磷酸腺苷和肌酸为底物，利用权利要求1重组表达和纯化的肌酸激酶为催化剂进行反应，反应初期调节pH9±0.2，1±0.2小时后调节pH10±0.2，再过1±0.2小时后调节pH10.5±0.2，反应总时间3±1小时。 

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，底物三磷酸腺苷含量为10-100mM，肌酸含量为20-300mM，肌酸激酶的加入量为500-10000U/L，反应温度25℃-45℃。 

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，底物三磷酸腺苷含量为20-80mM，肌酸含量为50-250mM，肌酸激酶的加入量1000-9000U/L，反应温度30℃-40℃。 

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，反应体系中还包括： 

镁离子，浓度为20-250mM；和/或 

甘氨酸，浓度为3-30mM。 

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